Способ получения аутогенной активированной обогащенной тромбоцитами плазмы для стоматологии

Способ получения аутогенной активированной обогащенной тромбоцитами плазмы для стоматологии

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а также к препаратам, используемым для медицинских целей, содержащим материалы из млекопитающих, в частности содержащим составляющие крови человека, и может быть использовано в стоматологии при хирургическом лечении.

Известен способ получения аутогенной активированной обогащенной тромбоцитами плазмы для стоматологии, в соответствии с которым осуществляют забор крови из локтевой вены в вакуумные пластиковые пробирки объемом 9 мл, внутри которых уже содержится активатор свертывания сыворотки (плазмы). На лабораторной центрифуге фирмы «Heltich» одноэтапно центрифугируют отобранную кровь в этой же пробирке в течение 12 минут при скорости 2600 об/мин. Конечным продуктом является тромбоцитарно-фибриновый гель (М.Ю.Юрченко, А.В.Шумский «Обзор оборудования и методик получения аутогенной обогащенной тромбоцитами плазмы в стоматологии» // журнал «Новое в стоматологии», 2003 г., №7, с.47).

Недостаток известного способа состоит в том, что в нем используют для активации тромбоцитов активаторы животного происхождения или искусственно синтезированные, что снижает физиологичность способа. Кроме того, способ не позволяет получить из отобранного материала максимальное количество тромбоцитов, т.е. максимально использовать отобранный материал, так как в отходы уходит не только осадок красных кровяных телец, но и бедная тромбоцитами плазма. К тому же этот факт снижает экологичность известного способа.

Наиболее близким к предложенному является способ получения аутогенной активированной обогащенной тромбоцитами плазмы для стоматологии, включающий забор крови из локтевой вены шприцем-пробиркой объемом 9 мл, в котором содержится антикаогулянт крови - цитрат. Отобранную кровь в этой же пробирке центрифугируют в два этапа в лабораторной центрифуге «Heraeus Labofuge 300». В первом этапе центрифугируют в течение 12 минут со скоростью 4000 об/мин. Затем образовавшуюся плазму - надосадочный слой, из первого шприца-пробирки набирают в другой шприц-пробирку без цитрата и обрабатывают в центрифуге в течение 15 минут при скорости 3600 об/мин. После отделения бедной тромбоцитами плазмы - надосадочный слой, получают конечный продукт - обогащенную тромбоцитами плазму в количестве 0,3 мл. Активируют обогащенную тромбоцитами плазму препаратом «Cerasorb» - искусственно синтезированным бета-трикальций фосфатом. Для этого «Cerasorb» предварительно смешивают с кровью, взятой из раны, а затем к смеси добавляют обогащенную тромбоцитами плазму (М.Ю.Юрченко, А.В.Шумский «Обзор оборудования и методик получения аутогенной обогащенной тромбоцитами плазмы в стоматологии» // журнал «Новое в стоматологии», 2003 г., №7, с.46).

Недостаток известного способа состоит, прежде всего, в малом количестве конечного продукта: из 9 мл крови получается 0,3 мл обогащенной тромбоцитами плазмы, несмотря на двухэтапность обработки крови центрифугированием, что снижает эффективность известного способа. Это объясняется тем, что в известном способе на каждом этапе используются высокие скорости вращения центрифуги: 4000 и 3600 об/мин, что не позволяет последовательно разделить составляющие крови с учетом их веса и часть тромбоцитов уходит в неиспользуемый осадок. Кроме того, в отходы уходит и бедная тромбоцитами плазма. В результате известный способ не обеспечивает максимальное использование отобранного для получения тромбоцитов материала, что, в свою очередь, не позволяет получить максимальное извлечение тромбоцитов из отобранной крови. Причем, поскольку в известном способе в отходы уходят как осадок красных кровяных телец, образовавшийся после первого центрифугирования, так и бедная тромбоцитами плазма, то это снижает экологичность известного способа.

Кроме того, в процессе приготовления активатора в известном способе используют кровь из раны больного, что небезопасно в отношении возможности внесения инфекции, так как вместе с кровью в активатор могут попасть частицы отмершей ткани, гноя и т.п. Это, а также использование искусственно синтезированного активатора свертывания сыворотки, снижает физиологичность способа.

Таким образом, выявленные в результате патентного поиска способы получения аутогенной активированной обогащенной тромбоцитами плазмы для стоматологии, аналог и наиболее близкий к заявленному, при осуществлении не обеспечивают достижение технического результата, заключающегося в возможности более полного извлечение тромбоцитов из отобранной крови, а следовательно, в повышении эффективности способа, в повышении физиологичности, в снижении безопасности, в повышении экологичности способа, за счет возможности снижения количества отходов после получения конечного продукта по способу.

Заявленный способ получения аутогенной активированной обогащенной тромбоцитами плазмы для стоматологии решает задачу создания соответствующего способа, осуществление которого обеспечивает достижение технического результата, заключающегося в возможности более полного извлечение тромбоцитов из отобранной крови, а следовательно, в повышении эффективности способа, в повышении физиологичности, в снижении безопасности, в повышении экологичности способа за счет возможности снижения количества отходов после получения конечного продукта по способу.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе получения аутогенной активированной обогащенной тромбоцитами плазмы для стоматологии, включающем забор крови из локтевой вены шприцем-пробиркой, центрифугирование отобранной крови в этой же пробирке, перенос плазмы (надосадочная фракция, отделившаяся после цетрифугирования,) в пустую пробирку, центрифугирование вновь отобранного продукта, удаление из пробирки образовавшегося надосадка (плазма, бедная тромбоцитами,) активирование оставшейся в пробирке обогащенной тромбоцитами плазмы, новым является то, что дополнительно осуществляют забор крови вторым шприцем-пробиркой в количестве, составляющем половину объема отобранной крови первым шприцем -пробиркой, которую оставляют в вертикальном положении для свертывания крови, при этом первый шприц-пробирку с отобранной кровью помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении 250 g в течение 10 минут, после чего образовавшуюся плазму переносят в пустую пробирку и центрифугируют с ускорением 1000 g в течение 10 минут, затем пробирку извлекают из центрифуги, после чего образовавшуюся после центрифугирования плазму, бедную тромбоцитами, отделяют от обогащенной тромбоцитами плазмы и переносят в пустую пробирку, затем готовят активатор обогащенной тромбоцитами плазмы, для чего убеждаются, что во втором шприце-пробирке кровь свернулась, после чего пробирку со свернувшейся кровью помещают в центрифугу и центрифугируют с ускорением 1000 g в течение 10 минут, затем пробирку извлекают из центрифуги и переносят образовавшуюся после центрифугирования сгустившейся крови надосадочную жидкость во вторую пустую пробирку, в которую затем добавляют плазму, бедную тромбоцитами, при соотношении масс в частях: 1:1, и тщательно перемешивают, затем капельно, при перемешивании вводят 10% раствор хлористого кальция до получения требуемой консистенции смеси, все тщательно перемешивают, после чего обогащенную тромбоцитами плазму активируют, для этого смешивают с полученным активатором в соотношении масс в частях: 1:3 соответственно. Кроме того, пробирки с плазмой и со свернувшейся кровью центрифугируют одновременно, при этом предварительно убеждаются в том, что во втором шприце-пробирке кровь свернулась.

Технический результат достигается следующим образом. Признаки формулы изобретения: включающем забор крови из локтевой вены шприцем-пробиркой, центрифугирование отобранной крови в этой же пробирке, перенос плазмы (надосадочная фракция, отделившаяся после первого цетрифугирования,) в пустую пробирку, центрифугирование вновь отобранного продукта, удаление из пробирки образовавшегося надосадка, активирование оставшейся в пробирке обогащенной тромбоцитами плазмы, являются основными при получении богатой тромбоцитами плазмы двухэтапным способом. Эти признаки обеспечивают работоспособность заявленного способа, а следовательно, обеспечивают достижение заявленного технического результата.

Известно, что красные кровяные тельца значительно тяжелее тромбоцитов. Авторы изобретения опытным путем пришли к заключению, что для получения в осадке после первого центрифугирования максимального количества красных кровяных телец достаточно ускорения 250 g. Оптимальное время центрифугирования, при котором в осадок выпадает максимальное число красных кровяных телец, также получено опытным путем авторами заявленного способа и составляет 10 минут. Поскольку в заявленном способе первый шприц-пробирку с отобранной кровью помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении 250 g, то в осадок выпадают красные кровяные тельца как более тяжелые, а тромбоциты как более легкие остаются в надосадочном слое - в плазме. Выбор режима центрифугирования на первом этапе обеспечивает максимальное отделение красных кровяных от тромбоцитов, что способствует более полному извлечению тромбоцитов из отобранной крови и повышает эффективность заявленного способа.

Признаки формулы: «…после чего образовавшуюся плазму переносят в пустую пробирку и центрифугируют…, … образовавшуюся после центрифугирования плазму, бедную тромбоцитами, отделяют от обогащенной тромбоцитами плазмы…» обеспечивают возможность выполнения второго заключительного этапа получения богатой тромбоцитами плазмы, а следовательно, обеспечивают возможность выполнения заявленного способа и достижение заявленного технического результата. Параметры центрифугирования на втором этапе: с ускорением 1000 g в течение 10 минут, получены авторами заявленного способа опытным путем и являются оптимальными для получения максимального количества тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме, что повышает эффективность заявленного способа.

Как показал опыт, благодаря оптимальному подбору режимов центрифугирования, используемый в заявленном способе прием двухэтапного центрифугирования обеспечивает более полное извлечение тромбоцитов из отобранной крови, по сравнению с прототипом, а именно: из 9 мл крови получают 1,5 мл обогащенной тромбоцитами плазмы, в то время как в прототипе из этого же объема отобранного материала получают 0,3 мл обогащенной тромбоцитами плазмы. В результате благодаря оптимальному подбору режимов центрифугирования обеспечивается более полное извлечение тромбоцитов из отобранной крови, что повышает эффективность заявленного способа.

В заявленном способе для активации обогащенной тромбоцитами плазмы используют активатор, который готовят из крови этого же больного, а именно: для активации тромбоцитов в обогащенной плазме используют фибриноген, содержащийся в крови, взятой у этого же больного. Это позволяет отказаться от использования для активации богатой тромбоцитами плазмы бычьим тромбином или искусственно синтезированными активаторами. Кроме того, для приготовления используют только продукты центрифугирования, которые получены из стерильных пробирок. В результате в заявленном способе обеспечивается и повышается, по сравнению с прототипом, безопасность способа, а следовательно, повышается и физиологичность способа.

Для изготовления активатора дополнительно осуществляют забор крови вторым шприцем-пробиркой в количестве, составляющем половину объема отобранной крови первым шприцем-пробиркой. Объем крови, необходимый для получения в достаточном количестве фибриногена, определен авторами изобретения опытным путем и является оптимальным. Этот объем крови обеспечивает в дальнейшем получение фибриногена в количестве, достаточном для активации всего объема обогащенной тромбоцитами плазмы, полученной из отобранного материала - крови больного, в соответствии с заявленным способом, что обеспечивает повышение эффективности заявленного способа. Благодаря тому, что пробирку с кровью для получения активатора оставляют для свертывания крови, причем в вертикальном положении, в результате свертывания крови в нижней части пробирки скапливаются эритроциты как наиболее тяжелые. При этом в надосадочной жидкости концентрируется фибриноген как более легкий. Для окончательного отделения от фибриногена эритроцитов, а также других более тяжелых составляющих крови предварительно убеждаются, что во втором шприце-пробирке кровь свернулась, после чего пробирку со свернувшейся кровью помещают в центрифугу и центрифугируют с ускорением 1000 g в течение 10 минут. Режим центрифугирования получен авторами опытным путем и является оптимальным для извлечения из крови больного максимального количества фибриногена, что повышает эффективность заявленного способа. После центрифугирования вторую пробирку извлекают из центрифуги и переносят надосадочную жидкость, образовавшуюся после центрифугирования сгустившейся крови, во вторую пустую пробирку, тем самым отделяют от образовавшегося осадка надосадочную жидкость, содержащую фибриноген. При этом, благодаря предложенному режиму центрифугирования, в надосадочной жидкости фибриноген содержится в максимальном количестве.

Для повышения эффективности способа, за счет сокращения времени приготовления активатора, пробирки с плазмой и со свернувшейся кровью центрифугируют одновременно, при этом предварительно убеждаются в том, что во втором шприце-пробирке кровь свернулась.

Бедная тромбоцитами плазма также содержит в своем составе фибриноген. Благодаря тому, что в заявленном способе бедную тромбоцитами плазму добавляют в надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования свернувшейся крови, общее количество фибриногена увеличивается без увеличения общего объема крови, забираемой у больного. При этом увеличение количественного содержания фибриногена обеспечивает полную, уверенную активацию тромбоцитов в обогащенной плазме. Это обеспечивает физиологичность способа. Кроме того, использование бедной тромбоцитами плазмы снижает в заявленном способе, по сравнению с прототипом, общее количество отходов после обработки крови, что повышает экологичность заявленного способа.

Добавление бедной тромбоцитами плазмы в надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования свернувшейся крови, при соотношении масс в частях: 1:1, является оптимальным, получено авторами изобретения опытным путем и обеспечивает содержание фибриногена в полученной жидкой фракции в количестве, необходимом для активации в полном объеме богатой тромбоцитами плазмы, полученной заявленным способом. При этом тщательное перемешивание составляющих обеспечивает равномерное распределение фибриногена в жидкой среде. В результате повышается эффективность заявленного способа.

Введение в полученную смесь 10% раствора хлористого кальция запускает реакцию полимеризации фибриногена, в результате которой образуется фибриновый сгусток. Капельное введение 10% раствора хлористого кальция при перемешивании до получения требуемой консистенции смеси обеспечивает возможность регулирования консистенции активатора (плотности фибринового сгустка), что, в свою очередь, позволяет получить требуемую плотность сгустка активированной обогащенной тромбоцитами плазмы. В результате смешивания обогащенной тромбоцитами плазмы с полученным активатором начинается реакция дегрануляции тромбоцитов, т.е. их активация. Смешивание богатой тромбоцитами плазмы с полученным активатором в соотношении 1:3 соответственно обеспечивает активацию богатой тромбоцитами плазмы в полном объеме, что повышает эффективность заявленного способа.

Кроме того, в процессе приготовления активатора тромбоциты, содержащиеся в бедной тромбоцитами плазме, активируются и после активации богатой тромбоцитами плазмы дополняют общее количество активированных тромбоцитов в конечном продукте. В результате заявленный способ обеспечивает максимальное извлечение тромбоцитов из отобранной у пациента крови, что повышает эффективность заявленного способа.

В результате выполнения заявленного способа получаем выходной продукт для стоматологии: аутогенную активированную обогащенную тромбоцитами плазму в виде сгустка активированных тромбоцитов с повышенным содержанием фибрина, полностью приготовленную из крови больного. При этом активированные тромбоциты являются фактором роста, которые участвуют в регулировании роста и функционировании клеток при регенерации пародонтальных тканей, а фибрин участвует в процессе остеокондукции. Кроме того, поскольку и в бедной тромбоцитами плазме, и в надосадочной жидкости после центрифугирования свернувшейся крови присутствуют лейкоциты, то они содержатся и в конечном продукте, обеспечивая при его непосредственном применении местное антибактериальное действие. При этом основное достоинство способа состоит в том, что активированная обогащенная тромбоцитами плазма готовится полностью из крови самого больного, что исключает риск введения в организм больного несовместимых с кровью больного биологических тел и минимизирует риск инфекционного заражения. Все это повышает безопасность, физиологичность и эффективность заявленного способа. При этом возможность использования бедной тромбоцитами плазмы для приготовления активатора снижает количество отходов при получении богатой тромбоцитами плазмы, что повышает экологичность заявленного способа.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что заявленный способ получения аутогенной активированной обогащенной тромбоцитами плазмы для стоматологии при осуществлении обеспечивает достижение технического результата, заключающегося в возможности более полного извлечения тромбоцитов из отобранной крови, а следовательно, в повышении эффективности способа, в повышении физиологичности, в снижении безопасности, в повышении экологичности способа за счет возможности снижения количества отходов после получения конечного продукта по способу.

Заявленный способ получения аутогенной активированной обогащенной тромбоцитами плазмы для стоматологии выполняют следующим образом. Выполняют забор крови из локтевой вены больного первым шприцем-пробиркой. Дополнительно осуществляют забор крови вторым шприцем-пробиркой в количестве, составляющем половину объема отобранной крови первым шприцем-пробиркой. Второй шприц-пробирку оставляют в вертикальном положении для свертывания крови. Первый шприц-пробирку с кровью помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении 250 g в течение 10 минут, после чего образовавшуюся плазму переносят в пустую пробирку. Убеждаются, что во втором шприце-пробирке кровь свернулась, после чего пробирки с плазмой и со свернувшейся кровью помещают в центрифугу и центрифугируют с ускорением 1000 g в течение 10 минут. Затем пробирки извлекают из центрифуги, после чего образовавшуюся после центрифугирования плазмы бедную тромбоцитами плазму отделяют от обогащенной тромбоцитами плазмы и переносят в пустую пробирку. После этого готовят активатор обогащенной тромбоцитами плазмы, для чего образовавшуюся после центрифугирования сгустившейся крови надосадочную жидкость переносят во вторую пустую пробирку, в которую затем добавляют плазму, бедную тромбоцитами, при соотношении масс в частях: 1:1, и тщательно перемешивают, затем капельно, при перемешивании вводят 10% раствор хлористого кальция до получения требуемой консистенции смеси, все тщательно перемешивают. После чего обогащенную тромбоцитами плазму активируют, для этого ее смешивают с полученным активатором при соотношении масс в частях: 1:3 соответственно.

При осуществлении способа использовали лабораторную центрифугу, обеспечивающую ускорение не менее 1000 g. Для забора крови из локтевой вены больного использовали стандартную систему с бабочкой. Все пробирки в способе использовали стерильные. Для основного забора крови использовали шприц-пробирку объемом 9 мл типа EDTA/K2-Gel; для дополнительного забора крови использовали шприц-пробирку типа Serum Gel S/4,7; пробирка третья - пробирка с мерными делениями и плотно закрывающей пробкой; пробирка четвертая с плотно закрывающей пробкой типа Vacutainer, объемом 7 мл; пробирка пятая с плотно закрывающей пробкой типа Vacutainer, объемом 10 мл. Переливание жидкостей осуществляли посредством стерильных пастеровских пипеток.

Рекомендуется для оптимального использования центрифуги и для максимального снижения вибрации, что важно для полного оседания частиц крови, использовать четное число пробирок, например, две при основном заборе крови - первые пробирки и две при дополнительном - вторые пробирки.

После центрифугирования плазму из первых пробирок переносят соответственно в третьи пробирки. Количество плазмы в пробирках выравнивают переливанием друг в друга. Из третьих пробирок после центрифугирования бедную тромбоцитами плазму сливают в четвертую пробирку, а оставшуюся в третьих пробирках обогащенную тромбоцитами плазму сливают в одну третью пробирку. После чего готовят активатор обогащенной тромбоцитами плазмы. Надосадочную жидкость из вторых пробирок сливают в пятую пробирку. К содержимому пятой пробирки добавляют в плазму, бедную тромбоцитами, при соотношении масс в частях: 1:1, и тщательно перемешивают. Затем капельно, при перемешивании вводят 10% раствор хлористого кальция до получения требуемой консистенции смеси, все тщательно перемешивают. Затем обогащенную тромбоцитами плазму активируют, для чего смешивают с активатором в соотношении 1:3 соответственно.

При использовании заявленного способа из 9 мл крови, забираемой у больного, было получено 1,5 мл обогащенной тромбоцитами плазмы.

1. Способ получения аутогенной активированной обогащенной тромбоцитами плазмы для стоматологии, включающий забор крови из локтевой вены шприцем-пробиркой, центрифугирование отобранной крови в этой же пробирке, перенос плазмы (надосадочная фракция, отделившаяся после центрифугирования) в пустую пробирку, центрифугирование вновь отобранного продукта, удаление из пробирки образовавшегося надосадка (плазма, бедная тромбоцитами), активирование оставшейся в пробирке обогащенной тромбоцитами плазмы, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют забор крови вторым шприцем-пробиркой в количестве, составляющем половину объема отобранной крови первым шприцем-пробиркой, которую оставляют в вертикальном положении для свертывания крови, при этом первый шприц-пробирку с отобранной кровью помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении 250 g в течение 10 мин, после чего образовавшуюся плазму переносят в пустую пробирку и центрифугируют с ускорением 1000 g в течение 10 мин, затем пробирку извлекают из центрифуги, после чего образовавшуюся после центрифугирования плазму, бедную тромбоцитами, отделяют от обогащенной тромбоцитами плазмы и переносят в пустую пробирку, затем готовят активатор обогащенной тромбоцитами плазмы, для чего убеждаются, что во втором шприце-пробирке кровь свернулась, после чего пробирку со свернувшейся кровью помещают в центрифугу и центрифугируют с ускорением 1000 g в течение 10 мин, затем пробирку извлекают из центрифуги и переносят образовавшуюся после центрифугирования сгустившейся крови надосадочную жидкость во вторую пустую пробирку, в которую затем добавляют плазму, бедную тромбоцитами, при соотношении масс в частях: 1:1, и тщательно перемешивают, затем капельно при перемешивании вводят 10%-ный раствор хлористого кальция до получения требуемой консистенции смеси, все тщательно перемешивают, после чего обогащенную тромбоцитами плазму активируют, для этого ее смешивают с полученным активатором при соотношении масс в частях: 1:3 соответственно.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пробирки с плазмой и со свернувшейся кровью центрифугируют одновременно, при этом предварительно убеждаются в том, что во втором шприце-пробирке кровь свернулась.