Способ определения чувствительности бактерий к действию бактериолитических ферментов - лизоцима или лизостафина

Способ определения чувствительности бактерий к действию бактериолитических ферментов - лизоцима или лизостафина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биомедицинских измерительных технологий, а именно к способам определения степени чувствительности бактерий к повреждающему действию бактериолитических ферментов.

В частности, изобретение предназначено для определения чувствительности бактерий к лизоциму (ЕС 3.2.1.17) или лизостафину (ЕС 3.4.99.17) - ферментам, осуществляющим гидролиз соответственно гликановой [Chipman D.M., Pollock J.J., Sharon N. Lysozyme-catalyzed hydrolysis and transglycosylation reactions of bacterial cell wall oligosaccharides. J Biol Chem. 1968 Feb 10; 243(3):487-96] и пептидной [Bunn W.J., Heath H.E., LeBlanc P.A., Sloan G.L. Wall-associated processing of extracellular enzymes of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus. FEMS Microbiol Lett. 1998 Aug 1; 165(1):123-7] составляющих полимерной молекулы пептидогликана в клеточной стенке микроорганизмов.

Решение данной задачи определяется необходимостью количественной оценки степени чувствительности микроорганизмов к разрушающему действию лизоцима или лизостафина: изолированно, а также в сочетании с другими воздействиями (антибиотиками, сывороточными факторами, ауторегуляторами бактериального роста и др.), что может использоваться при доклиническом или клинико-лабораторном обосновании показаний к проведению ферментотерапии бактериальных инфекций в медицине [Мурашова Н.С. с соавт. Лизоцим в комплексной терапии больных с ожоговой травмой. Антибиотики, 1975, №4, с.369-373; Kiri N., Archer G., Climo M.W. Combinations of lysostaphin with beta-lactams are synergistic against oxacillin-resistant Staphylococcus epidermidis. Antimicrob Agents Chemother. 2002 Jun; 46(6):2017-20] и ветеринарии [Gruet P., Maincent P., Berthelot X., Kaltsatos V. Bovine mastitis and intramammary drug delivery: review and perspectives. Adv Drug Deliv Rev. 2001 Sep 1;50(3):245-59], а также при управлении процессом лизиса бактериальной биомассы в биотехнологическом производстве.

Таким образом, заявляемый способ предназначен для использования в лабораториях биомедицинского профиля, решающих вопросы использования лизоцима и лизостафина в исследовательских, биотехнологических или терапевтических целях.

Уровень техники

Существующие подходы к определению чувствительности/устойчивости бактерий к действию бактериолитических ферментов основаны на оценке выраженности лизиса (ферментативно инициированного разрушения) тестируемых микроорганизмов по сравнению с контролем - теми же микроорганизмами, инкубированными вне контакта с бактериологическими ферментами. При этом анализ патентной и специальной технической литературы позволяет констатировать, что весь спектр подходов к определению чувствительности бактерий к действию бактериолитических ферментов представлен двумя основными группами способов, первые из которых основаны на учете результатов бактериолиза на твердых питательных средах, а вторые используют принцип детекции изменения оптической плотности тестируемых микроорганизмов в жидкой фазе (так называемые «турбидометрические» методы).

Основным принципом, лежащим в основе первой группы способов, является диффузия в агар. Для этого исследуемые культуры засеваются на плотные питательные среды, поверх которых (на дисках, в цилиндриках и т.д.) наносятся литические ферменты. Учет степени чувствительности к ферментам ведется по диаметру зон лизиса, а контролем служит наличие роста на удалении от внесенного фермента [Hawiger J. Frequency of staphylococcal lysozyme production tested by plate method. J Clin Pathol. 1968 May; 21(3):390-3].

Преимуществом данной группы способов является возможность тестирования одного микроорганизма на чувствительность сразу к нескольким бактериолитическим ферментам. В свою очередь их недостатками являются: 1) полуколичественный характер результатов исследования; 2) зависимость результатов от диффундирующей способности фермента; 3) длительное время проведения исследования, определяемое скоростью роста тестируемого микроорганизма.

Вторая группа способов первоначально была предложена для решения иной задачи - оценки активности ферментов. В частности, оценку активности лизоцима проводят на основе тестирования его литической способности по отношению к специально отобранной бактериальной культуре Micrococcus luteus var. lysodeicticus [Бухарин О.В. и др. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. Томск, 1974, с.37-42]. Для этого в измерительную кювету фотоэлектрокалориметра (ФЭК) вносят 2 мл суспензии микрококка в 1/15 М фосфатном буфере (рН 6,2) и 0,5 мл раствора лизоцима. Смесь инкубируют 30 минут при 37°С, после чего проводят учет оптической плотности на ФЭК при длине волны 540 нм против 2,5 мл фосфатного буфера. Соответственно, мерой активности лизоцима служит разница оптических плотностей через 30 минут инкубации между контрольным образцом, состоящим из 2 мл стандартизированной суспензии интактных клеток Micrococcus luteus var. lysodeicticus + 0,5 мл 1/15 М фосфатного буфера, и опытной пробой, что после пересчета по калибровочной кривой позволяет определить концентрацию лизоцима в мкг/мл. В свою очередь турбидометрический метод определения активности лизостафина основан на анализе оптической плотности культуры Staphylococcus aureus, определяемой при 620 нм и длине светового пути 1 см до и после контакта с этим ферментом. При этом за единицу активности лизостафина принимают количество фермента, вызывающее пятидесятипроцентное снижение определяемого параметра в 6 мл реакционной смеси за 10 мин в 0,01 М фосфатном буфере с рН 7,5 [Schindler С.A., Schuhardt V.T. Purification and properties of lysostaphin - a lytic agent for Staphylococcus aureus. Biochim Biophys Acta. 1965 Feb 15; 97:242-50].

Несмотря на широкое распространение описанных выше способов они обладают рядом существенных недостатков, заключающихся в плохой воспроизводимости и невысокой точности - значительном разбросе определяемых значений при тестировании одной и той же пробы. В этой связи дальнейшие попытки совершенствования турбидометрических методов оценки активности бактериолитических ферментов были связаны с анализом кинетики ферментного лизиса.

Так, Marova I. и Kovar J. [Marova I., Kovar J. Spectrophotometric detection of bacteriolytic activity of diluted lysostaphin solutions. Folia Microbiol (Praha). 1993; 38(2):153-8] для оценки активности лизостафина предложено определение вызываемого им изменения оптической плотности культуры Staphylococcus aureus SA812 во времени, при этом в качестве количественного параметра активности фермента ими использована величина, соответствующая снижению регистрируемой при 540 нм оптической плотности реакционной смеси на 0,01 ед. за 1 минуту при 37°С. Проведенная апробация подобного кинетического способа в сравнении с описанным выше измерением «по конечной точке» позволила продемонстрировать его более высокую точность, особенно при исследовании низких концентраций фермента.

По совокупности признаков подобный способ может быть признан наиболее близким к заявляемому (способ-прототип). Однако попытки его использования для решения заявленных целей заставляют констатировать существование ряда причин, препятствующих получению требуемого результата, а именно:

1) способ ориентирован на определение активности фермента, но не обратной величины, характеризующей чувствительность к нему бактериальной клетки;

2) не известен параметр, которым можно количественно характеризовать чувствительность бактерий к повреждающему действию бактериолитических ферментов;

3) не определены технические условия (концентрация клеток, фермента и др.) для осуществления подобного измерения.

Таким образом, подводя итог данному разделу описания изобретения, следует указать, что заявляемый способ не известен из уровня техники, т.е. является новым.

Сущность изобретения.

Основной задачей, на решение которой направлен заявляемый способ, является количественная оценка чувствительности бактерий к повреждающему действию бактериолитических ферментов: лизоцима или лизостафина.

Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее:

- чувствительность бактерий к повреждающему действию бактериолитических ферментов может быть определена при анализе кинетики изменения оптической плотности смеси «бактерия: фермент» и количественно охарактеризована величиной максимальной скорости их лизиса (V_max), описываемой величиной, соответствующей лизису 1 бактериальной клетки в 1 миллилитре реакционной смеси за 1 секунду.

Соответственно, при реализации заявляемого способа характеристика действий, порядок их выполнения и условия осуществления в сравнении со способом-прототипом представляются следующим образом.

1) На первом (подготовительном) этапе бактериальные клетки-мишени выращивают на плотной питательной среде при температуре 37°С в течение 20-24 часов. Культуру смывают 0,9% раствором NaCl и отмывают от остатков среды центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут, после чего супернатант удаляют, а сами бактериальные клетки ресуспендируют в буфере, рН которого оптимален для протекания ферментативной реакции: рН 6,2 при определении чувствительности бактерий к лизоциму или рН 7,5 при определении их чувствительности к лизостафину. Оптическую плотность суспензии измеряют в кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 540 нм и устанавливают на уровне 0,5 ед.

Кроме того, на предварительном этапе определяют абсолютное количество бактерий в 1 мл подобной суспензии одним из доступных методов (например, методом серийных разведений), на основании чего вычисляют величину k - коэффициент пересчета, переводящий величины оптической плотности в количество бактериальных клеток в 1 миллилитре суспензии.

Содержание этапа - подготовка бактериальных клеток-мишеней.

2) На втором (основном) этапе приготовленную суспензию испытуемых бактериальных клеток в объеме 2,8 мл вносят в термостатируемую при 37°С кювету с длиной оптического пути 1 см, в которую добавляют 0,2 мл раствора фермента: раствора лизоцима с концентрацией 10 мкг/мл или раствора лизостафина с концентрацией 2,5 мкг/мл. Компоненты интенсивно перемешивают, после чего проводят замер оптической плотности созданной реакционной смеси по сравнению с контролем - 3 мл буфера. Замер оптической плотности производят в непрерывном режиме через каждые 10 секунд с момента внесения раствора фермента в течение 600 секунд.

Содержание этапа - регистрация кинетики лизиса бактериальных клеток по динамике изменения оптической плотности смеси «бактерия: фермент».

3) На третьем (завершающем) этапе оценивают степень чувствительности бактерий к повреждающему действию бактериолитических ферментов по максимальной скорости их лизиса, которую выражают в литических единицах (ЛЕ), где 1 ЛЕ соответствует лизису 1 бактериальной клетки в 1 секунду в объеме 1 мл. Для этого на координатной плоскости, где на оси абсцисс нанесены градации времени (в секундах), а по оси ординат - единицы оптической плотности, строят график изменения определяемого параметра (оптической плотности реакционной смеси при 540 нм) за период измерения (чертеж). После этого на участке, соответствующем периоду быстрого лизиса, проводят касательную и экстраполируют значения на ось ординат, где ОП₁ - величина оптической плотности начала периода быстрого лизиса, а ОП₂ - его конца. Далее расчет максимальной скорости литической реакции производят по формуле:

,

где Δt - продолжительность периода быстрого лизиса, k - коэффициент пересчета, переводящий величины оптической плотности в количество бактериальных клеток.

Возможность получения технического результата при выполнении перечисленных действий в указанных интервалах значений определяется следующим комплексом причинно-следственных связей.

1) Заявителями экспериментально установлено, что кинетические кривые лизиса бактериальных клеток-мишеней имеют общий S-образный вид (чертеж), при этом их анализ позволяет определять следующие параметры:

а - длительность фазы латенции (Т_лат): от момента формирования литической системы «бактерия: фермент» до первой точки перегиба - Т_пер1, единица измерения - секунда. В течение данной фазы, наступающей сразу после смешивания фермента и субстрата, не наблюдается лизиса бактериальных клеток-мишеней, что может быть объяснено корпускулярным характером последних. В результате для разрушения бактериальной клетки-мишени недостаточно нанести ей одиночное повреждение: для наступления лизиса необходимым является множественное повреждение клеточной стенки бактериолитическим ферментом. Данное наблюдение принципиально важно, т.к. в отличие от классической ферментативной кинетики максимальная скорость реакции в данном случае регистрируется не на первой секунде после контакта фермента и субстрата, а несколько позже.

б - V_max (максимальная скорость лизиса); единица измерения - 1 ЛЕ (литическая единица), соответствующая разрушению 1 бактериальной клетки под действием бактериолитического фермента за 1 секунду в 1 мл реакционной смеси. Максимальная скорость лизиса определяется на участке, характеризующемся наибольшим относительным снижением значения оптической плотности смеси «бактерия: фермент» во времени.

в - время достижения максимальной скорости лизиса - Т_Vmax, единица измерения -секунда.

г - время перехода от быстрого к медленному лизису - вторая точка перегиба -Т_пер2, единица измерения - секунда. Подобная двухфазность кривой лизиса объясняется накоплением в смеси продуктов гидролиза, тормозящих скорость реакции по принципу отрицательной обратной связи.

д - ОП₆₀₀/ОП₀; единица измерения - процент. Характеризует соотношение итогового (к 600-й секунде ферментативной реакции) и начального содержания бактериальных клеток-мишеней в пробе.

2) В результате анализа экспериментально полученных кинетических кривых (варианты: различное содержание фермента при идентичном содержании бактериальных клеток, одинаковое содержание фермента при различном содержании бактериальных клеток) заявителями сформулированы следующие выводы:

а - параметры Т_пер1, T_Vmax, Т_пер2 определяются с большой погрешностью, будучи одновременно нелинейно связанными с активностью литической реакции: описываются гиперболой первого порядка, что делает их малопригодными для количественной оценки ферментативного лизиса.

б - параметр ОП₆₀₀/ОП₀, характеризующий результат реакции к 600-й секунде существования смеси «бактерия: фермент», описывается регрессией типа логистической кривой, что также снижает его привлекательность в плане количественной оценки эффективности лизиса. В частности, при его использовании бактерии, демонстрирующие различную кинетику реакции бактериолиза, могут быть оценены как достоверно не отличающиеся по параметру ОП₆₀₀/ОП₀ в силу «схождения» конечных величин оптической плотности к 600-й секунде протекания реакции до неотличимых значений.

в - параметр V_max прямо пропорционально зависит от эффективности литической реакции, при этом прямая, описывающая данную регрессию, выходит из точки начала координат и может иметь различный угол наклона, зависящий от исходного содержания бактериальных клеток или фермента в пробе. Сказанное позволяет рассматривать максимальную скорость лизиса (V_max) и ее меру - ЛE как параметр, наиболее пригодный для количественной оценки степени чувствительности бактериальных клеток к действию бактериолитических ферментов.

3) При определении оптимального количества бактериальных клеток в пробе, позволяющего наиболее точно оценивать активность литической реакции (вариант эксперимента: различная исходная оптическая плотность испытуемой культуры при одинаковом количестве вносимого фермента - лизоцима или лизостафина), выявлено:

а - с увеличением концентрации бактериальных клеток-мишеней параметры Т_пер1, T_Vmax, Т_пер2 имеют тенденцию к уменьшению, при этом Т_лат стремится к нулю. В этих же условиях величина V_max, напротив, возрастает, в результате чего график, описывающий линейную регрессию в системе «V_max - количество фермента», становится более «крутым», а абсолютный разрыв в ряду значений V_max для бактерий, характеризующихся различной чувствительностью к действию бактериолитических ферментов, становится более значительным.

Таким образом, при определении чувствительности бактериальных клеток к действию бактериолитических ферментов целесообразным представляется создание максимально возможного содержания испытуемых клеток в пробе.

б - бесконечное увеличение содержания испытуемых клеток в пробе невозможно, так как вторым необходимым условием для осуществления способа является наличие линейной зависимости между величиной оптической плотности и количеством бактериальных клеток, без чего трансформация шкалы оптической плотности в шкалу содержания бактериальных клеток в пробе с последующим вычислением значений ЛЕ оказывается невозможной. С целью определения максимально возможного исходного содержания бактериальных клеток-мишеней в пробе были изучены соотношения «количество бактерий: оптическая плотность (ОП) при 540 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см», что позволило констатировать существование линейной связи между данными параметрами только в диапазоне ОП от 0 до 0,5 ед. При дальнейшем же повышении содержания бактерий в пробе данная зависимость утрачивала линейный характер и имела тенденцию к «перегибу» с выходом на «плато» при ОП>2,5 ед., в результате чего двукратное увеличение содержания бактерий вело уже к менее чем двукратному приросту оптической плотности.

Таким образом, оптимальным количеством бактериальных клеток в пробе, позволяющим наиболее точно оценивать эффективность литической реакции, является их содержание, соответствующее величине оптической плотности 0,5 ед. при проведении измерений на длине волны 540 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. При этом, в каждом конкретном случае, для расчета величин ЛЕ необходимым является предварительное определение соответствия «количество бактериальных клеток в единице объема: оптическая плотность» с использованием одного из доступных для пользователя методов (например, методом серийных разведений).

4) При определении оптимального количества фермента, внесение которого позволяет наиболее точно оценивать эффективность литической реакции (вариант эксперимента: идентичная оптическая плотность испытуемой культуры при различном количестве вносимого фермента - лизоцима и лизостафина), выявлено, что с увеличением концентрации фермента параметры Т_пер1, T_Vmax, Т_пер2 имеют тенденцию к уменьшению, при этом Т_лат стремится к нулю, а величины ОП₆₀₀/ОП₀ и V_max, напротив, возрастают.

В то же время использование как относительно малых, так и достаточно высоких концентраций фермента ведет к формированию неотличимых при тестировании различных микроорганизмов значений ОП₆₀₀/ОП₀ и V_max. В силу данного обстоятельства и с учетом требования по обеспечению наибольшего разрыва в ряду значений V_max для бактерий, характеризующихся различной чувствительностью к действию бактериолитических ферментов, в качестве оптимальной концентрации лизоцима в пробе заявителями установлена величина 10 мкг/мл, а для лизостафина - 2,5 мкг/мл.

Таким образом, резюмируя приведенные выше материалы о сущности заявляемого способа, характеристике действий, порядке их выполнения и условия осуществления, можно констатировать, что заявляемый способ не следует из уровня техники и по этому показателю должен быть оценен как соответствующий критерию «изобретательский уровень».

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Последовательность выполнения действий при осуществлении заявляемого способа, их условия и режимы являются следующими.

1) Выделяют чистую культуру бактериальных клеток одним из доступных способов.

2) Перед проведением исследования испытуемые бактериальные клетки выращивают на плотной питательной среде при температуре 37°С в течение 20-24 часов.

3) Выращенную биомассу смывают 0,9% раствором NaCl и отмывают от остатков среды центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут, после чего супернатант удаляют, а сами бактериальные клетки ресуспендируют в буфере, рН которого оптимален для протекания ферментативной реакции (по формуле изобретения рН 6,2 при определении чувствительности бактерий к лизоциму, рН 7,5 при определении чувствительности к лизостафину).

4) Измеряют оптическую плотность суспензии в кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 540 нм и устанавливают ее на уровне 0,5 ед.

5) Из суспензии отбирают 0,1 мл, из которого делают ряд десятикратных разведений, которые наносят на плотные питательные среды. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 20-24 часов, после чего подсчитывают количество выросших бактерий и вычисляют соотношение «оптическая плотность: количество бактериальных клеток в единице объема», которое выражают величиной k - коэффициентом пересчета величин оптической плотности в количество бактериальных клеток.

6) Основной объем приготовленной суспензии испытуемых бактериальных клеток в объеме 2,8 мл вносят в термостатируемую при 37°С кювету толщиной 1 см, в которую быстро добавляют 0,2 мл раствора фермента (по формуле изобретения раствор лизоцима с концентрацией 10 мкг/мл, раствор лизостафина с концентрацией 2,5 мкг/мл). Компоненты интенсивно перемешивают.

7) В течение 600 секунд с интервалом 10 секунд проводят динамический замер оптической плотности созданной реакционной смеси по сравнению с контролем - 3 мл используемого буфера.

8) Результаты измерения представляют в графической форме, для чего на координатной плоскости, где на оси абсцисс нанесены градации времени (в секундах), а по оси ординат - единицы оптической плотности, строят график изменения определяемого параметра (оптической плотности реакционной смеси при 540 нм) за период измерения.

9) На участке, соответствующем периоду быстрого лизиса, проводят касательную и экстраполируют значения на ось ординат, где ОП₁ - величина оптической плотности начала периода быстрого лизиса, а ОП₂ - его конца. Далее проводят расчет по формуле:

,

где Δt - продолжительность периода быстрого лизиса, k - коэффициент пересчета, переводящий величины оптической плотности в количество бактериальных клеток.

10) Чувствительность бактерий к повреждающему действию бактериолитических ферментов выражают в литических единицах (ЛЕ), где 1 ЛЕ соответствует лизису 1 бактериальной клетки в 1 секунду в объеме 1 мл.

Пример

В хирургическое отделение Муниципальной городской больницы №1 г. Оренбурга поступил пациент А. с диагнозом «Хронический остеомиелит левой берцовой кости, обострение». В первый день нахождения в стационаре у него был взят материал (гнойное отделяемое) для бактериологического исследования и назначен курс лечения, в том числе антибиотикотерапии линкомицином.

При бактериологическом исследовании гнойного отделяемого выделена монокультура вида Staphylococcus aureus, при дальнейшем исследовании продемонстрировавшая множественную устойчивость к антибиотикам, в том числе оксациллину (метициллину) и линкомицину. Полученные результаты, а также отсутствие положительной динамики клинической картины заболевания, явились основанием для изменения тактики лечения, в том числе замены антибиотика и начала ферментотерапии. Одновременно это определило задачу определения оптимальной комбинации «антибиотик + фермент», позволяющей достичь их синергического эффекта.

При решении поставленной задачи были исследованы два антибиотика: цефуроксим и пефлоксацин, умеренная чувствительность к которым испытуемого штамма Staphylococcus aureus была установлена на предыдущем этапе исследования; а также бактериолитический фермент - лизостафин, способный осуществлять гидролиз пептидной составляющей полимерной молекулы пептидогликана в клеточной стенке стафилококков.

Перед проведением исследования испытуемые бактериальные клетки выращивали на плотной питательной среде при температуре 37°С в течение 20-24 часов. При этом особенностью проведения эксперимента являлось то, что параллельно с использованием обычной питательной среды (контроль эксперимента) выращивание проводилось на той же среде с добавлением суббактериостатических концентраций антибиотиков - пефлоксацина (10 мкг/мл) - опыт 1 и цефуроксима (8 мкг/мл) - опыт 2. В дальнейшем образцы выращенной биомассы были смыты с поверхности среды 0,9% раствором NaCl и отмыты от ее остатков центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут. После удаления супернатанта бактериальные клетки ресуспендированы до оптической плотности 0,5 ед. в 0,01 М фосфатном буфере с pH 7,5.

Из созданных суспензий были отобраны пробы по 0,1 мл, на основании анализа которых по описанной выше процедуре были определены величины k - коэффициентов пересчета величин оптической плотности в количество бактериальных клеток.

Основные объемы приготовленных суспензий в объеме 2,8 мл были помещены в термостатируемые при 37°С кюветы с длиной оптического пути 1 см, после чего в них было внесено по 0,2 мл лизостафина с концентрацией 2,5 мкг/мл. Анализ изменения оптической плотности проводился при 540 им в течение 600 секунд с интервалом 10 секунд, после чего на основании полученных результатов строились графики лизиса и вычислялись скорости протекания реакции.

Полученные результаты позволили констатировать, что исходная чувствительность испытуемого штамма Staphylococcus aureus к лизостафину характеризовалась величиной V_max, равной 3260 ЛЕ. При этом предварительная инкубация клеток с суббактериостатической концентрацией пефлоксацина достоверно не изменяла значений лизиса (V_max1=3190 ЛЕ), в то время как обработка цефуроксимом более чем в два раза повышала чувствительность стафилококков к действию лизостафина (V_max2=6545 ЛЕ).

Сделанное заключение явилось основанием для коррекции лечения путем назначения пациенту совместных инъекций цефуроксима и лизостафина, что привело к быстрому купированию воспалительной реакции и улучшению клинической картины заболевания.

Таким образом положительный эффект от использования предложенного способа определения чувствительности бактерий к действию бактериологических ферментов проявился в получении результатов, позволивших провести обоснованную коррекцию комплекса лечебных мероприятий с положительным клиническим результатом.

Способ определения чувствительности бактерий к действию бактериолитических ферментов - лизоцима или лизостафина, предусматривающий выращивание бактерий на плотной питательной среде в течение 20-24 ч при температуре 37°С, смыв культуры 0,9%-ным раствором NaCl, центрифугирование, ресуспендирование бактериальных клеток в буфере, рН которого оптимален для фермента, измерение оптической плотности суспензии при длине волны 540 нм с установлением ее на уровне 0,5 ед. и определением абсолютного количества бактерий в 1 мл суспензии, внесение в полученную суспензию объемом 2,8 мл 0,2 мл раствора лизоцима в концентрации 10 мкг/мл или лизостафина в концентрации 2,5 мкг/мл, перемешивание суспензии с ферментным раствором, измерение оптической плотности через каждые 10 сек в течение 600 с с момента внесения ферментного раствора с последующей оценкой чувствительности бактерий на участке максимальной скорости протекания реакции при характеристике ее количеством бактериальных клеток, лизированных в единице объема (мл) в единицу времени (с).