Химерные вакцинные антигены против вируса классической чумы свиней

Химерные вакцинные антигены против вируса классической чумы свиней

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к ветеринарии, в частности к новым химерным антигенам, включающим вирусные субъединицы вируса классической чумы свиней (ВКЧС), соединенные с белками, способными стимулировать клеточную и гуморальную иммунную систему, вызывая сильный и ранний иммунный ответ на такие вирусы у свиней.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полагают, что классическая чума свиней (КЧС), также известная как холера свиней за свой высокоинфекционный характер, является наиболее важным заболеванием у свиней, и она включена в официальный перечень заболеваний Всемирной ветеринарной организации. Этиологическим агентом этого заболевания, КЧС, является вирус рода Pestvirus из семейства Flaviviridae. Известно, что этот вирус имеет липидную оболочку, диаметр от 40 до 60 нм и гексагональную симметрию, с одноцепочечной рибонуклеиновой кислотой (РНК) в качестве генетического материала (Kummerer et al. (2000). The genetic basis of cytopathogenicity of pestviruses. Vet. Microbiol. 77:117-128; Moenning et al. (2003)).

КЧС представляет собой высококонтагиозное заболевание, в своей острой форме представленное лихорадкой, разрушением капиллярных сосудов, некрозом внутренних органов и смертью. Первые клинические симптомы появляются после инкубационного периода длительностью от 2 до 6 дней, вызывая гипертермию, снижение подвижности и потерю аппетита, с ухудшением в последующие дни, и температура может достигать 42°С. Также развивается лейкопения с количествами белых кровяных клеток в крови менее 8000/мм³. У свиней также развиваются конъюнктивиты, запоры с последующей диареей, рвота, потеря координации движений, судороги и парезы мышц в терминальной фазе. Это проявляется красным цветом кожи, распространяющимся по всему брюху, морде, ушам и внутренней части конечностей. В большинстве фатальных случаев при гистопатологическом исследовании мозга выявляется негнойный энцефалит с высокой васкуляризацией (Moenning et al. (2002) Clinical Signs and Epidemiology of Classical Swine Fever. A review of knowledge. Vet. Journal 161:1-10).

ВКЧС действует как иммуносупрессор во время протекания инфекции (Susa et al. (1992) Pathogenesis of Classical Swine Fever: B-lymphocyte deficiemcy caused by Hog Cholera virus. J. Virol. 66:1171-1175), и обнаружение нейтрализующих антител начинается на 2 и 3 неделе после инфицирования (Laevents et al. (1998)) An experimental infection with a classical swine fever virus introduction in natural outbreaks. Vet. Q. 20: 46-49). Терминальная стадия инфекции ассоциирована со значительным снижением уровня В-лимфоцитов в циркулирующей крови так же, как и в лимфоидной ткани (Susa et al. (1992) Pathogenesis of Classical Swine Fever: B-lymphocyte deficiency caused hog cholera virus. J. Virol. 66: 1171-1175). Большинство свиней, которые заболели, умирали в интервале времени от 10-го до 20-го дня после инфицирования, с уровнем смертности более 95%. Особенностью поражений при КЧС на аутопсии являлся геморрагический диатез с петехиями в большинстве систем органов. Наиболее постоянно эти изменения встречаются в почках, мочевом пузыре и лимфатических ганглиях, хотя они могут появляться также в селезенке, гортани, на слизистых и серозных оболочках (Mouwen et al. (1983) Atlas of Veterinary Pathology, Bunge, Utrecht The Netherlands).

Трансплацентарное инфицирование представляет собой другую клиническую форму КЧС; в этом случае вирус способен проникать через плаценту беременных свиноматок, инфицируя плоды. Последствиями этого инфицирования может являться выкидыш, рождение мертвого потомства, мумификации, мальформации, рождение слабых свиней и проблемы, связанные с дифференцировкой органов. В зависимости от срока беременности, на котором произошло инфицирование, в результате заражения от свиноматок (вертикальной передачи) может рождаться обладающее иммунитетом потомство. Поросята остаются инфицированными и виремическими до смерти, создавая стабильный очаг распространения ВКЧС в стаде (Moenning et al., (2003) Clinical Signs and Epidemiology of Classical Swine Fever: a rewiew of new knowledge. Vet. Journal 165: 11-20). Смертность, ассоциированная с КЧС, представляет собой экономическую проблему для затронутых ею стран, негативно влияющую на экономическую и социальную ситуацию развивающихся государств. По этой причине в странах, имеющих высокую плотность свиней и большое распространение вируса, становится необходимостью применение контролирующих программ, основанных на вакцинации. В высокоразвитых странах, в которых разведение свиней в основном субсидируется правительствами, таких как Европа, Соединенные Штаты и Канада, применяется способ эрадикации посредством полного санитарного убоя. Однако стоимость такого способа является очень высокой, и такие страны являются все еще чувствительными к возможным эпизоотиям.

Европейский Союз (ЕС) рассматривается как высокая зона риска повторных экстренных случаев новых ВКЧС-эпизоотий вследствие высокой плотности популяции свиней, своей политикой невакцинирования и своей географической близостью к восточно-европейским странам, в которых ВКЧС является энзоотическим заболеванием. Одной из проблем, связанной с угрозой возникновения новых эпизоотий в этом регионе, является наличие диких кабанов с эндемическим инфицированием КЧС (Laddomada (2000) Incidence and control of CSF in wild boars in Europe. Vet. Microb, 73:(121-30)). Эти появления новых эпизоотий происходили вопреки жестким программам контроля, которые были реализованы в Европейском Союзе, которые включали санитарное уничтожение всей контагиозной популяции и ограничение экспорта свинины из пораженных районов в районы, свободные от заболевания (van Oirschot (2003) Vaccinology of Classical Swine Fever: from lab to field. Vet Microbiol, 96:367-384). Таким образом, неотложной является потребность в разработке вакцин, которые вызывают иммунный ответ, ранний и надежный, гарантирующий защиту от инфицирования и передачи вируса.

Были разработаны вакцины против ВКЧС на основе интактного вируса: вакцины с вирусом, инактивированным кристаллическим фиолетовым или формалином (Biront et al. (1998) Classical swine fever related infections. Liess B.M. Ed. Martinus Nijhoff Publishing, Boston: 181-200), вакцины с вирусом, аттенуированным посредством пассирования в кролике, например штамма Sinlak (Baibikov et al. RU 2182495) и штамма Lapinizied Chinese (Dahle et al. (1995) Assessment of safety and protective value of a cell culture modified strain C vaccine of hog cholera/classical swine fever virus. Berl-Munch. Tieraztl.Wsch, 108:20-25), или вакцины с вирусом, аттенуированным в культурах тканей, полученных из кролика, морской свинки и свиньи (Kachiku et al. JP 73001484; Terpstra et al. (1990) Development and properties of a cell culture produced for hog cholera based on Chinese strain. Ditsh. Tierarztl.Wsch. 97: 77-79). Применение этих типов вакцин представляют собой риск вследствие вероятности содержания фракций активного вируса, который, привитый восприимчивым животным, будет вызывать новые вспышки КЧС. Кроме того, в некоторых случаях для получения защитного иммунологического ответа необходимы повторяющиеся иммунизации, поскольку инактивация влияет на иммуногенетические свойства вируса.

В отдельных случаях применения живой вакцины с аттенуированной вирулентностью, они имеют высокий риск того, что произойдет частичная аттенуация или восстановление вирулентности. В некоторых случаях они будут формировать патогенные вирусные частицы, которые, будучи введенными восприимчивым животным, сделают возможным инфицирование, клиническое заболевание и распространение КЧС в стадах. Эти проблемы обуславливают еще больший риск для беременных свиноматок, поскольку вирус может инфицировать плоды, которые являются высоковосприимчивыми, и инфицированное потомство будет распространять заболевание.

Существуют вакцины на основе штаммов ВКЧС, которые были аттенуированы, такие как штамм C Chinese, штамм PAV 250, штамм Thierval и штамм IFFA/A-49 (Björlund, H.JV. et al. (1998) Molecular characterization of the 3'noncoding region of classical swine fever virus vaccine strains. Virus Genes 16: 307-312, Launais et al. (1978) Hog Cholera Virus: Active immunization of piglets with the Thiverval strain in the presence and absence of calostral passive immunity. Vet. Microbiology 3:31-43). Эти штаммы применяются только в странах, где заболевание является энзоотическим, поскольку они имеют такое неудобство, что они не позволяют отличить вакцинированное животное и животное, инфицированное нативным вирусом. Животные, вакцинированные этими штаммами, показывают такие же ответы в серологических тестах, как и инфицированные животные. Специфические антитела анти-ВКЧС, которые вырабатываются при применении вакцин на основе аттенуированного вируса, мешают диагностике инфицирования КЧС. Диагностика осуществляется посредством иммунологического определения инфицирующего вируса в небных миндалинах и размножения вакцинного вирусного штамма, происходящего в небных миндалинах. По этой причине аттенуированные штаммы являются непригодными для применения в программах эрадикации. Вакцинация штаммом LK-VNIIVVM и дополнительная гипериммунизация очищенным штаммом Shi-Myng, составленным с адъювантом Фрейнда, является другим примером. Но иммунизация в 40-45 местах является невозможной при кампании вакцинации, в которой сотни животных должны быть вакцинированы ежедневно (Balashova et al. RU2183972).

Иммунизация этими вакцинами, содержащими целый вирус, препятствует также дифференциальной диагностике инфекций, вызванных ВКЧС, и инфекций, вызванных другими членами рода Pestvirus, которые могут инфицировать свиней, такими как вирус вирусной диареи коров (сокращенно ВВДК) и вирус пограничной болезни овец (сокращенно ВПБО), (Dahle et al. (1991) Clinical Post Mortem and Virologocal Findings after Simultaneous Inoculation of Pig with Hog Cholera and BVD Virus. J. Med. Vet. 38: 764-772).

Для избежания неудобств вакцин на основе целого вируса получены пригодные для применения вакцины, полностью безопасные, такие как варианты на основе субъединиц или вирусных белков, полученных рекомбинантным путем. Эти варианты должны защищать стада от повторного внедрения штаммов вируса, а также позволяют различать вакцинированных и инфицированных животных простыми серологическими способами. С этой целью были разработаны вакцины на основе вирусных субъединиц. Вакцины, содержащие вирусные белки, такие как гликопротеин Е2 оболочки вируса (Bourna et al. (2000) Duration of the onset of the herd immunity induced by E2 subunit vaccine classical Swine Fever virus 18: 1374-1381), являются безопасными, поскольку их применение не содержит риска возврата вирулентности и не препятствует диагностике. Эти вакцины позволяют дифференцировать инфицированных животных и вакцинированных животных, поскольку антитела, которые вырабатываются, реагируют только против вирусного сегмента. Таким образом, они целесообразны для программы эрадикации КЧС.

Были разработаны несколько рекомбинантных вакцин на основе экспрессии белка Е2 в прокариотах, и вакцины на основе синтетических пептидов этого белка (Chen et al. WO 200232453). В этих случаях белок является негликозилированным, так что страдают его иммуногенность и защитные свойства. Другие варианты вакцин используют вирусные векторы для экспрессии гетерологичного гена Е2 в эукариотических клетках подобно вирусу псевдобешенства свиней (Peeterrs et al. (1997). Biologically safe, non-transmissible pseudorabies virus vector vaccine protect pigs against both Aujeszky's disease and classical swine fever. J. Gen. Virol. 78: 3311-3315), вирусу натуральной оспы свиней (Gibbs et al. US62117882) и аденовирусу свиней (Nagy et al. WO 200183737). В этих случаях инфицирование вирусом дикого типа вызывает выработку нейтрализующих антител против вирусного вектора такого же серотипа. Таким образом, страдает вызывание иммунного ответа против ВКЧС. Также вирусные векторы на основе вируса псевдобешенства свиней и вируса натуральной оспы свиней не могут применяться в странах, признанными свободными от этих вирусов, вследствие проблем законодательства. Также был применен в качестве вектора вирус осповакцины, но постановления Всемирной организации здравоохранения затрудняют его применение (Meyeers et al. EP 1087014).

Вакцины на основе лишенной оболочки дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) для экспрессии белка Е2 в миоцитах и остеоцитах имеют неудобство, связанное с тем, что для того, чтобы вызвать иммунный ответ, требуются более высокие концентрации ДНК, поскольку трансфекция с применением лишенной оболочки ДНК является очень неэффективной. Эта вакцина подвергается строгому законодательному контролю, который затрудняет ее применение (Audonnet et al. WO 20152888).

Получение Е2-ВКЧС в качестве антигена в экспрессионных системах клеток насекомых, опосредованное бакуловирусом, стало возможной альтернативой (Van-Rjin et al. (1990). An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on enveloped glycoprotein E2 of classical swine fever virus. Vaccine, 17: 433-440; Kretzdom et al. US 20040028701). В этой системе рекомбинантный Е2 получают в виде гликопротеина, повышая иммуногенность относительно негликозилированной изоформы. Бакуловирус дополнительно инактивируется, не оказывая патогенных эффектов на свиней. Однако эффективная защита против инфицирования возникает через три недели после вакцинации, и защита против внутриматочного инфицирования является неполной. Следовательно, важной проблемой в предотвращении ВЧС является отсутствие рекомбинантных вакцин на основе субъединиц, делающих возможной проведение дифференциальной диагностики между вакцинированными и инфицированными животными, и способных к формированию ранней защиты после вакцинации, ликвидируя трансплацентарную передачу от беременных свиноматок своему потомству.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение решает вышеописанную проблему. Новая вакцина содержит химерные антигены, содержащие вирусные субъединицы в комбинации с молекулами, стимулирующими иммунную систему, которые делают возможным развитие раннего иммунного ответа, который защищает свиней от инфицирования ВКЧС. Другим преимуществом предложенного решения является то, что оно прекращает передачу вируса от инфицированных беременных свиноматок потомству вследствие эффекта активации иммунитета стимулирующими молекулами, которые объединены с вирусными белками в химерных антигенах.

В частности, изобретение относится к химерным антигенам против КЧС, которые имеют в качестве главного компонента гликопротеин Е2 из оболочки ВКЧС. Внеклеточный сегмент гликопротеина Е2 применяется в качестве иммуногена, объединенного с белком, стимулирующим иммунную систему (называемым в контексте данного изобретения «молекулярный адъювант»), для усиления и стимуляции раннего клеточного иммунного ответа, и вызывания выработки более высоких титров нейтрализующих антител к ВКЧС.

В конкретном варианте осуществления изобретения белок, стимулирующий иммунную систему, представляет собой интерферон альфа или внеклеточный сегмент молекулы CD154. В предпочтительном варианте осуществления интерферон альфа или внеклеточный сегмент молекулы CD154 может быть получен из любого млекопитающего.

Вакцинные антигены настоящего изобретения на основе химерных белков гарантируют защиту вакцинированных свиней с первой недели после иммунизации, когда производится их контрольное заражение 10⁵ DL₅₀ (доза вируса, которая вызывает смерть 50% животных, инфицированных ВКЧС). Такая защита опосредуется сильным клеточным иммунным ответом против ВКЧС, который непосредственно связан с комбинацией элементов, которые сочетаются в химерном антигене. Также наблюдается уменьшение времени индукции нейтрализующих антител, которые появлялись на второй неделе, следующей после вакцинации. Это способствует повышению защиты против ВКЧС вакцинированных свиней. Иммунизированные животные не имеют симптомов клинического заболевания, и выделения ВКЧС из биологических жидкостей не могло быть получено ни в один день после контрольного заражения таким вирусом.

Химерные антигены с молекулярным адъювантом Е2 предотвращают вертикальную передачу ВКЧС от свиноматок к плодам. Эти белки вызывают раннюю защиту у беременных свиноматок, которая задерживает развитие клинического заболевания и делает невозможным размножение вируса, не только у матерей, но также и у плодов, после контрольного заражения 10⁵ DL₅₀ ВКЧС.

В предпочтительном варианте осуществления химерный вакцинный антиген характеризуется содержанием главным образом аминокислотной последовательности внеклеточного сегмента (или домена) гликопротеина Е2 ВКЧС, который представлен в Списке последовательностей как SEQ ID NO: 1; и внеклеточного сегмента молекулы CD154 свиней, который представлен как SEQ ID NO: 2. Химерный вакцинный антиген фактически содержит такие аминокислотные последовательности, но он может также включать в себя внеклеточный сегмент Е2 любого изолированного ВКЧС.

Другим аспектом настоящего изобретения является то, что химерный вакцинный антиген может быть получен рекомбинантным синтетическим путем или посредством химической конъюгации. В конкретном варианте осуществления изобретения вариант на основе химерного белка, содержащего Е2his (внеклеточный сегмент Е2, слитый с хвостом 6 гистидинов), и молекулярного адъюванта был получен в виде слитого белка. С этой целью спейсерный пептид, состоящий из 4 повторяющихся единиц Gly₄Ser (4G₄S), и молекула, стимулирующая иммунную систему, были добавлены на С-конец Е2his. Включение в состав пептида 4G₄S допускает определенную степень релаксации полипептидной цепи. Это гарантирует правильную третичную структурную укладку структуры белка для получения слитых белков с такой же третичной структурой, как и нативная. Один из вакцинных антигенов, объект изобретения, имеет внеклеточный домен молекулы CD154 свиней, слитый с его С-концом, в качестве молекулярного адъюванта (Е2his-СD154).

До настоящего времени не было изучено получение рекомбинантных вакцин-кандидатов против ВКЧС, опосредованное экспрессионными системами животных в качестве биореакторов. Несмотря на это, способность грудной железы экспрессировать гликозилированные рекомбинантные белки с правильной укладкой их третичной структуры, делает ее адекватной экспрессионной системой для получения гликопротеина Е2 с высокой иммуногенностью и защитными свойствами. Временная экспрессионная система в грудной железе жвачного животного, опосредованная аденовирусными векторами, представляет собой средство для получения высоких уровней экспрессии рекомбинантных белков быстрым и простым путем (Toledo et al., WO 2004/034780). Этот способ является очень полезным для получения рекомбинантного Е2 для целей применения в программах вакцинации, направленных на эрадикацию КЧС.

В одном варианте осуществления изобретения вакцинные антигены, объект настоящего изобретения, экспрессируются в эпителиальных клетках молочной железы генетически модифицированных млекопитающих во время процесса лактации и секретируются в молоко. Рекомбинантные химерные молекулы получают в молоке трансгенных млекопитающих или посредством прямой трансформации эпителия молочных желез нетрансгенных млекопитающих с применением аденовирусных векторов. В другом варианте осуществления изобретения химерные вакцинные антигены получают в генетически модифицированных дрожжевых клетках. Такие антигены вырабатываются в культуральной среде дрожжей, трансформированных с применением химерного гена и регуляторных последовательностей, делающих возможными экспрессию и секрецию рекомбинантного белка в культуральную среду.

Белок Е2 нативного ВКЧС экспонируется на вирусной оболочке в виде гомодимера, стабилизированного при помощи межцепочечных дисульфидных связей. Это определяет то, что нейтрализация и защитные антитела вырабатываются против конформационных эпитопов, представленных на гомодимерах. Вакцинные антигены, разработанные в настоящем изобретении, получают в экспрессионных системах, которые делают возможным правильное свертывание этих рекомбинантных белков. Конфигурация генетических конструкций гарантирует отсутствие изменений третичной структуры слитых белков. Рекомбинантные вакцинные антигены легко очищают с применением простой процедуры аффинной хроматографии на ионах металлов.

Конфигурация генетических конструкций, применение экспрессионных систем и относительная простота процедуры очистки гарантирует, что вакцинные антигены против ВКЧС, описанные в настоящем изобретении, имеют такие же, как у вирусного белка Е2, антигенные и иммуногенетические свойства. Иммунизация химерными молекулами, полученными в таких экспрессионных системах, как Pichia pastoris или молочная железа козы, приводит к сильному и раннему иммунному ответу. Внеклеточный домен Е2 образует гомодимеры, которые обеспечивают конформационные эпитопы для образования нейтрализующих и защитных антител. Сегмент из CD154 действует в качестве молекулярного адъюванта, который стимулирует иммунную систему вакцинированных свиней, вызывает клеточный иммунный ответ, который защищает животных от ВКЧС с первой следующей после вакцинации недели. Комбинация обеих молекул в химерном белке, который содержит спейсерный пептид, гарантирует правильное свертывание каждой молекулы. Примененные экспрессионные системы позволили экспрессировать рекомбинантные белки в гликозилированной изоформе. Это также помогает получать молекулы с правильной третичной структурой.

Другим аспектом настоящего изобретения являются вакцинные композиции со способностью вызывать защищающий иммунный ответ против ВКЧС, которые характеризуются содержанием химерных антигенов, описанных ранее, содержащих внеклеточный домен гликопротеина Е2 и молекулярный адъювант. Такие вакцинные композиции могут вводиться животным системным путем или через слизистые оболочки для предотвращения КЧС и избежания материальных и экономических потерь, которые вызывает инфицирование ВКЧС свиных стад.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. Анализ с помощью SDS-электрофореза в ПААГ, в восстанавливающих условиях экспрессии Е2his в клетках РК-15, трансдукцированными аденовирусными векторами Ad-E2his-sec. (А) SDS-электрофорез в ПААГ, дорожка 1: культуральная среда от трансдуцированных клеток, дорожка 2: культуральная среда от необработанных клеток, MWM: маркер молекулярной массы. (В) Иммуноидентификация Е2his при помощи иммуноблоттинга с применением моноклональных антител, направленных на гистидиновый хвост, дорожка 1: культуральная среда трансдуцированных клеток, дорожка 2: культуральная среда от необработанных клеток, дорожка 3: положительный контроль для гистидинового хвоста, MWM: маркер молекулярной массы. (С) Иммуноидентификация Е2his при помощи иммуноблоттинга с применением поликлональной сыворотки, полученной из инфицированных ВКЧС свиней, дорожка 1: культуральная среда от необработанных клеток, дорожка 2: культуральная среда от трансдуцированных Ad-E2his клеток, MWM: маркер молекулярной массы.

Фиг.2. Анализ условий экспрессии Е2his и E2his-CD154 в клетках РК-15, трансдукцированных аденовирусными векторами Ad-E2his-sec и Ad-E2hisCD154-sec. Белки в культуральной среде сепарируют с применением SDS-электрофореза в ПААГ в невосстанавливающих условиях. Иммуноидентификация интересующих молекул осуществлялась при помощи иммуноблоттинга с применением моноклональных антител (Mab) против белка Е2 ВКЧС (Mab-1G6). Дорожка 1: культуральная среда от трансдуцированных вектором Ad-E2his-sec клеток, дорожка 2: культуральная среда от трансдуцированных вектором Ad-E2hisCD154-sec клеток, MWM: маркер молекулярной массы.

Фиг.3. Кинетика экспрессии Е2his в молоко коз, трансдукцированных вектором Ad-E2his-sec. Белки из образцов молочной сыворотки, соответствующих каждому дню доения, разделяют с применением SDS-электрофореза в ПААГ в невосстанавливающих условиях. Иммуноидентификация интересующих молекул исследовалась при помощи иммуноблоттинга с применением Mab-1G6. Дорожка РК: положительный контроль Е2his, экспрессированного в культуральную среду клеток РК-15, трансдукцированных вектором Ad-E2his-sec, дорожка С-: образцы молочной сыворотки от коз, не подвергавшихся обработке, дорожки 1-8: образцы молочной сыворотки от коз, трансдукцированных вектором Ad-E2his-sec, соответствующие каждому из 8 дней доения, следующих за аденовирусной трансдукцией.

Фиг.4. Кинетика экспрессии Е2his-CD154 в молоко коз, трансдукцированных вектором Ad-E2hisCD154-sec. Белки из образцов молочной сыворотки, соответствующих каждому дню доения, разделяют с применением SDS-электрофореза в ПААГ в невосстанавливающих условиях. Иммуноидентификация интересующих молекул исследовалась при помощи иммуноблоттинга с применением Mab-1G6. Дорожки 1-5: образцы молочной сыворотки от коз, трансдукцированных вектором Ad-E2hisCD154-sec, соответствующие каждому из 5 дней доения, следующих за аденовирусной трансдукцией, дорожка С-: образцы молочной сыворотки от коз, не подвергавшихся обработке, дорожка РК: положительный контроль Е2his-CD154, экспрессированного в культуральную среду клеток РК-15, трансдукцированных вектором Ad-E2hisCD154-sec.

Фиг.5. Анализ чистоты и идентификация Е2his, подвергнутого SDS-электрофорезу в ПААГ в невосстанавливающих условиях. Белок экспрессировался в молоко коз, трансдукцированных вектором Ad-E2his-sec, и очистка осуществлялась при помощи аффинной хроматографии с ионами металлов. (А) SDS-электрофорез в ПААГ различных стадий очистки. (В) Иммуноидентификация при помощи иммуноблоттинга с применением Mab-1G6. Дорожка 1: положительный контроль Е2his, экспрессированного в культуральную среду клеток РК-15, трансдукцированных вектором Ad-E2his-sec, дорожка 2: образцы молочной сыворотки от коз, не подвергавшихся обработке, дорожка 3: образцы молочной сыворотки от коз, трансдукцированных вектором Ad-E2his-sec, взятые в качестве исходного материала для хроматографии, дорожка 4: материал, не связавшийся с матриксом, дорожка 5: промывание 20 мМ имидазолом, дорожка 6: промывание 50 мМ имидазолом, дорожка 7: элюция 200 мМ имидазолом.

Фиг.6. Сравнение антигенного распознавания двух изоформ вакцинного антигена E2his антителами, присутствующими в сыворотке свиней, инфицированных вирулентным штаммом ВКЧС. E2his, очищенный из молока коз, трасформированных аденовирусным вектором Ad-E2his-sec, исследовали при помощи электрофореза и иммуноблоттинга в восстанавливающих условиях (мономер) и в невосстанавливающих условиях (гомодимер). (А) SDS-электрофорез в ПААГ. (В) иммуноблоттинг с применением поликлональной сыворотки от инфицированных КЧС свиней, дорожка 1: E2his, подвергнутый электрофорезу в невосстанавливающих условиях, дорожка 2: E2his, повергнутый электрофорезу в восстанавливающих условиях.

Фиг.7. Кинетика нейтрализующих антител, полученных в двух группах свиней, вакцинированных одной дозой вакцинного антигена E2his, титры антител определялись при помощи теста на нейтрализацию, основанного на пероксидазе. Группа А была привита дозой 30 мкг на каждое животное и группа В - дозой 50 мкг на каждое животное. Обе группы подвергали контрольному заражению через три недели после вакцинации дозой вируса ВКЧС 10⁵ DL₅₀. Результаты показаны в виде среднего геометрического соответствующих титров.

Фиг.8. Лимфопролиферативный анализ с применением лимфоцитов, выделенных от свиней на 5 день после вакцинации, с антигенами Е2-CD154 (группы D и Е) и Е2his (группа F). Результаты выражены в виде индекса стимуляции (SI), определенного как отношение между значениями счета в минуту (cpm) стимулированной культуры и уровнями cpm контрольной культуры, не подвергавшейся стимуляции. Лимфопролиферативный ответ, для которого определялось SI≥2, рассматривался как положительный. Была оценена пролиферация в культурах, обработанных ВКЧС так же, как и ингибирование пролиферации в культурах, обработанных ВКЧС и Mab против домена CD4 свиней.

Фиг.9. Исследование антивирусной активности клеток РК-15 с применением сыворотки, полученной от свиней, вакцинированных антигенами Е2-CD154 (группы D и Е) и Е2his (группа F). Результаты выражены в виде среднего геометрического соответствующих титров.

Фиг.10. Кинетика нейтрализующих антител, полученных в двух группах свиней, вакцинированных антигенами Е2-CD154 (группа Н) и Е2his (группа I), с применением дозы, равной 50 мкг на животное. Титры антител определялись посредством теста на нейтрализацию на основе пероксидазы. Результаты показаны в виде среднего геометрического соответствующих титров.

Фиг.11. Анализ условий экспрессии E2his и E2his-CD154 в клетках GMGE, трансдуцированных лентивирусными векторами Lv-E2his и Lv-E2his-CD154. Белки в культуральной среде разделяли методом SDS-электрофореза в ПААГ в невосстанавливающих 4 условиях. Иммуноидентификацию интересующих молекул проводили вестерн-блот анализом, используя Mab против E2 ВКЧС (αE2-1G6). Дорожка 1: культуральная среда из клеток, трансдуцированных вектором E2his-CD154; дорожка 2: культуральная среда из клеток, трансдуцированных вектором E2his; дорожка 3: культуральная среда из необработанных клеток; дорожка 4: положительный контроль, E2his, экспрессированные в культуральной среде клеток РК-15, трансдуцированных вектором Ad-E2his-sec.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Амплификация участков гена, кодирующих внеклеточные домены ВКЧС E2 и CD154 свиней и клонирование плазмиды pMOS-E2his-CD154

Участок гена, кодирующий внеклеточный домен Е2 из 363 аминокислот, амплифицируют обратной транскрипцией и полимеразной цепной реакцией (RT-PCR) с вирусного генома кубинского варианта ВКЧС, штамма «Маргарита», номер доступа AJ704817 в базе данных Национального Центра Биотехнологической Информации (National Center for Biotechnology Information, NCBI). В 3'-олигонуклеотид включают последовательность, кодирующую «хвост» из 6 остатков гистидина, для обеспечения возможности легкой очистки антигена.

Кодирующую последовательность для внеклеточного домена CD154 свиньи из 210 аминокислот получают химическим синтезом с применением в качестве образца гена CD154 свиньи Sus scrofa (номер доступа NCBI AB040443). В 5'-конец кодирующей последовательности этой молекулы включают участок, кодирующий пептид из четырех повторяющихся единиц Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (4G₄S). При субклонировании в плазмиду pMOS-BLUE (Amersham, USA) синтезированная последовательность (4G₄S-CD154) вставляется непосредственно после «хвоста» из 6 гистидинов в кодирующей последовательности Е2his. Получают плазмиду pMOS-2Ehis-CD154.

Пример 2: Генетические конструкции молекул E2his и E2his-CD154 с сигналами секреции для клеток млекопитающих

Последовательность, соответствующую E2his и полученную RT-PCR, вставляют по сайтам Bgl II-EcoR V в плазмиду pAEC-SPT (Herrera et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 279:548-551). Тем самым получают вектор pE2his-sec, содержащий кодирующую последовательность для E2his, которой предшествует сигнал секреции тканевого активатора плазминогена человека (htPA) и которая находится под транскрипционным контролем предраннего промотора цитомегаловируса человека (PCMV).

Последовательность, соответствующую E2his-CD154 и субклонированную в вектор pMOS-BLUE, вставляют по сайтам для эндонуклеаз рестрикции Bgl II-Sal I в плазмиду pAEC-SPT. Тем самым получают вектор pE2his СD154-sec, содержащий кодирующую последовательность для E2his-СD154, которой предшествует сигнал секреции htPA и которая находится под транскрипционным контролем PCMV.

Пример 3: Формирование рекомбинантных аденовирусных векторов, содержащих кодирующие последовательности для E2his и E2his-CD154 с сигналами секреции для клеток млекопитающих

Дефектные по репликации аденовирусные векторы (Ad-ΔE1, ΔE3) получают как описано в инструкции к системе AdEasy (AdEasy^tm-Vector System Quantum Biotechnology, EE.UU). Плазмиду pAdTrack-CMV используют как переносящий вектор. Кодирующую последовательность для E2his с сигналом секреции htPA (E2his-sec) вырезают из плазмиды рE2his-sec энзиматическим перевариванием эндонуклеазами рестрикции Nco I и EcoR V и вставляют по сайту рестрикции EcoR V в вектор pAdTrack. Получают рекомбинантный pAdT-E2his-sec с секретируемым вариантом E2his под транскрипционным контролем PCMV.

Кодирующую последовательность для секретируемого E2his-CD154 вырезают из плазмиды рE2his-CD154-sec энзиматическим перевариванием эндонуклеазами рестрикции Nco I и Sal I и вставляют по сайтам рестрикции Kpn I-Xho I в вектор pAdTrack. Получают рекомбинантный pAdT-E2hisCD154-sec с E2his-CD154sec под транскрипционным контролем PCMV.

Переносящие аденовирусные векторы pAdT-E2his-sec и pAdT-E2hisCD154-sec линеаризуют энзиматическим перевариванием эндонуклеазой рестрикции Pme I для формирования рекомбинантных аденовирусных геномов.

Каждый из линейных векторов вводят электропорацией вместе с вектором pAdEASY-1 в штамм Escherichia coli BJ5183. Рекомбинантные геномы векторов pAd-E2his-sec и pAd-E2hisCD154-sec получают рекомбинацией гомологов. Один из них содержит кодирующую последовательность для молекулы E2his-sec, а другой содержит кодирующую последовательность для молекулы E2his-CD154-sec. В обоих случаях они остаются под транскрипционным контролем PCMV.

Рекомбинантные аденовирусные геномы затем переваривают эндонуклеазой Pac I и трансфецируют в комплементарные клетки линии НЕК-293А и получают инфекционные вирионы. Формируются два аденовирусных вектора: Ad-E2his-sec и Ad-E2his-CD154-sec. Векторы независимо размножаются в клетках линии НЕК-293А до достижения титра 1×10¹² колониеобразующих единиц/мл (CFU/мл) и очищаются двукратным центрифугированием в градиенте CsCl. Векторы затем переводят диализом против буфера для хранения (10 мМ Трис, рН 8,0, 2 мМ MgCl₂, 4% сахароза) и хранят при -70°С. Способность аденовирусных векторов Ad-E2his-sec и Ad-E2hisCD154-sec трансформировать клетки млекопитающих и опосредовать экспрессию и секрецию молекул E2his и E2his-CD154 в среду культивирования была подтверждена тестами на инфекционность на клетках свиньи линии РК15. Образцы белков, присутствовавших в среде культивирования инфицированных клеток, разделялись электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в невосстанавливающих условиях и проанализированы иммуноблоттингом с моноклональными антителами против Е2 ВКЧС (αE2-1G6) (фиг.1 и 2).

Анализ молекулярных масс гликопротеинов E2his и E2his-CD154 подтвердил, что они соответствовали димерным и тримерным изоформам. На дорожке 1 фиг.2 видны две полосы, соответствующие димерным (180 кДа) и тримерным изоформам E2-CD154 (270 кДа).

Пример 4: In situ трансдукция эпителия молочной железы козы для получения E2his и E2his-CD154 в молоке

Для трансформации эпителия молочной железы экспрессионными кассетами E2his и E2his-CD154 применяются рекомбинантные аденовирусные векторы Ad-E2his-sec и Ad-E2hisCD154-sec. В обоих случаях векторы вводятся в молочную железу коз, производящих молоко, прямым вливанием в вымя через канал соска. Аденовирусные векторы инфицируют секреторные эпителиальные клетки, которые составляют эпителий молочной железы, разрешая экспрессию рекомбинантных белков.

Используются козы на втором месяце лактации, с производительностью в среднем 1 литр в день. Для введения аденовирусных векторов самки сначала подвергаются доению до удаления молока из вымени, затем изоосмотический солевой раствор вливается в цистерны непосредственно через канал соска при мягком массировании вымени для гарантии полного промывания молочной железы. Солевой раствор удаляется путем тщательного доения вымени, и процесс повторяют дважды. Впоследствии вводится аденовирусный инокулят с титром 10⁹ CFU/мл в солевом растворе, содержащем 36 мМ ЭГТА. Объем вливаемого препарата варьирует в зависимости от емкости вымени и гарантированно его заполняет. После вливания вымя массируют для облегчения гомогенного распределения инокулята в железе и достижения секреторных эпителиальных клеток альвеол. Через 24 часа аденовирусный инокулят удаляется посредством доения. С целью удаления остаточных аденовирусных векторов из цистерны или молочных протоков молочные железы промывают снова путем вливания солевого раствора.

Через двадцать четыре часа после этого путем ручного доения начинают собирать молоко от трансформированных животных. Ежедневно производят два доения с 12-часовым интервалом. Собранное молоко сохраняют при -70°С. Кинетику экспрессии рекомбинантных белков E2his и E2his-CD154 в молоке анализируют для каждого надаиваемого образца (фиг.3 и 4). Доказано, что молекулярные размеры рекомбинантных белков соответствуют димерным и тримерным изоформам. Для E2his была получена средняя экспрессия 1,03 г/л на 2-8 дни после инокуляции, со средним выходом 5,22 г из одного животного. Для рекомбинантной молекулы E2his-CD154 была получена средняя экспрессия 0,73 г/л, со средним выходом 3,04 г из одного животного.

Пример 5: Выделение антигенов E2his и E2his-CD154 из молока коз

Образцы от каждого дня доения, содержавшие рекомбинантные вакцинные антигены E2his и E2his-CD154, соответственно, смешивают и центрифугируют при 15000g в течение 30 минут при 4°С. Растворимую фазу (сыворотку молока) сепарируют и жировую фазу отбрасывают. Собранную сыворотку разводят буфером для сепарирования молока (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ СаСl₂, pH 8,0) в соотношении 1:4. Смесь охлаждают на льду в течение 30 минут и центрифугируют при 15000g в течение 30 минут при 4°С. Супернатанты и осадки анализируют SDS-электрофорезом в ПААГ и иммуноблоттингом. Было определено, что наибольшее количество таких рекомбинантных