Пробиотический штамм lactobacillus casei, продуцирующий молочную кислоту, применение штамма для приготовления питательной композиции для лечения или профилактики легочной дисфункции, питательная композиция и способ ее получения, лекарственное средство для лечения или профилактики хронической обструктивной болезни легких у субъекта и применение штамма для приготовления лекарственного средства, контейнер

Пробиотический штамм lactobacillus casei, продуцирующий молочную кислоту, применение штамма для приготовления питательной композиции для лечения или профилактики легочной дисфункции, питательная композиция и способ ее получения, лекарственное средство для лечения или профилактики хронической обструктивной болезни легких у субъекта и применение штамма для приготовления лекарственного средства, контейнер

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области пищевых продуктов и/или фармакологических композиций. Настоящее изобретение предоставляет новые применения живых (пробиотики) бактерий, продуцирующих молочную кислоту, мертвых или нежизнеспособных бактерий, а также пищевые добавки, питательные композиции и/или фармацевтические композиции. Настоящее изобретение дополнительно предоставляет способы изготовления таких композиций, а также способы идентификации бактерий, пригодных для включения в такие композиции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ухудшение легочной функции может быть вызвано сужением дыхательных путей или снижением диффузии кислорода через легочный эпителий в кровоток. Сужение дыхательных путей может быть результатом, например, увеличенного сопротивления дыхательных путей (СДП) и гиперреактивности дыхательных путей или бронхов (ГРДП или ГРБ). ГРДП относится к ненормально увеличенному бронхоконстрикторному ответу на множество стимулов и выражается в повышенной чувствительности (сужение дыхательных путей) к стимулам. Кроме того, частая ГРДП у субъекта приводит к перестройке дыхательных путей и, таким образом, к сужению дыхательных путей, увеличенному сопротивлению дыхательных путей, и впоследствии вызывает непрерывный цикл событий, ведущий к дальнейшему ухудшению легочной функции (Babu and Arshed, 2003). Сужение дыхательных путей представляет собой симптом, связанный с различными легочными заболеваниями или расстройствами, такими как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), астма, муковисцидоз и экзогенные заболевания легких. Это также происходит после перенесенной инфекции верхних дыхательных путей и у атопических неастматиков, а также у пациентов с астмой в анамнезе.

ХОБЛ является родовым понятием, охватывающим хронические бронхиты и эмфиземы. Главным фактором повышенного риска ХОБЛ является активное и/или пассивное курение. Другими факторами риска являются воздействие, связанное с профессиональной деятельностью, и генетически обусловленный дефицит ингибитора альфа-1 протеиназы (или альфа-1 антитрипсина). При хроническом бронхите пациентов беспокоит хронический продуктивный кашель на протяжении двух лет подряд не менее трех месяцев в году. Часто наблюдается медленная динамика к усилению кашля, затруднению дыхания, уменьшению скорости выдоха, снижению переносимости физической нагрузки и нарушению повседневной активности. Секреция густой слизи и отек стенок бронхов обуславливают сужение дыхательных путей. При эмфиземе наблюдаются разрушение альвеолярных стенок или гибель легочных капилляров, которые окружают альвеолы, увеличение воздушного пространства дистальнее терминальных бронхиол, деструкция альвеолярных стенок и снижение диффузии газа вследствие уменьшения площади альвеолярной поверхности. Помимо коллапса альвеол, морфологические изменения, наблюдаемые при ХОБЛ, представляют собой гиперпролиферацию клеток гладкой мускулатуры. Такие морфологические изменения приводят к снижению функции потребления кислорода и нарушению сокращения гладкой мускулатуры. В дальнейшем, среди прочего, это приводит к гиперреактивности легких (дыхательных путей) к неспецифическим агентам, таким как метахолин, гистамин, холодный воздух и т.д., и к увеличению сопротивления дыхательных путей.

Астма представляет собой другой тип поражения легких. Это - хроническое состояние, связанное с такими симптомами, как затруднение дыхания, стесненность груди, свистящее дыхание, образование мокроты и кашель. Предполагается, что развитие и персистирование астмы происходит, прежде всего, из-за наличия индуцируемого антигеном воспаления и его влияния на структуру дыхательных путей (“аллергическая астма”). Хотя некоторые симптомы ХОБЛ похожи на астму, существует весомое свидетельство, указывающее на то, что астма и ХОБЛ не являются одним и тем же, и что пациенты с этими состояниями должны проходить разное лечение. В отличие от ХОБЛ у астматических пациентов затрудненное дыхание является обратимым.

Заболевания, при которых важную роль играет гиперреактивность дыхательных путей и/или сопротивление дыхательных путей, представляют собой основную проблему для здоровья. Например, на сегодняшний день ХОБЛ занимает в мире пятое место среди распространенных заболеваний и четвертое место по смертности, и предполагается, что к 2020 году ХОБЛ может занять третье место в мире среди наиболее распространенных заболеваний со смертельным исходом. Более одной трети пациентов с ХОБЛ сообщают, что их состояние не позволяет им работать, ограничивает их работоспособность, или является причиной их отсутствия на работе за прошедший год. Эти непрямые затраты вместе с прямыми затратами на первичные и вторичные расходы на здравоохранение в США в середине 90-х составили, по оценкам, около 11 миллиардов долларов.

В развитых странах уровень распространения астмы является высоким. В Великобритании, например, в 2001 году мониторинг астмы в рамках национальной оздоровительной кампании показал, что на текущий момент проходил лечение от астмы 1 из 13 взрослых и 1 из 8 детей. Также в случае астмы затраты, связанные с потерей производительности, лечением заболевания и затратами на социальную защиту являются огромными (по оценкам, в 2001 году в Великобритании составили 2,2 миллиарда фунтов).

Существующие на сегодняшний день средства лечения легочных заболеваний, таких как ХОБЛ или астма, включают в себя медикаментозное лечение и оказание помощи в прекращении курения. Пациенту часто бывает сложно прекратить курение, а при применении лекарственных препаратов могут возникать побочные эффекты. Эти побочные эффекты могут заключаться, например, в учащенном сердцебиении, тахикардии, треморе, нестабильности/повышенной возбудимости, головной боли, бессоннице, сухости рта, затуманенном зрении, раздражимости, дисфории, тошноте, рвоте, хрипоте, недостаточности надпочечников, иммуносупрессии и диарее в зависимости от определенного используемого лекарственного препарата. Кроме того, пациенты могут стать нечувствительными к лекарственным препаратам.

Следовательно, существует дополнительная потребность в композициях и способах, которые положительно влияют на функцию легких путем уменьшения ГРДП и СДП у пациентов наряду с устранением побочных эффектов.

Известно, что некоторые штаммы микроорганизмов, особенно микроорганизмов, относящихся к родам Lactobacillus и/или Bifidobacterium, так называемые “пробиотические” штаммы, имеют положительное влияние на жизненные функции человека и/или животных. Были опубликованы сообщения о терапевтических и профилактических эффектах при диарее, гастроинтестинальной инфекции или инфекции мочевых путей, вагинальных инфекций, воспалительных заболеваний и аллергии. Механизмы действия пробиотиков при этих нарушениях представляют собой непосредственное удаление патогенов и/или модуляцию иммунной системы. Показано, что специфические пробиотические штаммы обладают, например, эффектом понижения уровня противовоспалительного цитокина IFN-γ in vitro, или, например, in vivo (Schultz et al. 2003; Varcoe et al. 2003; Madsen et al. 2001; Tejada-Simon 1999). В публикации WO 03/010298 раскрыты пробиотические штаммы L. salivarius, которые обладают иммуномодулирующим действием, поскольку они очевидным образом уменьшают уровни противовоспалительных цитокинов, присутствующих в кишечнике. Аналогично в патенте WO 03/010297 раскрыты пробиотические штаммы рода Bifidobacterium, которые имеют противовоспалительный эффект. В патенте WO 01/97822 раскрыто применение штаммов Lactobacillus GG (ATCC 53103) и Bifidobacterium lactis Bb-12 при аллергических воспалениях. В публикации WO 01/37865 раскрыта негативная регуляция IgE антител после применения пробиотических бактерий.

Хотя в уровне техники описано использование пробиотиков, бактериальные штаммы, описанные на сегодняшний день, были выбраны по положительному антиаллергенному и/или противовоспалительному воздействию на иммунную систему или антипатогенным эффектам. Там, где эти штаммы показали положительный эффект, этот эффект во всех случаях проявлялся (непосредственно или опосредованно) через эти виды воздействия. Например, отмечено, что при лечении аллергии использование пробиотических штаммов имеет противовоспалительный эффект или влияет на иммунную систему с восстановлением баланса Th1/Th2, и, следовательно, предполагается, что такие штаммы являются полезными при лечении аллергической астмы.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения впервые провели тестирование изолированных бактериальных штаммов на предмет непосредственного воздействия на легочную функцию (а именно: на PenH и таким образом на ГРДП и СДП) и неожиданно обнаружили, что некоторые бактериальные штаммы, продуцирующие молочную кислоту (группы 1 и 2, см. ниже), имеют значимое положительное влияние in vitro на сужение дыхательных путей, в частности на ГРДП, и такое влияние проявляется в виде воздействия, которое не зависит от противовоспалительного ответа и также не зависит от восстановления баланса Th1/Th2-типа цитокинового ответа, который представляет собой (антиген-специфический) иммунный ответ, наблюдаемый у пациентов с аллергией (см. Cross et al. 2002). Более того, в отличие от ранее описанных лекарственных препаратов, используемых для лечения респираторных заболеваний, штаммы по настоящему изобретению не нужно вдыхать, их можно принимать внутрь. Штаммы по настоящему изобретению, таким образом, могут быть использованы для лечения или предупреждения респираторных заболеваний, в отношении которых ранее не было известно, что их можно лечить при помощи пробиотических штаммов, таких как, например, ХОБЛ и неаллергическая астма. Также, настоящее описание охватывает совместное применение одного или нескольких штаммов по настоящему изобретению, например, вместе с известными пробиотическими штаммами (например, штаммами с различными видами действия). Кроме того, штаммы по настоящему изобретению могут применяться в виде мертвых клеток или композиций, содержащих их, для обеспечения положительного влияния на легочную функцию.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

“Молочнокислые бактерии” и “бактерии, продуцирующие молочную кислоту”, как используется в настоящем описании, являются взаимозаменяемыми и относятся к бактериям, которые продуцируют молочную кислоту в виде конечного продукта ферментации, таким как, без ограничений, бактерии родов Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Carnobacterium, Propionibacterium, Enterococcus и Bifidobacterium.

“Пробиотики” или “пробиотический штамм(штаммы)” относятся к штаммам живых микроорганизмов, предпочтительно бактериям, которые имеют положительное влияние на хозяина при приеме субъектом внутрь (т.е. энтерально или при помощи ингаляции).

“Субъект” относится в настоящем изобретении к человеку или животному, не являющемуся человеком, в частности к позвоночному.

Термин “легочная дисфункция” относится в настоящем описании к уменьшению потока воздуха, вызванному “неспецифическим сужением дыхательных путей”. Термин «легочная дисфункция» не охватывает “специфического сужения дыхательных путей”, которое в настоящем описании относится к сужению дыхательных путей, связанному с иммунологическим ответом легочной ткани, что наблюдается при аллергической астме, запускаемой аллергеном. Легочная дисфункция может быть измерена как сопротивление дыхательных путей (СДП) или гиперчувствительность дыхательных путей (ГРДП).

“Гиперчувствительность дыхательных путей или бронхов” или “гиперреактивность дыхательных путей или бронхов” (ГРДП или ГРБ) относится к увеличению легкости и степени сужения дыхательных путей в ответ на бронхоконстрикторные стимулы. ГРДП может быть измерена при помощи бронхопровокационных тестов, как описано в настоящем описании. “Неспецифически индуцируемая гиперчувствительность дыхательных путей” (неспецифическая ГРДП) используется в настоящем описании в отношении ГРДП, которая не зависит от аллергической реакции (вызываемой аллергеном) у субъекта. Напротив, “специфически индуцируемая ГРДП” относится к ГРДП, зависящей от иммунной системы субъекта, которая чувствительна к специфическим аллергенным агентам.

“Сопротивление дыхательных путей” (СДП) относится к измерению сопротивления дыхательных путей во время прохождения воздуха через легкие с определенной скоростью. СДП имеет такое же значение, как и основной уровень ГРДП при отсутствии бронхопровокации. СДП также может быть измерено при помощи бронхопровокационных тестов.

“ОФВ1” относится к объему форсированного выдоха за первую секунду выдоха при измерении спирометром. “ФЖЕЛ” относится к форсированной жизненной емкости, также измеряемой спирометром. ОФВ1 является мерой функционирования легких и сужения дыхательных путей у людей. В отличие от PenH теста, используемого при тестировании животных, тесты бронхиальной провокации выполняют на людях, особенно при измерении ОФВ1.

Штамм со “значимым положительным влиянием на сужение дыхательных путей” относится к штамму, который имеет значимое уменьшенное значение PenH по сравнению с подходящими контролями в PenH тесте, как описано в настоящем описании. Понятно, что вместо оценки PenH могут быть определены эквивалентные альтернативные значения, такие как ОФВ1 при тестировании людей.

Термин “значимый противовоспалительный эффект” определен как увеличение, по меньшей мере, на 10% количества воспалительных клеток, определенных в бронхоальвеолярном лаваже.

Термин “содержащий” должен быть интерпретирован как указание на присутствие определенных частей, этапов или компонентов, что не исключает присутствия одного или нескольких дополнительных частей, этапов или компонентов. Композиция, содержащая кисломолочные бактерии, таким образом, может содержать дополнительные бактериальные штаммы и т.д.

При измерении влияния нескольких штаммов молочнокислых бактерий (принимаемых перорально) на овальбумин у сенсибилизированных мышей, используя PenH тест, неожиданно было обнаружено, что некоторые бактериальные штаммы, продуцирующие молочную кислоту, были способны оказывать значимое положительное влияние на PenH и, в частности, на гиперчувствительность дыхательных путей без сопутствующего влияния на воспаление, как определено посредством притока воспалительных клеток (например, нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и макрофагов) в легочную ткань.

Удивительным является то, что бактериальные штаммы могут быть дифференцированы и сгруппированы на основании их влияния на сужение дыхательных путей (как определено при помощи PenH) и их противовоспалительного/иммуномодулирующего эффекта. Следовательно, по сравнению с группой бактериальных штаммов, не проявляющих активность ни на воспаление, ни на сужение дыхательных путей, бактерии, продуцирующие молочную кислоту, могут быть разделены на 3 группы на основании их отличающихся видов воздействия. Штаммы группы 1 (например, штамм TD1, т.е. штамм B.breve MV-16, Morigana) имели значимый противовоспалительный эффект и значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей. Другие штаммы, принадлежащие к группе 1, представляют собой GG Lactobacillus, Bb-12 Bifidobacterium, которые были обнаружены в экспериментах авторов изобретения, как имеющие на PenH эффект уменьшения более чем на 25%. Известно, что эти штаммы оказывают значимое противовоспалительное действие (WO 01/97822, включенную в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки). Штаммы группы 2 (например, штамм TD2, т.е. штамм, размещенный в ВССМ^ТМ под регистрационным № LMG P-22110, Univ.Gent, Belgium) не вызывали значимого противовоспалительного эффекта, но имели значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей. Штаммы группы 3 (например, штамм TD5, т.е. B.infantis Bi07 от Rhodia Food) не имели значимого положительного влияния на сужение дыхательных путей, но вызывали значимый противовоспалительный эффект. Это ясно демонстрирует, что положительное влияние на сужение дыхательных путей и противовоспалительный эффект не связаны, и что бактерии, продуцирующие молочную кислоту, способны оказывать значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей независимо от того, имеют они или нет такое же влияние на воспаление.

Можно сделать вывод, что штаммы группы 2 не оказывают влияния посредством иммунной системы, насколько это может быть определено общими способами измерения воспаления легочной ткани, а именно: измерением притока противовоспалительных клеток в бронхи, в частности нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и макрофагов. Однако это не исключает того, что штаммы группы 2 также влияют на иммунную систему некоторым другим новым или отличающимся способом, который не измеряется или не может быть измерен с использованием этих способов. В любом случае отсутствие противовоспалительного эффекта этих штаммов четко отличает их от известных штаммов (таких как Bifidobacterium Bb-12 и Lactobacillus GG), которые действительно оказывают влияние посредством противовоспалительного ответа у аллергических субъектов. Без ограничения объема изобретения может быть исследовано непосредственное влияние на клетки легочного эпителия или клетки гладкой мускулатуры в легких, хотя точный механизм такого влияния на легкие требует уточнения.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения включает использование бактериального штамма, продуцирующего молочную кислоту, для приготовления композиции для лечения или для профилактики легочной дисфункции (как определено выше). Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, которые являются стабильными и используются для приготовления композиции, представляют собой бактерии группы 1 и/или группы 2, т.е. бактерии, которые имеют значимое положительное влияние на сужение легочных путей, как может быть измерено в PenH тесте или тесте ОФВ1. Предпочтительно, используется PenH тест (как описано Hamelmann et al. 1997).

Как упоминалось выше, штаммы группы 1 представляют собой штаммы, которые оказывают значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей (как определено) и, по меньшей мере, также значимый противовоспалительный эффект у тестируемых субъектов. Штаммы группы 1 также могут иметь иммуномодуляторный эффект, например, посредством модуляции уровней цитокинов. Штаммы группы 1 представляют собой, например, штамм B.breve MV-16, Morinaga (в настоящем описании также называемый TD1).

Штаммы группы 2 представляют собой новые штаммы, которые оказывают значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей (как определено), но при этом, по меньшей мере, отсутствует сопутствующий противовоспалительный эффект. Например, штаммом группы 2 является LMG P-22110 (в настоящем описании также называемый TD2). Предпочтительно, штаммы группы 2 не имеют иммуномодулирующей активности. Кроме того, штаммы группы два могут быть легко идентифицированы с использованием способов, описанных в настоящем описании.

Штаммы группы 3 представляют собой штаммы, которые не оказывают значимого положительного влияния на сужение дыхательных путей (как определено), но оказывают, по меньшей мере, противовоспалительное действие. B.infantis Bi07 от Rhodia Food (в настоящем описании также называемый TD5) является примером этой группы.

Значимое положительное влияние бактериального штамма на сужение дыхательных путей определяли путем измерения значимого (положительного) влияния на сужение дыхательных путей тестируемого штамма по сравнению с контрольным штаммом. Это можно сделать либо используя тестируемых животных, либо людей, хотя соответствующие тесты и измеряемые параметры различаются (тест PenH и тест ОФВ1 соответственно), как описано ниже. Таким образом, значимое значение PenH или ОФВ1 определяет, имеется ли значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей и, в частности, на ГРДП и/или СДП. Какой уровень в этом отношении считать “значимым”, зависит от используемых теста и параметров, как описано ниже. Одним из важных факторов является то, что результаты теста являются статистически значимыми при проведении статистического анализа, подходящего для используемого теста. Предпочтительно, по меньшей мере, используется 95% граница доверительного интервала. Используя любой из этих тестов или равнозначные тесты, известные в данной области техники, специалист в данной области техники может идентифицировать штаммы, которые имеют значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей. Такие штаммы являются подходящими для использования в композициях и способах согласно настоящему изобретению.

Определение ОФВ1 у людей

Определение ОФВ1 спирометром, до и после бронхоконстрикторного стимула, обычно является наиболее часто используемым способом для количественного определения у людей ответа ГРДП и/или СДП. Положительный тест характеризуется определенной дозой или уровнем стимулирующего вещества при определенном падении ОФВ1 (объема форсированного выдоха за 1 секунду). Бронхопровокационные тесты обычно проводятся согласно определенным протоколам, либо путем измерения кумулятивной дозы PD20 (Yan et al. 1983) (PD20 относится к провокационной дозе с 20% понижением ОФВ1) или при помощи более длительного способа измерения РС (Cockcroft 1985) (РС относится к провокационной концентрации). РС20<0,25 мг/мл (PD20<0,1 мкМ) имеет сильный ответ, РС20 0,25-2,0 мг/мл (PD20 0,1-0,8 мкМ) умеренный ответ и РС20 2,0-8,0 мг/мл (PD20 0,8-8,0 мкМ) имеет слабый ответ. Используемые бронхоконстрикторные стимулы представляют собой фармакологические агенты (гистамин, метахолин), физические стимулы (неизотонические аэрозоли, холодный/сухой воздух, физическая нагрузка) и специфические сенсибилизирующие агенты (аллергены). У людей такие бронхопровокационные тесты могут использоваться для постановки диагноза или подтверждения диагноза ГРДП для документирования тяжести ГРДП с целью отслеживания изменений при ГРДП после терапевтического вмешательства или ухудшении симптомов для исключения диагноза астмы у пациентов с хроническим кашлем, для определения, кто подвергается риску на рабочем месте или во время оздоровительной деятельности, и/или для определения контроля или исходного уровня до воздействия факторов окружающей среды или воздействия, обусловленного профессиональной деятельностью.

Уменьшение ОФВ1, по меньшей мере, на 10%, как определено после бронхопровокации тестируемого субъекта по сравнению с контрольным субъектом, считается ухудшением функции легких (Cockroft 1985, Yan et al. 1983). Считается, что штамм имеет положительное влияние, если исходный уровень ОФВ1 значимо (<10%) увеличивается во время и/или после добавления специфического штамма, или если существенно (<10%) снизилось уменьшение ОФВ1 после бронхопровокации.

Тестирование животных - PenH тест

Поскольку ОФВ1 не может быть измерен у животного, созданы другие средства измерения сужения дыхательных путей (т.е. PenH и таким образом ГРДП и СДП). PenH предпочтительно измеряется у тестируемых животных in vitro с использованием плетизмографа, как описано у Hаmelman et al. (1997), включенного в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки. Более коротко, тестируемое животное (обычно мышь) помещают в камеру плетизмографа для животных. Когда животное дышит спокойно, оно создает флуктуации давления в камере, которые представляют собой разницу между дыхательным объемом и движением грудной клетки во время дыхания. Датчик дифференциального давления измеряет изменения в давлении между камерой животного и контрольной камерой. Помимо известных параметров легочной функции в виде пика потока экспирации (PEF), дыхательного объема (TV), времени экспирации (Te) и частоты (f), также измеряется увеличенная пауза (PenH). Исходная PenH составляет приблизительно 0,30 у нормальных животных, не страдающих каким-либо ухудшением легочной функции. Также считается, что исходная PenH у животных представляет собой параметр СДП. Во время бронхоконстрикции (запущенной метахолином) PEF и PIF (пиковой скорости вдоха) увеличиваются, поскольку уменьшаются Tr (время релаксации) и Те. Это приводит к увеличению PenH. Данные чувствительности дыхательных путей у сознательно не ограниченных в движении мышей выражаются в виде PenH. Увеличение PenH коррелирует с уменьшением ОФВ1. Следовательно, можно предположить, что вещества, которые ингибируют увеличение PenH у животных, не уменьшают ОФВ1 и, таким образом, ослабляют сужение дыхательных путей и улучшают функционирование легких у людей.

В общих чертах разница в значении PenH после бронхопровокации, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 20% и т.д. или более между контрольным субъектом и субъектом, которому был введен тестируемый штамм, указывает на значимое влияние тестируемого штамма.

Способ тестирования животных, описанный выше (PenH), или способ тестирования людей (ОФВ1) может использоваться для определения, какие штаммы пригодны для использования для производства композиций по настоящему изобретению. Композиции изготавливают таким образом, чтобы они имели положительное влияние при лечении и/или профилактике дисфункции легких у людей и/или у животных. Влияние штаммов и/или композиций, содержащих эти штаммы, на людей также может быть измерено при помощи бронхопровокационного теста, как описано выше.

Для того, чтобы определить, попадает ли клеточный штамм, который имеет значимое положительное влияние, в группу 1 или группу 2, определяют противовоспалительный эффект (и необязательно также иммуномодулирующий эффект) штамма, используя известные способы, как, например, описано в Примерах. Является ли влияние значимым, определяют, используя известные способы статистического анализа, подходящие для используемого теста. В общих чертах разница в PenH, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 20, 30, 40 или 50% между контрольными субъектами и субъектами с введенным тестируемым штаммом указывают на значимое влияние тестируемого штамма.

Композиция

Композиция, изготовленная с использованием одного или нескольких штаммов согласно настоящему изобретению, может представлять собой композицию любого типа, которая является подходящей для приема внутрь субъектом, особенно человеком, страдающим легочной дисфункцией, такой как ХОБЛ или астма, или другими респираторными заболеваниями, при которых наблюдается гиперчувствительность дыхательных путей и/или сужение дыхательных путей. Композиция может представлять собой пищевой продукт или композицию пищевой добавки, питательную (пищевую) композицию или фармацевтическую композицию. В зависимости от типа композиции и предпочтительного способа применения, компоненты или структура композиции могут различаться. Помимо бактериального штамма(штаммов) настоящего изобретения пищевой продукт или пищевая/питательная композиция также содержит подходящую пищевую основу. В настоящем изобретении предполагается, что пищевой продукт или пищевая композиция включает твердые вещества (например, порошки), полутвердые вещества и/или жидкости (например, напиток или питье) для потребления человеком или животным. Пищевой продукт или пищевая/питательная композиция может представлять собой молочный продукт, такой как кисломолочный продукт, включая, без ограничений, йогурт, напиток на основе йогурта или пахту. Такие пищевые продукты или пищевые композиции могут быть приготовлены способом, по существу известным, например, путем добавления штамма(штаммов) настоящего изобретения в подходящий пищевой продукт или основной компонент пищевого продукта в подходящем количестве (см., например, WO 01/82711). В другом варианте настоящего изобретения штамм(штаммы) используются при или для приготовления пищевого продукта или пищевой композиции, например, при ферментации. Примеры таких штаммов включают пробиотические бактерии настоящего изобретения, продуцирующие молочную кислоту. При этом штамм(штаммы) по настоящему изобретению может быть использован в способе приготовления, по существу известном, таких ферментированных пищевых продуктов или пищевых композиций, например, способом приготовления, по существу известным, кисломолочных продуктов с использованием бактерий, продуцирующих молочную кислоту. В таких способах штамм(штаммы) по настоящему изобретению может быть использован дополнительно к обычно используемому микроорганизму и/или может заменять один или несколько, или часть обычно используемых микроорганизмов. Например, при приготовлении кисломолочных продуктов, таких как йогурт или напитки на основе йогурта, живые бактерии пищевой кондиции, продуцирующие молочную кислоту по настоящему изобретению, могут быть добавлены или использованы как часть заквасочной культуры или могут быть добавлены подходящим образом во время такой ферментации.

Композиции пищевой добавки

Помимо эффективного количества одного или нескольких штаммов группы 1 и/или группы 2, пищевые добавки могут содержать один или несколько носителей, стабилизаторов, пребиотиков и т.п. Предпочтительно, композиция находится в виде порошка для энтерального применения (предпочтительно перорально), хотя также подходящим может быть назальное или ингаляционное применение. При использовании живых клеток штамма(штаммов) клетки могут находиться в инкапсулированном виде для защиты от переваривания в желудке. Например, композиция может быть в виде порошка, упакованного в пакет-саше, который может растворяться в воде, фруктовом соке, молоке или другом напитке. Предпочтительно, композиция содержит, по меньшей мере, один штамм группы 2, такой как LMG P-22110. Доза живых клеток на штамм, предпочтительно, составляет, по меньшей мере, 1х10⁶ КОЕ на штамм, предпочтительно, между примерно 1х10⁶-1х10¹² КОЕ (колониеобразующих единиц) в сутки, более предпочтительно между примерно 1х10⁷-1х10¹¹ КОЕ/сутки, еще более предпочтительно примерно 1х10⁸-5х10¹⁰ КОЕ/сутки, наиболее предпочтительно примерно 1х10⁹-2х10¹⁰ КОЕ/сутки. Эффективная доза может быть разделена на несколько более мелких доз и применяться, например, двумя, тремя или более частями в сутки. Вместо использования живых клеток в некоторых композициях могут использоваться мертвые или нежизнеспособные клетки, как описано ниже.

Пищевая/питательная композиция

Помимо одного или нескольких штаммов группы 1 и/или группы 2 в подходящей дозированной форме, питательная композиция предпочтительно содержит углеводороды и/или белки, и/или липиды, подходящие для потребления человеком или животным. Композиции могут содержать или могут не содержать другие биоактивные ингредиенты, такие как другие (пробиотические) штаммы и пребиотики, которые поддерживают пробиотические штаммы. При использовании живых клеток штамма(штаммов) клетки могут находиться в инкапсулированном виде для защиты от переваривания в желудке. Доза живых клеток на штамм составляет предпочтительно, по меньшей мере, 1х10⁶ КОЕ, предпочтительно между 1х10⁶-1х10¹² КОЕ (колониеобразующих единиц) в сутки, более предпочтительно между примерно 1х10⁷-1х10¹¹ КОЕ/сутки, еще более предпочтительно примерно 1х10⁸-5х10¹⁰ КОЕ/сутки, наиболее предпочтительно примерно 1х10⁹-2х10¹⁰ КОЕ/сутки. Предпочтительно, композиция содержит, по меньшей мере, один штамм группы 2, такой как LMG P-22110. Питательное вещество, предпочтительно, находится в жидком или порошкообразном виде. В одном из вариантов осуществления питательное вещество представляет собой “Resoifor®”, в виде жидкого продукта, коммерчески доступного (Nutricia, the Netherlands), т.е. на основе энергетически ценного молока с высоким содержанием белка и углеводородов, обогащенного антиоксидантами и содержащего вкусовые добавки. Предпочтительно, у человека питательное вещество не заменяет нормальный прием пищи/напитка, но потребляется дополнительно к нему. Питательное вещество предпочтительно принимают энтерально, например перорально или при помощи трубочки.

Фармацевтическая композиция

Один или несколько штаммов группы 1 и/или группы 2 в подходящей дозировке также могут быть использованы для создания фармацевтической композиции для лечения, терапии или профилактики легочной дисфункции. Фармацевтические композиции обычно могут быть использованы для энтерального (например, перорального), назального/ингаляционного, вагинального или ректального применения. Фармацевтические композиции обычно могут содержать фармацевтический носитель дополнительно к штамму(штаммам) по настоящему изобретению. Предпочтительная форма зависит от назначенного режима введения и (терапевтического) применения. Фармацевтический носитель может быть любым совместимым, нетоксичным веществом, подходящим для доставки штамма(штаммов) в желаемую полость тела, например кишечник субъекта. Например, могут быть использованы стерильная вода или инертные твердые вещества в качестве носителя, обычно дополняемого фармацевтически приемлемыми адъювантами, буферизующими агентами, диспергирующими агентами и т.п. Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать дополнительные биологически или фармацевтически активные ингредиенты.

В дополнительных вариантах осуществления в вышеупомянутых композициях используются мертвые или нежизнеспособные клетки бактериального штамма(штаммов), вместо или дополнительно к живым (или жизнеспособные) бактериям, например, как описано в WO 01/95741. Количество используемых мертвых или нежизнеспособных клеток может, например, быть эквивалентным количеству, используемому для живых бактерий. Подходящее количество может быть легко определено специалистами в данной области техники. В таких композициях количество клеток подсчитывается (например, с использованием проточного цитометра) или измеряется различными способами, известными специалистам в данной области техники, поскольку измерение в виде “колониеобразующих единиц” не является практически осуществимым.

Понятно, что при ссылке на композиции, содержащие живые клетки, охватываются клетки, которые являются жизнеспособными, например лиофилизированные клетки, которые снова становятся активными после применения или восстановления жидкостью.

Пищевой продукт, пищевые добавки, питательные или фармацевтические композиции могут находиться либо в жидком, например стабилизированная суспензия штамма(штаммов), либо в твердом виде, например порошок, либо в полужидком виде. Например, для перорального применения штамм(штаммы) может применяться в виде твердых дозированных форм, таких как капсулы, таблетки и порошки, либо в виде жидких дозированных форм, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Штамм(штаммы) может быть инкапсулирован в желатиновые капсулы совместно с неактивными ингредиентами и порошкообразными носителями, такими как глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, крахмал, целлюлоза или производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота, сахарин натрия, тальк, карбонат магния и т.п. Как упоминалось выше, композиции могут содержать дополнительные компоненты, такие как белки, углеводороды, витамины, минералы, следовые элементы, аминокислоты, другие биологически или фармакологически активные компоненты, носители, стабилизаторы, вкусовые добавки, другие пробиотические штаммы, пребиотики и т.п.

Штаммы группы 2 являются особенно подходящими для приготовления композиции для лечения или профилактики легочных дисфункций, таких как ХОБЛ, неаллергическая астма, муковисцидоз, проникновение инородного тела в дыхательные пути, эндобронхиальные опухоли, эндотрахеальные опухоли, легочные дисфункции, вызванные неспецифическими вдыхаемыми раздражителями, отек легких, стеноз трахеи или дисфункция голосовых связок. Конечно, штаммы группы 2 могут быть объединены со штаммами, о которых известно, что они обладают противовоспалительной активностью (такие как штаммы группы 1 и/или группы 3). Такие комбинации являются подходящими для лечения или профилактики легочных заболеваний или респираторных заболеваний/нарушений, связанных с воспалением, например аллергической астмы.

Композиции, содержащие один или несколько штаммов, согласно настоящему изобретению, являются подходящими либо для лечения пациентов, уже страдающих легочной дисфункцией, либо могут применяться с профилактической целью субъекта