Способ дифференциации нейрональных клеток из эмбриональных стволовых (эс) клеток

Способ дифференциации нейрональных клеток из эмбриональных стволовых (эс) клеток

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к генерации in vitro нейрональных клеток-предшественников, или прогениторных клеток, или нейронов из полипотентных клеток, особенно эмбриональных стволовых (ЭС) клеток.

Предпосылки создания изобретения

Давно установлено, что полипотентные клетки, например, клетки эмбриональной карциномы (КЭК) и эмбриональные стволовые (ЭС) клетки могут быть дифференцированы в нейроны in vitro. В принципе, работа с ЭС клетками позволяет выделять клетки на определенных стадиях дифференциации и описывать нейрональные клетки-предшественники. ЭС клетки позволяют исследовать молекулярные и генетические пути развития in vitro, и, кроме того, являются мощным источником клеток для трансплантации в мозг для лечения неврологических заболеваний.

Однако осуществление этих и других применений затруднено из-за гетерогенности, беспорядочности и часто невоспроизводимости нейронального развития в культуре клеток. Клеточная гетерогенность является серьезной проблемой использования ЭС клеток для получения нервных клеток (см. ссылки 3 и 4 в списке литературы). Обычно культуры нейрональных клеток, сформировавшиеся из ЭС клеток, содержат множество разных нейрональных подтипов, а также клетки другой природы, включая глиальные клетки. Нехватка достаточно большого количества клеток с определенными и одинаковыми фенотипами является серьезной проблемой в нейробиологии. Ранее не было способа получения нейронов из ЭС клеток, в результате которого образовывалось бы стабильное количество нейронов или определенная популяция нейронов, поэтому нельзя было получать популяции гомогенных клеток в достаточных количествах для того, чтобы описать нейроны мозга с помощью биохимических подходов. Кроме того, взаимосвязи линий дифференцировки нейронов с их непосредственными предшественниками оставались неясными.

Для использования нейронов - производных ЭС клеток для трансплантации желательно получить определенные клетки-предшественницы, дающие определенное поколение клеток, а не смесь клеток, содержащую также те клетки, которые могут продолжать делиться и формировать опухоли (ссылки 3, 4). Гетерогенные клетки также могут вмешиваться в трофические и/или направляющие сигналы из ткани хозяина, которые стимулируют интеграцию имплантированной ткани в мозг. Функционально важен тип имплантированных клеток, например, допаминергические нейроны могут особенно быть востребованы для лечения такой болезни, как болезнь Паркинсона, поэтому для подобных медицинских целей желателен повышенный контроль над клетками-предшественниками и подтипами нейрональных клеток. Понижение гетерогенности клеток необходимо для снижения нежелательных побочных эффектов, риска развития опухолей, а также для повышения терапевтического действия за счет увеличения содержания доли клеток, нейрональная дифференциация которых идет в требуемом направлении.

В последнее время было получено важное достижение, заключающееся в использовании индуктивных сигналов и факторов транскрипции для значительного обогащения подтипов нейронов, в том числе допаминергических нейронов и двигательных нейронов. Таким образом, факторы транскрипции, например, Nurr1 (ссылка 5), или совместное культивирование стволовых клеток с клетками других типов (ссылка 6) значительно увеличивают генерацию допаминергических нейронов, хотя добавление несвойственных факторов, включая обработку звуком, усиливает генерацию двигательных нейронов, которые, что также было установлено, интегрируют в ткань хозяина после трансплантации (ссылка 7). Несмотря на эти достижения, все еще очень мало известно о генерации in vitro конкретных предшественников нервных клеток, которые могут повысить специфичность нейрональных фенотипов.

Имеется ряд протоколов, описывающих генерацию нейрональных и глиальных клеток (ссылки 14, 15, 25-31). Ранее на линии клеток эмбриональной карциномы Р19 было установлено, что обработка скоплений плюропотентных клеток ретиноевой кислотой индуцирует нейрональную дифференциацию (ссылка 32). Впоследствии было установлено, что обработка клеток зародышевых тел (ЗТ), являющихся производными ЭС клеток, РК также индуцирует экспрессию нейральных генов и репрессирует экспрессию мезодермальных генов (ссылка 33). ЗТ представляют трехмерные скопления клеток, возникающие за счет агрегации и пролиферации ЭС клеток. ЗТ могут быть получены культивированием ЭС клеток на основе, с которой они не могут срастись, обычно в чашках для культивирования бактерий (см., например, ссылку 41).

Один из способов генерации нейрональных клеток из ЭС клеток, представленный в работах Bain и др. (ссылка 14) и Li и др. (ссылка 10), включает следующие этапы:

культивирования ЭС клеток,

формирования ЗТ,

обработки ЗТ ретиноевой кислотой (РК),

диссоциации ЗТ и

высева и культивирования клеток диссоциированных ЗТ.

Обычно первоначальную культуру ЭС клеток получают на поддерживающем слое питающих клеток (инактивированных фибробластах) для поддержания ЭС клеток в форме колонии плюропотентных недифференцированных ЭС клеток. Предполагают, что фибробласты поддерживают ЭС клетки на недифференцированной стадии. Фактор подавления лейкоза (ФПЛ) может быть внесен в культуральную среду для подавления дифференциации. Однако было установлено, что даже в присутствии ФПЛ некоторые ЭС клетки проявляют тенденцию к дифференциации, и что при формировании ЗТ могут присутствовать клетки разных линий дифференцировки (ссылки 3, 34).

В способах, предложенных Bain и др. и Li и др. (ссылки 10, 14, 15), культивируемые ЭС клетки обрабатывались трипсином и/или растирались до получения небольших скоплений клеток и затем высевались на неадгезивную клеточную культуру для формирования ЗТ. Клетки культивировали на протяжении 4 суток без РК, а затем на протяжении 4 суток на среде с РК, после чего ЗТ диссоциировали и высевали в чашки с покрытием из ламинина. Высеянные клетки культивировали в средах, содержащих сыворотку.

Bain и др. сообщают, что с помощью описанного метода получали культуру, состоящую из популяции плоских клеток, плотно прикрепленных к покрытому ламинином субстрату, и популяции нейроноподобных клеток, преимущественно расположенных поверх плоских клеток. Отмечено, что примерно 38% клеток после двух суток культивирования обладали нейрональной морфологией. Эти культуры клеток имели смешанный состав из нейронов разных типов, главным образом ГАМКергических нейронов.

Некоторые методы основываются на применении селективных маркеров нейрональных клеток-предшественников, элиминируют, таким образом, во время процесса дифференциации клетки, отличные от нейрональных клеток-предшественников. Клетки-предшественники нервных клеток, полученные из ЭС клеток, преимущественно идентифицировались по экспрессии маркеров промежуточных филаментов, например, нестина (ссылка 9), или по факторам транскрипции, например, генам sox (ссылка 10). Li и др. применяли селекцию поколения дифференцирующих клеток для обогащения гетерогенной популяции клетками, экспрессирующими Sox2, за счет элиминации Sox2-отрицательных клеток (ссылка 10). Несмотря на то что селективные методы показали свою эффективность в обогащении популяции клеток нейрональными клетками-предшественниками, они неэффективны в тех случаях, когда отобранные клетки-предшественники нужно применить для генерации определенных нейрональных фенотипов. Из результатов Li и др. следует, что Sox-положительные клетки могут привести к возникновению клеток большинства типов, обнаруженных в центральной нервной системе (ЦНС), а не потомству определенной субпопуляции. Таким образом, хотя селекция Sox-положительных клеток может повысить долю нейрональных клеток-предшественников в популяции клеток, полученной из ЭС клеток, представляется маловероятным, что такая селекция может применяться для повышения содержания в популяции клеток конкретно одного подтипа нейрональных предшественников или нейронов.

В других известных методах РК не применяется. Например, в методах, использовавшихся Okabe и др. (ссылки 27, 43), РК не применяется, но включена промежуточная стадия культивирования сформированных ЗТ на адгезивном субстрате в специальной среде с последующей диссоциацией. Abe и др. (ссылка 30) также применяют промежуточную стадию, после которой выращенные ЗТ переносятся на субстрат, к которому они могут прикрепиться. Затем ЗТ культивируют в адгезивном состоянии, после чего подвергают диссоциации трипсином.

В некоторых способах, например, Abe и др. (ссылка 30) и Okabe и др. (ссылка 27), включено применение основного фактора роста фибробластов. Abe и др. затем применяют митотические ингибиторы, которые вызывают гибель нейронов и клеток, не относящихся к нейрональным (ссылка 30).

Описание изобретения

В настоящем изобретении описаны средства, с помощью которых дифференциация ЭС клеток в нервные клетки может быть оптимизирована с целью получения удивительных преимуществ, выраженных в генерации поколений определенных нервных клеток и в однородности популяций нервных клеток. Таким образом, настоящее изобретение описывает улучшенные способы индуцированного и/или активированного развития и/или дифференциации ЭС клеток в нейроны, или нейрональные клетки-предшественники, или прогениторные клетки для генерации нервных клеток из ЭС клеток in vitro.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения способы настоящего изобретения позволяют получать в значительной степени однородную популяцию нервных клеток, в которой нервные клетки практически все относятся к одной определенной линии дифференцировки нейрональных клеток, одному фенотипу, типу клеток и/или к одной стадии дифференциации.

В настоящем изобретении подробно описаны разработанные способы получения однородных нейрональных клеток-предшественников, которые были идентифицированы как радиальные глиальные клетки. В ходе последующего культивирования образованные из ЭС клеток радиальные глиальные клетки постепенно дифференцируют в пирамидальные нейроны. Предшественники и нейроны, полученные способами настоящего изобретения, были в основном однородными, причем процентное содержание нейрональных клеток одной линии дифференцировки было выше по сравнению с результатами применения способов, описанных в предшествующем уровне техники.

Таким образом, в более предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения способы настоящего изобретения позволяют получать в значительной степени однородные популяции радиальных глиальных клеток и пирамидальных нейронов, которые являются одними из наиболее важных популяций нейрональных клеток коры головного мозга и которые было сложно получать из ЭС клеток способами, известными на предшествующем уровне техники.

Поскольку полученные согласно настоящему изобретению клетки-предшественники нервных клеток/прогениторные клетки обладают высоким уровнем однородности, эти клетки пригодны для дальнейшей дифференциации и/или созревания для образования нейрональных клеток определенной линии дифференциации. Предшественники нервных клеток/прогениторные клетки могут быть дифференцированы для получения пирамидальных нейронов, согласно описанному в настоящем изобретении способу, или могут быть изменены внешними или внутренними факторами для генерации популяций других нейрональных клеток.

Преимущество в количестве и однородности клеток, обеспечиваемое настоящим изобретением, отличает эти клетки от тех клеток, которые получают способами нейрогенеза и дифференциации нервных клеток предшествующего уровня техники, а также от ограниченного числа первичных нейронов, которые могут быть приготовлены из мозга мыши или крысы.

Биохимические исследования были ранее затруднены из-за ограниченного числа нервных клеток, которые могут быть получены известными методами предшествующего уровня техники. Настоящее изобретение облегчает исследование биохимических и генетических механизмов, вовлеченных в развитие нервных клеток, особенно в превращение предшественников нервных клеток в нейрональные клетки. ЭС клетки легко поддаются генетическому манипулированию, причем их можно получать в неограниченных количествах, и настоящее изобретение является идеально подходящим способом для получения большого числа нейронов определенных линий дифференциации для биохимического исследования.

Кроме того, поскольку эмбриональными стволовыми (ЭС) клетками можно легко генетически манипулировать или изолировать их из мышей, несущих значимые мутации, настоящее изобретение облегчает проведение сравнения нейронов дикого типа с мутантными нейронами и идентификацию механизмов, вызывающих потерю клеток определенного типа при нейродегенеративных заболеваниях. Хотя генетическая манипуляция ЭС клетками не является сложной, манипуляция с первичными нейронами представляет чрезвычайно трудную задачу, особенно устойчивая манипуляция. С помощью генетических манипуляций с ЭС клетками можно получить гомогенную модифицированную линию, в которой все дочерние клетки содержат одну и ту же мутацию, за 1-2 месяца, а получение линии мышей со стабильной мутацией может занять годы. Таким образом, описанные в настоящем изобретении способы получения клеток-предшественников и нейрональных клеток in vitro из ЭС клеток не требуют получения линий трансгенных мышей и, следовательно, позволяют исследовать мутантные нейроны на уровне, который ранее не был доступен и не применялся на практике.

Способы настоящего изобретения также предусматривают систему изучения клеток, а именно нейронов (например, элонгацию нейритов, гибель нейрональных клеток, нейрогенез и синаптогенез). Такие исследования необходимы в данной области, но возможность их осуществления была ограничена, поскольку нейроны нельзя было доступным способом получать в достаточном количестве. Настоящее изобретение позволят получать нейроны в больших количествах и со значительно большей гомогенностью по сравнению с ранее известными способами, что позволяет проводить нейрональные исследования.

Нейроны и/или нейрональные клетки-предшественники/прогениторные клетки, полученные по способу настоящего изобретения, также пригодны для медицинского применения, например, для имплантации в мозг для лечения нейродегенеративного заболевания или потери нервной ткани. Благодаря повышенной гомогенности нервных клеток требуемого подтипа, получаемых согласно настоящему изобретению, терапевтическая эффективность лечения повышается, а риск развития опухолей вследствие имплантации понижается.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам получения или генерации нервных клеток, например, нейронов и/или нейрональных клеток-предшественников /прогениторных клеток, активирующих или индуцирующих дифференциацию ЭС клеток в нейрональные клетки-предшественники или прогениторные клетки, и к способам активирования или индукции дифференциации или созревания клеток-предшественников или прогениторных клеток в нейроны.

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу, позволяющему in vitro индуцировать и/или активировать развитие и/или дифференциацию эмбриональных стволовых (ЭС) клеток в нейрональные клетки-предшественники, или прогениторные клетки, или нейроны, и/или получению или генерации нервных клеток, причем указанный способ включает:

культивирование ЭС клеток,

формирование зародышевых тел (ЗТ),

обработку ЗТ ретиноевой кислотой (РК) и

диссоциацию ЗТ

в комбинации с одним или несколькими дополнительными свойствами или стадиями, описанными ниже.

В способах настоящего изобретения клетки диссоциированных ЗТ являются нейрональными клетками-предшественницами или нейрональными прогениторными клетками. Таким образом, диссоциация ЗТ может образовать культуру нейрональных клеток-предшественниц или прогениторных клеток.

Необязательно способ также включает высев в чашки клеток диссоциированных ЗТ, в результате чего получают культуру поверхностного роста нейрональных клеток-предшественниц или прогениторных клеток.

Способ настоящего изобретения может включать культивирование нейрональных клеток-предшественниц или прогениторных клеток для получения нейронов. Таким образом, в способы некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения включены посевы в чашки и культивирование клеток диссоциированных ЗТ для получения нейронов.

Способы настоящего изобретения дополнительно включают одно или несколько свойств/этапов, описанных ниже. Любое свойство или стадия может использоваться отдельно или в комбинации с любым другим свойством или стадией, если в контексте не показано иначе.

Культура ЭС клеток без использования питающих клеток

Предпочтительно настоящий способ включает культивирование ЭС клеток в отсутствие питающих клеток (обычно инактивированных фибробластов). Способы могут включать первоначальное культивирование ЭС клеток с питающими клетками с последующим культивированием без питающих клеток. Питающие клетки могут быть разбавлены и удалены повторным пассажем ЭС клеток. Предпочтительно, если проведен, по меньшей мере, один, более предпочтительно, по меньшей мере, два пересева без питающих клеток до формирования зародышевых тел. Таким образом, питающие клетки предпочтительно отсутствуют в культуре ЭС клеток, используемой для формирования ЗТ. «Пассаж» включает диссоциацию клеток и повторный высев ряда клеток. Например, пассаж может включать разъединение/диссоциацию клеток из культуры, выращенной в чашках (обычно с применением трипсина), диссоциацию агрегатов клеток, повторный высев ряда диссоциированных ЭС клеток (адгерентная культура) и культивирование ЭС клеток.

Подходящие культуральные клетки описаны в настоящем изобретении. Фактор подавления лейкоза (ФПЛ) необязательно может быть включен в состав культуральной среды для ЭС клеток.

Отбор и высев ЭС клеток для формирования ЗТ

Было установлено, что состояние пролиферации ЭС клеток влияет на их плюропотентность, и что плотность клеток, культивируемых таким способом, воздействует на их способность и тенденцию к дифференциации. Было установлено, что путем отбора и высева пролиферирующих ЭС клеток при той же густоте, что и в контроле, большее число нейрональных клеток-предшественников, относящихся к определенной линии дифференциации клеток, может быть получено, причем клетки являются в меньшей степени гетерогенными.

Способы настоящего изобретения предпочтительно включают отбор высоко пролиферативных и/или морфологически гомогенных ЭС клеток для формирования ЗТ. Предпочтительно способы включают высев измеренного/оцененного/определенного/установленного числа или плотности указанных ЭС клеток для формирования ЗТ. Предпочтительно настоящий способ включает отбор измеренного, оцененного, определенного или установленного числа ЭК клеток для высева для получения ЗТ.

Настоящий способ предпочтительно включает измерение, оценку, наблюдение или определение:

состояния пролиферации ЭС клеток (которое можно измерить или оценить путем определения времени удвоения клеток, увеличения числа клеток или другим приемлемым способом),

морфологии ЭС клеток и/или

числа или плотности ЭС клеток, высеянных для формирования ЗТ.

Таким образом, предпочтительно высевают клетки подсчитанной, определенной или заданной плотности. Подсчет, оценка или определение числа клеток могут быть проведены каким-либо из известных в данной области способов, например, подсчетом клеток в определенной заданной области с помощью микроскопии, или с помощью обычных счетчиков клеток, например, Casy®1 (фирма Schärfe System GmbH). Морфологию клеток изучают с помощью микроскопии.

Каждый из этих пунктов подробно обсуждается ниже.

Получение и отбор клеток с высокой пролиферативной активностью

В качестве клеток с высокой пролиферативной активностью могут применяться клетки, получаемые определенным способом культивирования, описанным в настоящем изобретении. Было установлено, что состояние пролиферации ЭС клеток может варьировать во время осуществления настоящего способа культивирования ЭС клеток.

Культивирование ЭС клеток или их пассаж предпочтительно приводят к получению клеток с высокой пролиферативной активностью. Предпочтительно пассаж повторяют примерно каждые 2 суток, и культура ЭС клеток предпочтительно включает, по меньшей мере, два пассажа на питающие клетки с последующими, по меньшей мере, двумя пассажами без питающих клеток. ЭС клетки следует снять с питающих клеток, когда они пребывают на стадии высокой пролиферативной активности, например, путем отделения в чашке диаметром 10 см ЭС клеток с питающих клеток и пересевом ЭС клеток на среду без питающих клеток (например, взять ¹/₄ объема клеточной суспензии и пересеять в новую среду, объем которой равен первоначальному), что должно опять привести к 60% слиянию культуры ЭС клеток уже на следующие сутки. Пассаж без использования питающих клеток может включать примерно 0,5×10⁵ клеток/см².

Предпочтительно культивирование ЭС клеток включает измерение, оценку или определение числа или плотности ЭС клеток, высеянных для получения клеточной культуры.

ЭС клетки с высокой пролиферативной активностью могут быть ЭС клетками, получаемыми путем культивирования или пересева ЭС клеток, по существу, следующим образом (в норме без питающих клеток):

высев ЭС клеток с плотностью примерно от 0,3×10⁵ до 4×10⁵ клеток/см², например, примерно 0,5-2×10⁵, предпочтительно примерно 1×10⁵ клеток/см², и

выделение/диссоциация ЭС клеток через 2 суток после высева, и, необязательно, повторный высев.

ЭС клетки могут быть выделены путем расщепления (диссоциации) через 2 суток после высева. В норме процедуру культивирования (пассаж) следует проводить, по меньшей мере, 2-3 раза до отбора клеток с высокой пролиферативной активностью для формирования ЗТ.

Например, около 2×10⁶ клеток может быть высеяно в чашку для культивирования площадью 10 см². Описанная выше методика позволяет в норме выделять от 10×10⁶ до 35×10⁶ клеток с площади 10 см² через 2 суток, например, 10-20×10⁶.

Стадия пролиферации может быть измерена в единицах времени удвоения ЭС клеток. Способы настоящего изобретения могут включать измерение времени удвоения ЭС клеток и выбор клеток с высокой пролиферативной активностью. Например, клетки с высокой пролиферативной активностью могут иметь время удвоения 8 ч или меньше, 16 ч или меньше, или 24 ч или меньше, обычно 8-24 ч.

Морфологические признаки

ЭС клетки, применяемые для формирования ЗТ, предпочтительно являются морфологически гомогенными, причем все или почти все ЭС клетки обладают одинаковыми или схожими морфологическими свойствами.

Предпочтительно способы настоящего изобретения включают отбор морфологически гомогенных ЭС клеток для формирования ЗТ и высев этих клеток для формирования ЗТ. Предпочтительно все или почти все (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 98% или, по меньшей мере, 99%) ЭС клетки, выбранные для формирования ЗТ, обладают одним или несколькими, а наиболее предпочтительно всеми, из следующих морфологических признаков (в культуре без питающих клеток): рост в виде плоского монослоя, клетки не находятся в прямом контакте с соседними клетками (но, тем не менее, плотно упакованы), крупные ядра, много ядрышек, клетки не растут поверх друг друга или в виде структур, напоминающих колонии. Предпочтительно клетки плотно упакованы, например, плотность клеток составляет примерно 20×10⁶ клеток на чашку площадью 10 см² (2×10⁶ клеток/см²), предпочтительно примерно 10-30×10⁶ клеток, например, 15-25×10⁶ клеток на чашку площадью 10 см². Настоящий способ может включать контроль за одним или несколькими предпочтительными морфологическими свойствами ЭС клеток и/или отбор клеток, обладающих одним или несколькими из этих признаков.

Морфология клеток также может применяться в качестве индикатора стадии пролиферации. Клетки с высокой пролиферативной активностью предпочтительно имеют один или несколько, предпочтительно все, из перечисленных выше морфологических признаков.

Предпочтительно все культивируемые ЭС клетки являются потомством одной ЭС клетки, например, на раннем этапе способа может проводиться отбор одной колонии ЭС клетки и культивирование ЭС клеток из этой колонии. За счет этого в культуре однородность и гомогенность ЭС клеток, в том числе морфологическая, могут быть повышены.

Плотность высева в чашки

Для формирования ЗТ соответствующие проявляющие высокую пролиферативную активность клетки и/или морфологически гомогенные клетки в норме следует высевать, используя примерно 0,5×10⁶ и 5×10⁶ клеток на 15 мл культуральной среды для формирования ЗТ, предпочтительно 2,5-2,5×10⁶ клеток, например, 3×10⁶ клеток в 15 мл среды. В норме следует высевать примерно 0,3-3,5×10⁵ клеток·мл^-1, предпочтительно 1,6-2,5×10⁵ клеток·мл^-1, наиболее предпочтительно 2×10⁵ клеток·мл^-1. Объем среды 15 мл является предпочтительным, хотя 10 мл или 10-15 мл в норме можно использовать для посева в чашки диаметром 10 см.

Плотность клеток, высеянных для формирования ЗТ, следует корректировать в зависимости от стадии пролиферации применяемых ЭС клеток. Следовательно, если культура ЭС клеток является более плотной, будет высеяно больше клеток, если культура менее плотная, будет высеяно меньше клеток. В настоящей работе было установлено, что наилучшие результаты достигаются при использовании наиболее быстро пролиферирующих ЭС клеток.

В качестве примера, ЭС клетки с гомогенной морфологией, имеющие время удвоения примерно 12-16 ч, могут быть выбраны и высеяны с плотностью примерно 0,5×10⁵ клеток/см².

Диссоциация клеток

В способах настоящего изобретения в основном диссоциация клеток предпочтительно заключается в разъединении клеток (ЭС клеток или ЗТ) для образования суспензии отдельных клеток, главным образом не оставляя агрегатов из более чем 2-3 клеток. Предпочтительно суспензия состоит из целых отдельных диссоциированных клеток (т.е. суспензия не содержит агрегатов клеток). Предпочтительно более 90%, 95%, 98% или 99% клеток в суспензии диссоциировано на отдельные клетки. Предпочтительно менее 5% клеток в суспензии образует агрегаты из 4 или более клеток.

Трипсин (например, 0,05%) и/или растирание могут применяться для диссоциации клеток, используя способы, подробно описанные в настоящем изобретении.

ЭС клетки следует хорошо диссоциировать перед высевом для образования ЗТ. Следовательно, предпочтительно способы настоящего изобретения включают диссоциацию ЭС клеток для формирования суспензии отдельных клеток, практически не содержащую агрегаты более чем из 2-3 клеток. Предпочтительно суспензия является полностью состоящей из отдельных диссоциированных клеток (т.е. суспензия не содержит агрегатов клеток). Предпочтительно более 90%, 95%, 98% или 99% клеток в суспензии диссоциировано на отдельные клетки. Предпочтительно менее 5% клеток в суспензии образует агрегаты из 4 или более клеток.

Способы настоящего изобретения могут включать определение или оценку уровня диссоциации ЭС клеток. Предпочтительно способы включают диссоциацию ЭС клеток и отбор суспензии диссоциированных клеток согласно настоящему изобретению. Микроскопирование или обычные счетчики клеток могут применяться для определения или оценки произошедшей диссоциации. Например, применение счетчика клеток Casy®1 позволяет выявить пики, соответствующие большему диаметру клеток в случае присутствия агрегатов.

Прямая диссоциация клеток ЗТ

Зародышевые тела (ЗТ) выращивают в суспензированной культуре, и затем клетки ЗТ подвергают диссоциации, в результате чего образуется суспензия клеток диссоциированных ЗТ. В норме ЗТ подвергают диссоциации через 8 суток, т.е. на 8-е сутки после высева клеток для образования ЗТ или через 4 суток после добавления РК. Диссоциация может быть выполнена раньше или позже этого срока, но обычно через 3-5 суток после добавления РК. Специалист в данной области может определить экспериментально оптимальное время для диссоциации.

Предпочтительно ЗТ не высевают на адгерентный субстрат перед диссоциацией, а вместо этого поддерживают в неадгерентной культуре до диссоциации клеток. Таким образом, ЗТ предпочтительно следует подвергать диссоциации до посева, а не высевать непосредственно.

Диссоциация ЗТ в норме включает инкубирование ЗТ с трипсином (в норме 0,05% или 0,01-0,5%). Предпочтительно способы настоящего изобретения включают фильтрацию суспензии диссоциированных ЗТ для удаления склеенных клеток, например, клетки могут фильтроваться через сито или фильтр, обычно нейлоновую ячеистую ткань или фильтр. В норме применяется сито или фильтр с ячейками 40 мкм. В вариантах осуществления настоящего изобретения размер пор предпочтительно составляет 20, 30 или 40 мкм, предпочтительно 100, 80, 60 или 50 мкм или менее.

Хранение клеток ЗТ

Способы настоящего изобретения могут включать хранение клеток диссоциированных ЗТ, например, путем замораживания клеток в жидком азоте. Например, хранение может включать центрифугирование клеток, ресуспендирование клеток после центрифугирования в среде для ЗТ+10% ДМСО и замораживание клеток в жидком азоте. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает диссоциацию ЗТ и хранение клеток диссоциированных ЗТ. Таким образом, могут быть легко получены подходящие клетки-предшественники нервных клеток.

Замороженные исходные суспензии клеток могут размораживаться по мере необходимости, например, для высева и культивирования для получения нейронов. Ранее в данной области техники не было публикаций о возможности хранения таких клеток-предшественников для последующего использования. В норме клетки размораживают и немедленно после этого ресуспендируют в среде, обычно в 10 мл среды N2, центрифугируют (обычно в течение 5 мин при 1000 об/мин и комнатной температуре) и ресуспендируют (обычно в среде N2).

Плотность высева клеток диссоциированных ЗТ

При высевах клеток ЗТ было установлено, что плотность высеянных клеток ЗТ является важным показателем для выживания и дифференциации клеток. Слишком разреженно высеянные клетки приводят к снижению их выживаемости, а слишком плотные посевы неблагоприятно влияют на скорость дифференциации. Плотность высева также влияет на чистоту культуры, т.е. на соотношение нейрональных клеток и клеток иного типа. Предпочтительно следует высевать примерно от 0,5×10⁵ до 2,5×10⁵ клеток диссоциированных ЗТ на см², например, примерно 1-2×10⁵, наиболее предпочтительно примерно 1-1,5×10⁵ клеток на см².

Способы настоящего изобретения могут включать измерение, оценку или определение числа или плотности высеянных клеток ЗТ, используя способы, описанные в настоящем изобретении.

Замена культуральной среды

Было установлено, что выраженное значительное увеличение выживаемости клеток достигается, если культуральную среду заменяют примерно через 2 ч после высева клеток диссоциированных ЗТ. Эти открытия создали возможность получения длительно сохраняющихся нейрональных культур, которые ранее не были распространены в данной области.

В этом контексте замена культуральной среды означает обновление или замещение культуральной среды. Новая среда предпочтительно имеет тот же состав, что и среда, в которую клетки диссоциированных ЗТ были первоначально или предварительно высеяны, т.е. на среды того же типа, что и у применявшейся среды. Может применяться среда, близкая по составу, но предпочтителен состав такой же, что и у использовавшейся ранее среды. Например, в качестве среды может использоваться среда N2.

Таким образом, способы, описанные в настоящем изобретении, включают замену культуральной среды с последующей диссоциацией ЗТ и высевом клеток диссоциированных ЗТ в культуральную среду. Предпочтительно культуральная среда заменяется примерно через 1-6 ч после высева.

Культуральная среда может быть заменена в течение 6 ч после высева, предпочтительно в течение 5, 4, 3 или 2,5 ч после высева. Культуральная среда может быть заменена, по меньшей мере, примерно через 1, 1,5 или 2 ч после посева.

Наиболее предпочтительно культуральную среду заменяют примерно через 1-3 ч после посева, более предпочтительно примерно через 1,5-2,5 ч, и наиболее предпочтительно примерно через 2 ч.

Культура высеянных клеток диссоциированных ЗТ

Клетки диссоцированных ЗТ предпочтительно высевают на среду N2.

Через 2 суток среду предпочтительно заменяют подходящей средой для нейрональной дифференциации, например, «полноценной средой» (см. примеры). Выбор и состав среды может зависеть от того, какую линию дифференциации нейрональных клеток хотят получить. Например, основой полноценной среды, применяемой в настоящем изобретении, является среда Бревера, созданная для активации развития пирамидальных нейронов. Другие среды или факторы могут быть выбраны для поддержания разных линий дифференциации нейрональных клеток, например, Shh (сигнальный белок Sonic hedgehog) для получения холинергических двигательных нейронов.

Было установлено, что клетки-предшественники, полученные согласно настоящему изобретению, могут дифференцировать в ряд разных специфических линий дифференциации нейрональных клеток, включая двигательные нейроны, с последующей имплантацией в куриные эмбрионы.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительно, чтобы культуральная среда не содержала ТЗ (трийодтиронин). Применяемая в настоящем изобретении культуральная среда основывается на среде Бревера, но ТЗ в состав среды не входит. Возможно, что ТЗ, обнаруженный в фетальной сыворотке теленка (ФСТ), может ингибировать нейрональную дифференциацию.

Предпочтительно среда Neurobasal не применяется. Среда Neurobasal + добавка В27 (оба продукта могут быть приобретены в фирме GIBCO) обычно использовалась в предшествующем уровне техники для нейрональной культуры. Однако установлено, что среда Neurobasal может активировать развитие глиальных клеток предпочтительнее, чем развитие нейрональных клеток. Следовательно, применение среды Neurobasal может привести к нежелательному присутствию глиальных клеток среди полученных нейрональных клеток. И напротив, установлено, что полноценная среда, применяемая в настоящем изобретении, подавляет развитие глиальных клеток и тем самым способствует нейрональному развитию.

Предпочтительно высеянные в чашки клетки (клетки диссоциированных ЗТ, нейрональные клетки-предшественники/прогениторные клетки) культивируются в отсутствие сыворотки. (Сыворотка может применяться для инактивирования трипсина после диссоциации клеток, но затем ее следует удалить, например, центрифугированием для осаждения клеток и почти полным удалением супернатанта).

Предпочтительно ростовые факторы (особенно EGF, FGF/bFGF и PDGF) не содержатся в культуральных средах и клетки-предшественники или прогениторные клетки не культивируют в присутствии этих или других ростовых факторов.

Способы могут включать культивирование нейронов, причем нейроны также предпочтительно не культивируют в присутствии сыворотки и предпочтительно не культивируют в присутствии ростовых факторов, особенно EGF, FGF/bFGF или PDGF.

Кроме того, способы настоящего изобретения не нуждаются в положительном или отрицательном отборе и предпочтительно не содержат эти стадии, например, генетический отбор по Sox-2, для обогащения нейральными клетками или нейронами, хотя при желании такие стадии отбора могут производиться. Способы настоящего изобретения позволяют получать в значительной степени гомогенные популяции нейральных клеток даже без стадии отбора. Предпочтительно способы настоящего изобретения не включают стадию выбраковки типов клеток, не относящихся к нервным или нейрональным (например, делящихся клеток). Предпочтительно сп