Средство, обладающее антипсихотической активностью

Средство, обладающее антипсихотической активностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области фармакологии и медицины и направлено на создание новых лекарственных препаратов, обладающих антипсихотической активностью. В качестве предложенного лекарственного препарата используют средство, обладающее антипсихотической активностью и представляющее пептид общей формулы , где Pro может представлять собой DPro,

А выбирают из Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

В выбирают из Ala, Arg, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

X - ОН; -ОСН₃; -NH₂; -Gly-Pro.

Изобретение расширяет арсенал антипсихотиков нового поколения, эффективных в терапии негативных и позитивных расстройств психики. Может быть использовано для коррекции негативных, позитивных и когнитивных расстройств, наблюдаемых у больных шизофренией и другими психозами, а именно для восстановления и повышения уровня работоспособности, обучаемости, социальной адаптации значительного контингента больных с психическими расстройствами.

Известна группа антипсихотиков непептидной природы (Клозапин, Кветиапин, Оланзапин, Рисперидон, Запрасидон, Регистр лекарственных средств России «Энциклопедия лекарств», 2006 г.). Эти препараты обладают рядом побочных эффектов, а именно вызывают развитие метаболического синдрома, повышая уровень сахара, холестерина, липидов в крови, ожирение, пролактинемию и связанных с ней аменорею, бесплодие, гиперплазию молочных желез у женщин, снижение либидо, эректильную дисфункцию у мужчин. Перечисленные побочные эффекты часто являются препятствием к использованию этих препаратов в клинике.

Процесс производства существующих атипичных антипсихотиков непептидной природы требует значительных затрат и налажен лишь в нескольких крупных зарубежных фирмах. Отечественных аналогов не существует.

В настоящее время доказано, что пептидэргические системы в тесном взаимодействии с системами биогенных аминов вовлечены в патогенез шизофрении. Перспективным направлением является создание нейролептиков с пептидэргическим механизмом действия. Ранее было показано, что эндогенный пептид нейротензин Pyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH, содержащий фрагмент -Pro-Tyr- (Tadashi Yoshimoto et al., J. Biol. Chem. 253(10), 3708-3716 (1978)), обладает некоторыми свойствами, характерными для нейролептиков. Он обнаруживает широкий спектр фармакологической активности, включая гипертензию, гипергликемию, увеличение проницаемости сосудов, секрецию гормона роста и гипотермические эффекты, имеет отношение к центральной регуляции поведенческих и соматических реакций организма (Carraway R. & Leeman S., 1973, Beadet A. et al., 1994).

Показано, что этот пептид, как и известные антипсихотики, является фармакологическим антагонистом дофаминомиметиков, что уровень этого пептида снижен в спинномозговой жидкости нелеченых больных шизофренией и повышается в результате терапии антипсихотиками.

Исследования, доказывающие вовлечение других нейромедиаторных систем в патогенез психических заболеваний, позволили расширить направление поиска новых антипсихотических препаратов. Вместе с тем до настоящего времени не существует пептидных препаратов с фармакологическим профилем антипсихотиков. Описанные в патенте С.Б.Середенина и соавторов (С.Б.Середенин, Т.А.Воронина, Т.А.Гудашева, Р.У.Островская и др., патент РФ 2091390, 1998 г.) Рrо-Tyr-содержащие соединения обладают сходными биологическими свойствами, но помимо вышеуказанной аминокислотной последовательности имеют в своей структуре химические заместители неприродного происхождения.

Техническим результатом, достигаемым при реализации данного изобретения, является разработка пептидных антипсихотиков, более эффективных и дешевых, чем существующие антипсихотики, а также свободных от их побочных эффектов, где в качестве лекарственного препарата используют средство, обладающеее антипсихотической активностью и представляющее пептид общей формулы .

Указанный технический результат важен тем, что позволяет направленно синтезировать различные пептидные последовательности, отвечающие общей формуле , где Pro может представлять собой DPro, а также проводить направленный скрининг антипсихотической активности синтезированных пептидов по стандартной программе.

Указанный технический результат достигается тем, что используют средство, обладающее антипсихотической активностью и представляющее пептид общей формулы , где Pro может представлять собой DPro,

А выбирают из Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

В выбирают из Ala, Arg, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

X - ОН; -ОСН₃; -NH₂; -Gly-Pro.

С целью реализации данного изобретения синтезированы тетрапептиды формулы Val-Pro-Tyr-Phe, Met-Pro-Tyr-Ala, Met-Pro-Tyr-Arg, Met-Pro-Tyr-Phe, Met-DPro-Tyr-Phe, Trp-Pro-Tyr-Phe, Tyr-Pro-Tyr-Phe, Met-Pro-Tyr-Phe-OMe, Met-Pro-Tyr-Trp-OMe и гексапептид Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro, отвечающие общей формуле , обладающие антипсихотической активностью, свойственной атипичным антипсихотикам. Приведенные аминокислотные последовательности, обладающие свойствами атипичных антипсихотиков, имеют общую закономерность, а именно наличие в структуре молекулы дипептида Pro-Туr в положениях 2, 3 вышеприведенных пептидов, где Pro может представлять собой DPro.

Впервые обнаружена закономерность, что средство, обладающее антипсихотической активностью и представляющее пептид общей формулы , где Pro может представлять собой DPro,

А выбирают из Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

В выбирают из Ala, Arg, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

X - ОН; -ОСН₃; -NH₂; -Gly-Pro,

проявляет свойства атипичных антипсихотиков. Эта закономерность подтверждена синтезом ряда пептидов, данными радиорецепторного анализа способности этих пептидов взаимодействовать с рецепторами - мишенями атипичных антипсихотиков - и поведенческими тестами.

Исходя из результатов проведенных исследований можно заключить, что пептиды, отвечающие общей формуле , где Pro может представлять собой DPro, могут быть использованы для создания новых лекарственных препаратов с антипсихотической активностью.

Некоторые пептиды общей формулы представлены в таблице 1.

Все представленные в таблице 1 пептиды обладают в разной степени выраженными свойствами атипичных антипсихотиков и могут быть использованы в качестве средства, обладающего антипсихотической активностью.

Ниже приведены примеры подтверждающие это.

Синтез пептидов общей формулы , где Pro может представлять собой DPro, осуществляли методами пептидной химии как в растворе, так и твердофазным методом синтеза с использованием L и D аминокислот, предварительно защищенных соответствующим образом, и свободных аминокислот. Синтез пептидов в растворе проводился как ступенчатым наращиванием пептидной цепи, так и фрагментной конденсацией с применением метода смешанных ангидридов, карбодиимидного метода с добавлением 1-оксибензотриазола в качестве нуклеофильной добавки, методом активированных эфиров. Все промежуточные и конечные продукты были выделены и охарактеризованы. Упаривание растворов проводили на вакуумном испарителе при 40°С. Температуры плавления, определенные на столике для плавления Boetiys, даны без исправления. Индивидуальность полученных соединений проверяли с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем фирмы Silufol (Чехия). Вещества обнаруживали, опрыскивая пластинки раствором нингидрина. Удельное вращение определяли на поляриметре марки «А1-ЕПО», элементный анализ - на анализаторе "Carlo-Erba" модель 1106.

Пептиды, синтезированные автоматическим твердофазным методом, синтезированы по Fmoc-схеме на полимере Ринка с использованием DEPCDI/HOBt метода активации аминокислот. Проверку гомогенности полученных пептидов проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном микроколоночном хроматографе «Миллихром А-02». Синтезированные пептиды были охарактеризованы при помощи масс-спектрометрии на масс-спектрометре фирмы Bruker (^®Bruker Daltonik GmbH). Растворители, используемые при синтезе пептидов, абсолютировали соответствующим образом.

Приведены хроматографические подвижности (Rf) в системах растворителей, использованные при синтезе пептидов в растворе:

(ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1); (бензол: этанол) (8:2); (хлороформ:метанол) (9:1); (хлороформ, насыщ. аммиаком: метанол) (9:1); (хлороформ:метанол:аммиак) (8:1,75:0,25); (бутанол:уксусная кислота:вода) (4:1:1); (хлороформ:метанол:аммиак) (6:4:1); (бутанол: уксусная кислота: пиридин: вода) (30:6:20:24); (гексан: ацетон) (3:2); (изо-пропанол:муравьиная кислота:вода) (20:5:1).

Принятые сокращения:

Ala - аланин; Arg - аргинин; Gly - глицин; Ile - изолейцин; Leu - лейцин; Lys - лиизин; Met - метионин; Phe - фенилаланин; Pro - пролин; Ser- серин; Туr - тирозин; Thr - треонин; Trp - триптофан; Val - валин.

AcN - ацетонитрил

Bzl - бензил

Воc - трет-бутилоксикарбонил

ДЦГК - N,N'-дициклогексилкарбодиимид

ДМФА - диметилформамид

NH₂ - амид

ОБТ - 1-оксибензотриазол

OBzl - бензиловый эфир

ОМе или (ОСНз) - метиловый эфир

OPfp - пентафторфениловый эфир

PivCl - пивалоилхлорид

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТФУ - трифторуксусная кислота

ТФА - трифторацетат

ТЭА - триэтиламин

На примере синтеза тетрапептидов Met-Pro-Tyr-Phe; Met-Pro-Tyr-Phe-OMe; Tyr-Pro-Tyr-Phe и гексапептида Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro показан общий подход при синтезе пептидов формулы (I) в растворе.

Пример 1.

Синтез тетрапептида Met-Pro-Tyr-Phe.

I. Получение Boc-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl.

5,5 г (15 ммоль, избыток 1,1) Boc-Tyr(Bzl)-OH помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 75 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 2,16 г (18 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 4,06 г (18 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 13,6 ммоль (4,0 г) HCl·H-Phe-OBzl с ТЭА (2,1 мл, 15 ммоль) в 30 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 200 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 20 мл Н₂O, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 20 мл Н₂О, 1 раз 20 мл насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из эфира гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над P₂O₅, КОН и парафином.

Выход 7,76 г (12,75 ммоль) (85%)

Т.пл. 74-76°С

[α]_D ²²=-11,374 (с=1, метанол)

Rf: 0,706 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,843 (бензол: этанол) (8:2)

Мол. масса 608,71

Брутто-формула С₃₅Н₄₂N₂О₈

II. Получение ТФА·Н-Тyr(Вzl)-Рhе-ОВzl.

К 7,0 г (11,5 ммоль) Boc-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl прибавляли 28,8 мл хлористого метилена и 28,8 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, упаренный остаток растворяли в минимальном объеме бензола и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученный остаток сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 7,0 г (11,25 ммоль) (97,8%)

Rf: 0,341 (бензол:этанол) (8:2)

0,138 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,544 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

Мол. масса 622,6

Брутто-формула C₂HF₃O₂·C₃₂H₃₂N₂O₄

III. Получение Boc-Pro-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl.

2,51 г (10 ммоль, избыток 1,1) Boc-Pro-OH помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 50 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 1,6 г (12 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 2,7 г (12 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 9,1 ммоль (5,66 г) TФA·H·Tyr(Bzl)-Phe-OBzl с ТЭА (1,4 мл, 10 ммоль, избыток 1,1) в 20 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 100 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 10 мл Н₂О, 3 раза по 10 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 10 мл H₂О, 3 раза по 10 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 10 мл H₂O, 1 раз 10 мл насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из этилацетата гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином.

Выход 5,43 г (7,5 ммоль) (75%)

Т.пл. 98-100°С

[α]_D ²²= -65,84 (с=1, метанол)

Rf: 0,614 (бензол:этанол) (8:2)

0,714 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,650 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

Мол. масса 723,83

Брутто-формула C₄₂H₄₉N₃O₈

IV. Получение Boc-Pro-Tyr-Phe-OH.

5 г (7 ммоль) Boc-Pro-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl растворяли в 50 мл метанола, прибавляли 0,1 мл СН₃СООН и палладиевую чернь, перемешивая на магнитной мешалке, пропускали водород в течение 2 часов. Раствор отфильтровывали, упаривали, 2 раза упаривали с бензолом, 1 раз с эфиром, добавляли 10 мл эфира и заливали гексаном, при добавлении гексана выпадал осадок, гексан сливали, а осадок в колбе сушили в эксикаторе над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход 3,57 г (6,17 ммоль) (88,2%)

Т.пл. 90-92°С

[α]_D ²²=- 76,94 (с=1, метанол)

Rf: 0,320 (хлороформ:метанол:аммиак) (8:1,75:0,25)

Мол. масса 525,58

Брутто-формула С₂₈Н₃₅N₃O₇

V. Получение ТФА·H-Pro-Tyr-Phe-OH.

К 2,6 г (5 ммоль) Boc-Pro-Tyr-Phe-OH прибавляли 12,5 мл хлористого метилена и 12,5 мл ТФУ, 1% анизола, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, упаренный остаток растворяли в минимальном объеме бензола и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 2,56 г (4,89 ммоль) (97,8%)

Rf: 0,287 (хлороформ:метанол:аммиак) (7:2,5:0,5)

0,145 (хлороформ:метанол:аммиак) (6:4:1)

Мол. масса 523,47

Брутто-формула С₂НF₃O₂·С₂₃Н₂₇N₃O₄

VI. Получение Boc-Met-Pro-Tyr-Phe-OH.

2,56 г (4 ммоль) ТФА·H-Pro-Tyr-Phe-OH растворяли в 30 мл диметилформамида, прибавляли 1,36 мл (8 ммоль) N,N'-диизопропилэтиламина и затем по каплям раствор Boc-Met-OPfp 1,83 г (4,4 ммоль, изб. 1,1) в 10 мл ДМФА (диметилформамида). Выдерживали при перемешивании на магнитной мешалке 3 часа. Реакционную смесь упаривали. Остаток высаждали из этилацетата гексаном. Выпавший осадок отфильтровывали, промывая на фильтре гексаном. Полученный продукт отфильтровывали и сушили в эксикаторе под вакуумом над P₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 2,37 г (3,62 ммоль); (90.5%)

Т.пл. 101-103°С

[α]_D ²²=- 65,49 (с=1, метанол)

Rf: 0,687 (этилацетат:ацетон:уксусная кислота 50%) (2:1:1);

0,428 (хлороформ:метанол:аммиак) (8:1,75:0,25);

0,217 (бутанол: уксусная кислота:вода) (4:1:1).

Мол. масса 656,81

Брутто-формула C₃₃H₄₄N₄O₈S

VII. Получение HCl·H-Met-Pro-Tyr-Phe-OH.

К 1,97 г (3 ммоль) Boc-Met-Pro-Tyr-Phe-OH прибавляли 4,5 мл 1 н. HCl/СН₃СООН) и 1% анизола, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия Вос-группы реакционную смесь заливали гексаном. Гексан сливали, а полученный осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над Р₂O₅/КОН и парафином. К высушенному осадку добавляли абс. этилацетат, упаривали на роторном испарителе, добавляли 5 мл абс. этилацетата и высаждали сухим эфиром не содержащего перекиси. При добавлении эфира выпадает осадок, который отфильтровывали. Осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над Р₂O₅/КОН и парафином (белый в виде белого порошка).

Выход 2,37 г (2,67 ммоль); (89%)

Т.пл. 110-112°С

[α]_D ²²=- 32,59 (с=1, метанол)

Rf: 0,465 (хлороформ:метанол:аммиак) (6:4:1)

Мол. масса 593,22

Брутто-формула НСl·С₂₈Н₃₆N₄O₆S

Элементный анализ: С 56,50 (56,68); N 9,40 (9,44); Н 6,05 (6,11)

Результаты ВЭЖХ: колонка Prontosil 120-5-C18 AQ, размер 2,0×0,75 мм; объем 2,0 µ1, скорость подачи 100 мкл/мин; температура 35°С, давление 1,6 МПа; элюент А: 0,2 М LiClO₄+5 mM HClO₄; элюент В: AcN; линейный градиент, время выхода 26 мин.

Пример 2.

Синтез тетрапептида Met-Pro-Tyr-Phe-OMe.

I. Получение Boc-Tyr-Phe-OMe.

4,2 г (15 ммоль, избыток 1,1) Вос-Tyr-ОН помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 75 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 2,16 г (18 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 4,06 г (18 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 13,6 ммоль (2,9 г) HCl·H-Phe-OMe с ТЭА (2,1 мл, 15 ммоль) в 30 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 200 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 20 мл Н₂О, 1 раз 20 мл насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из эфира гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над P₂O₅, КОН и парафином.

Выход 5,64 г (12,75 ммоль) (87%)

Т.пл. 85-87°С

[α]_D ²²=- 61,88 (с=1, метанол)

Rf: 0,756 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,910 (бензол:этанол) (8:2)

Мол. масса 442,49

Брутто формула C₂₄H₃₀N₂O₆

II. Получение ТФА-Tyr-Phe-OMe.

К 4,42 г (10 ммоль) Boc-Tyr-Phe-OMe прибавляли 25 мл хлористого метилена и 25 мл ТФУ, 1% анизола, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, упаренный остаток растворяли в минимальном объеме бензола и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 4,47 г (9,8 ммоль) (98%)

Rf: 0,450 (бензол:этанол) (8:2)

0,283 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,538 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

Мол. масса 456,42

Брутто-формула С₂НF₃O₂·С₁₉Н₂₂N₂O₄

III. Получение Boc-Pro-Tyr-Phe-OMe.

2,07 г (9,36 ммоль, избыток 1,1) Boc-Pro-OH помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 75 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 1,39 г (10,3 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 2,33 г (10,3 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 8,76 ммоль (4,0 г) ТФА·H-Tyr-Phe-OBzl с ТЭА (1,35 мл, 9,6 ммоль) в 30 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 200 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл H₂O, 3 раза по 20 мл 5% раствором NаНСО₃, 3 раза по 20 мл H₂О, 1 раз (20 мл) насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из этилацетата гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над P₂O₅, КОН и парафином.

Выход 3,88 г (7,62 ммоль) (87%)

Т.пл. 108-110°С

[α]_D ²²=-56,87 (с=1, метанол)

Rf: 0,320 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,520 (бензол:этанол) (8:2) 0,680 (хлороформ:метанол) (9:1)

Мол. масса 509,58

Брутто-формула С₂₈Н₃₅Н₃О₆

IV. Получение ТФА-Pro-Tyr-Phe-OMe.

К 3,56 г (7,0 ммоль) Boc-Pro-Tyr-Phe-OMe прибавляли 17,5 мл хлористого метилена и 17,5 мл ТФУ, 1% анизола, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, упаренный остаток растворяли в минимальном объеме бензола и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 4,47 г (7,72 ммоль) (96%)

Rf: 0,190 (бензол:этанол) (8:2)

0,250 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,345 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

Мол. масса 523,5

Брутто-формула С₂НF₃O₂·С₂₃Н₂₇N₃O₄

V. Получение Boc-Met-Pro-Tyr-Phe-OMe.

2,6 г (5,0 ммоль) ТФА·H-Pro-Tyr-Phe-OMe растворяли в 30 мл диметилформамида, прибавляли 1,74 мл (10,0 ммоль, 2-кратный избыток) N,N'-диизопропилэтиламина и затем по каплям раствор Boc-Met-OPfp 2,5 г (6 ммоль, избыток 1,2) в 25 мл диметилформамида. Выдерживали при перемешивании на магнитной мешалке 3 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, добавляли 150 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂О (3 раза по 15 мл), 10% раствором KHSO₄ (3 раза по 15 мл), Н₂О (3 раза по 15 мл), 5% раствором NаНСО₃ (3 раза по 15 мл), Н₂О (3 раза по 15 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 15 мл). Раствор этилацетата сушили над MgSO₄, отфильтровывали, упаривали. Продукт высаждали из этилацетата гексаном. Полученный осадок отфильтровывали и сушили в вакууме над P₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 2,58 г (3,92 ммоль); (78,5%)

Т.пл.110-112°С

[α]_D ²²=- 52,15 (с=1, метанол)

Rf: 0,710 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,244 (ацетон:бензол: уксусная кислота) (50:100:1),

0,763 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

Мол. масса 657,77

Брутто-формула C₃₃H₄₄N₄₀O₈S

VI. Получение HCl·H-Met-Pro-Tyr-Phe-OMe.

К 2,0 г (3,0 ммоль) Boc-Met-Pro-Tyr-Phe-OMe прибавляли 4,5 мл 1н HCl/СН₃СООН, 1% анизола, выдерживали 45 минут при комнатной температуре. После снятия защитной группы реакционную смесь заливали гексаном, гексан сливали, а полученное вещество сушили в вакууме. Высушенное вещество растворяли в 5 мл абс. метанола и переосаждали сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали, сушили в эксикаторе под вакуумом, несколько раз меняя осушители (P₂O₅, КОН и парафин).

Выход 3,8 г (2,7 ммоль) (90%)

Т.пл.115-117°С

[α]_D ²²=-16,12 (с=1; метанол)

Rf: 0,632 (хлороформ:метанол:аммиак) (6:4:1)

0,883 (бутанол:уксусная кислота:пиридин:вода) (30:6:20:24)

Мол. масса 611,16

Брутто-формула HCl·C₂₈H₃₆N₄O₉S

Элементный анализ: С 55,06 (55,02); N 9,08 (9,16); Н 5,87 (5,93)

Результаты ВЭЖХ: колонка Prontosil 120-5-C18 AQ, размер 2,0×0,75 мм; объем 2,0 µl, скорость подачи 100 мкл/мин; температура 35°С, давление 1,6 МПа; элюент А: 0,2 М LiClO₄+5 mM HClO₄; элюент В: AcN; линейный градиент, время выхода 21,5 мин.

Пример 3.

Синтез тетрапептида H-Tyr-Pro-Tyr-Phe-OH.

I. Получение DiBoc-Tyr-Pro-OBzl.

4,7 г (12,32 ммоль) DiBoc-Tyr помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 100 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 2,0 г (14,78 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазол), охлаждали до 0°С и добавляли 3,34 г (14,78 ммоль) (N,N'-дициклогексилкарбодиимида) ДЦГК. Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор HCl·H-Pro-OBzl 13,6 г (14,78 ммоль; избыток 1,2) с ТЭА (2,1 мл, 14,78 ммоль) в 50 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 20 мл Н₂О, 1 раз (20 мл) насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из эфира гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над Р₂О₅, КОН и парафином.

Выход 4,80 г (8,44 ммоль) (68,5%)

Т.пл. 98-100°С

[α]_D ²²=- 61,88 (с=1, метанол)

Rf: 0,923 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,800 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,750 (бензол: этанол) (8:2)

Мол. масса 568,65

Брутто-формула C₃₁H₄₀N₂O₈

II. Получение DiBoc-Tyr-Pro-OH.

4,8 г (8,44 ммоль) DiBoc-Tyr-Pro-OBzl растворяли в 100 мл метанола, прибавляли 0,2 мл СН_зСООН и палладиевую чернь, перемешивая на магнитной мешалке, пропускали водород в течение 2 часов. Раствор отфильтровывали, упаривали, 2 раза упаривали с бензолом, 1 раз с эфиром, добавляли 10 мл эфира и заливали гексаном, при добавлении гексана выпадал осадок, гексан сливали, а осадок в колбе сушили в эксикаторе над P₂O₅, KOH и парафином.

Выход 3,57 г (7,46 ммоль) (88,4%)

Т.пл. 101-103°С

[α]_D ²²=-11,37 (с=1, метанол)

Rf: 0,577 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,540 (бензол:этанол) (8:2)

0,545 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

Мол. масса 478,6

Брутто-формула C₂₄H₃₄N₂O₈

III. Получение Boc-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl

5,5 г (15 ммоль, избыток 1,1) Boc-Tyr(Bzl)-OH помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 75 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 2,16 г (18 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 4,06 г (18 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 13,6 ммоль (4,0 г) HCl·H-Phe-OBzl с ТЭА (2,1 мл, 15 ммоль) в 30 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 200 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 20 мл H₂O, 1 раз (20 мл) насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из эфира гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над P₂O₅, КОН и парафином.

Выход 7,76 г (12,75 ммоль) (85%)

Т.пл. 74-76°С

[α]_D ²²=-12,37 (с=1, метанол)

Rf: 0,706 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,843 (бензол: этанол) (8:2)

Мол. масса 608,71

Брутто-формула C₃₅H₄₂N₂O₈

IV. Получение TФA·H-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl.

К 7,0 г (11,5 ммоль) Boc-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl прибавляли 28,8 мл хлористого метилена и 28,8 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, упаренный остаток растворяли в минимальном объеме бензола и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 7,0 г (11,25 ммоль) (97,8%)

Rf: 0,341 (бензол:этанол) (8:2)

0,138 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,544 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

Мол. масса 622,6

Брутто-формула C₂HF₃O₂·C₃₂H₃₂N₂O₄

V. Получение DiBoc-Tyr-Pro-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl.

3,0 г (6,26 ммоль, избыток 1,1) DiBoc-Tyr-Pro-OH помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 50 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 1,0 г (7,5 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 1,7 г (7,5 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 5,7 ммоль (3,55 г) TФA·H-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl с ТЭА (0,88 мл, 6,27 ммоль) в 20 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 150 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 15 мл Н₂О, 3 раза по 15 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 15 мл Н₂О, 3 раза по 15 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 15 мл Н₂О, 1 раз 15 мл насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из этилацетата гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином.

Выход 4,65 г (4,8 ммоль) (85%)

Т.пл. 98-102°С

[α]_D ²²=- 40,6 (с=1, метанол)

Rf: 0,360 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,620 (бензол:этанол) (8:2)

0,780 (хлороформ:метанол) (9:1)

Мол. масса 969,1

Брутто-формула C₅₆H₆₄N₄O₁₁

VI. Получение DiBoc-Tyr-Pro-Tyr-Phe-OH.

4,5 г (4,64 ммоль) DiBoc-Tyr-Pro-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl растворяли в 100 мл метанола, прибавляли 0,1 мл СН₃СООН и палладиевую чернь, перемешивая на магнитной мешалке, пропускали водород в течение 2 часов. Раствор отфильтровывали, упаривали, 2 раза упаривали с бензолом, 1 раз с этилацетатом, добавляли 5 мл этилацетата и заливали гексаном, выпавший осадок отфильтровывали, сушили в эксикаторе над Р₂O₅, КОН и парафином.

Выход 3,54 г (4,3 ммоль) (93%)

Т.пл.115-116°С

[α]_D ²²=-79,37 (с=1, метанол)

Rf: 0,351 (хлороформ:метанол) (9:1)

Мол. масса 820,87

Брутто-формула C₄₂H₅₂N₄O₁₃

VII. Получение HCl·H-Tyr-Pro-Tyr-Phe-OH.

К 3,0 г (3,65 ммоль) DiBoc-Tyr-Pro-Tyr-Phe-OH прибавляли 1н HCl/СН₃СООН (11 мл, в пересчете на две Вос-группы в молекуле тетрапептида), выдерживали 45 минут при комнатной температуре. После снятия защитных групп реакционную смесь заливали гексаном, гексан сливали, а полученное вещество сушили в вакууме. Высушенное вещество растворяли в 5 мл абс. метанола и переосаждали сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали, сушили в эксикаторе под вакуумом, несколько раз меняя осушители P₂O₅, КОН и парафин).

Выход 3,8 г (3,28 ммоль) (90%)

Т.пл. 103-105°С

[α]_D ²²=-22,97 (с=1, метанол)

Rf: 0,214 (хлороформ:метанол:аммиак) (6,5:3,0:0,5)

0,932 (хлороформ:метанол:аммиак) (6:4:1)

0,180 (бутанол:уксусная кислота:вода) (5:2:1)

0,658 (бутанол:уксусная кислота:пиридин:вода) (30:6:20:24)

Мол. масса 657,14

Брутто-формула НСl·С₃₂H₃₆N₄О₉

Элементный анализ: С 58,57 (58,48); N 8,48 (8,53); Н 5,48 (5,52)

Результаты ВЭЖХ: колонка Prontosil 120-5-С18 AQ, размер 2,0×0,75 мм; объем 2,0 µl, скорость подачи 100 мкл/мин; температура 35°С, давление 1,6 МПа; элюент А: 0,2 М LiClO₄+5 mM HClO₄; элюент В: AcN; линейный градиент, время выхода 16 мин.

Пример 4.

Синтез гептапептида Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro.

I. Получение Boc-Pro-Gly-OH.

1. 10,75 г (50 ммоль) Boc-Pro-OH растворяли в 150 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С к раствору прибавляли 7,7 мл (50 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С, перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли 6,8 мл (55 ммоль) пивалоилхлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор H-Gly-OH.

Одновременно во второй колбе приготавливали раствор H-Gly-OH.

2. H-Gly-OH 4,5 г (60 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 35 мл воды и 60 мл ацетонитрила, прибавляли 8,4 мл (60 ммоль) ТЭА, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали на роторном испарителе. К остатку добавляли ~50 мл воды. Водный раствор подкисляли 3-кратным избытком NaHSO₄ (25 г) до рН=3, экстрагировали 5 раз по 100 мл этилацетатом. Объединенный раствор этилацетата промывали Н₂О (50 мл), 10% раствором KHSO₄ (50 мл), Н₂О (50 мл), насыщенным раствором NaCl (50 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли сухой эфир. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход: 5,97 г (32,75 ммоль); (65,5%)

Т.пл. 70°С

[α]_D ²²=-87,8 (с=1, метанол)

Rf: 0,863 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,746 (бензол:этанол) (8:2)

0,903 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,847 (этилацетат:ацетон:50% уксусная кислота:вода) (2:1:1)

Мол. масса 271,32

Брутто-формула C₁₂H₂₀N₂O₅

II. Получение Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1. 5,9 г (21,74 ммоль) Boc-Pro-Gly-OH растворяли в 100 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С, к раствору прибавляли избыток 1,1 (3,35 мл; 23,9 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С, перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли избыток 1,1 (2,34 мл; 23,9 ммоль) пивалоилхлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор НСl·H-Pro-OBzl.

Одновременно приготавливали раствор НСl·H-Pro-OBzl.

2. HCl·H-Pro-OBzl 6,3 г (26,1 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 50 мл ацетонитрила, прибавляли 4,0 мл (28,71 ммоль; избыток 1,1) ТЭА, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали. К упаренному остатку прибавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали H₂O (3 раза по 25 мл), 10% раствором KHSO₄ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), 5% раствором NaHCO₃ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 25 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли ~100 мл сухого эфира. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, Р₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход: 8,12 г (17,66 ммоль); (81,23%)

Т.пл. 125-126°С

[α]_D ²²= -101,18 (с=1, метанол)

Rf: 0,326 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,390 (гексан: ацетон) (3:2)

0,947 (хлороформ: метанол) (9:1)

0,620 (бензол:этанол) (8:2)

Мол. масса 459,54

Брутто-формула C₂₄H₃₃N₃O₆

Элементный анализ: С 62,89 (62,73); N 9,21 (9,14); Н 7,52 (7,24).

III. Получение ТФА·H-Pro-Gly-Pro-OBzl.

К 7,8 г (17,0 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl прибавляли 42,5 мл хлористого метилена и 42,5 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅, КОН и парафином.

Выход 7,95 г (17,7 ммоль); 98%.

Rf: 0,043 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1),

0,247 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,018 (гексан: ацетон) (3:2)

Мол. масса 473,44

Брутто-формула С₂НF₃O₂·С₁₉Н₂₅N₃O₄

IV. Получение Boc-Tyr(Bzl)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1. 5,61 г (14,72 ммоль) Boc-Tyr(Bzl)-OH растворяли в 100 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С, к раствору прибавляли избыток 1,1 (2,27 мл; 16,2 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С, перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли избыток 1,1 (1,99 мл; 16,2 ммоль) пивалоилхлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор ТФА·H-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Одновременно приготавливали раствор TФA·H-Pro-Gly-Pro-OBzl.

2. TФA·H-Pro-Gly-Pro-OBzl 8,0 г (17,0 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 50 мл ацетонитрила, прибавляли 4,76 мл (34,0 ммоль; 2-кратный избыток до рН 8-9) триэтиламина, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали. К упаренному остатку прибавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂О (3 раза по