Способ и устройство для очистки, разделения, модификации и/или иммобилизации химических или биологических объектов, находящихся в текучей среде, и опора из микропроволоки

Способ и устройство для очистки, разделения, модификации и/или иммобилизации химических или биологических объектов, находящихся в текучей среде, и опора из микропроволоки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к устройству для очистки, разделения, детектирования, модификации и/или иммобилизации химических объектов или биологических объектов, находящихся в текучей среде.

Уровень техники

Различные аналитические, биохимические и диагностические методы включают иммобилизацию специфического реагента или биологического связывающего партнера биологической молекулы на субстратах с высокоразвитой поверхностью.

С одной стороны, клетки часто культивируют в реакторах для получения биологических и фармакологических продуктов. Такими клетками могут являться клетки животного, растительного, грибкового или микробного происхождения. Для поддержания клеточной культуры, как правило, клетку необходимо подпитывать кислородом и другими питательными элементами. Клеточные культуры обычно поддерживают в реакторах путем перфузии, где среда для культивирования клетки, включающая кислород и другие питательные элементы, направляется через реактор для культивирования клеток. Реакторы для культивирования клеток, однако, могут поддерживать только маленькие загрузки клеток на единицу объема реактора. Они могут работать только при низкой скорости потока или в пределах скоростей перемешивания. Аналогично, в реакторах проводят биокаталитические реакции, где ферментный катализатор удерживается на пористой неорганической опоре.

С другой стороны, иммобилизация также уже используется для проведения химического и биологического разделения. Разделение макромолекул, например, белков, является дорогостоящей операцией при производстве фармакологических продуктов. Для проведения такого типа разделений временами используют хроматографию. В пищевой, биофармацевтической, биотехнологической и фармацевтической промышленностях при производстве коммерчески важных биомолекул в качестве стационарной фазы используют химически модифицированную целлюлозу или диоксид кремния. Альтернативные стационарные фазы могут включать металлы и оксиды металлов, например, дисперсный оксид алюминия. Также для хроматографии могут использоваться мембранные адсорбенты, т.е. мембраны с функционализированными центрами на поверхности.

Многие аналитические методы включают иммобилизацию биологического связывающего партнера биологической молекулы на поверхности. Поверхность подвергают воздействию среды, которая, как предполагается, содержит молекулу, после чего определяют наличие или размер молекулы, связанной с поверхностно-иммобилизованным связывающим партнером.

Подобным образом, большинство биотехнологических процессов получения фармацевтических или диагностических продуктов включают очистку биомолекул из различных источников. Очистку биомолекул часто начинают с проведения адсорбционной хроматографии на обычном уплотненном слое твердого носителя - адсорбента. Для этого часто требуется проведение очистки необработанной культуры перед тем как работать с ней в хроматографической колонке. Существующие методы продуцирования и очистки плазмидной ДНК из бактериальных лизатов основаны на обычной хроматографии с уплотненным слоем адсорбента. Этот метод затруднен физическими характеристиками этих соединений (такими как размер плазмидов, вязкость раствора, хрупкость плазмидов, химическая схожесть с другими нуклеиновыми кислотами у микроорганизма и т.д.), устанавливающими строгие ограничения в показателях рабочей емкости устройства и перепада давления. Более того, может возникнуть необходимость в элиминации плазмидной фракции, которая не вносит вклад в терапевтический эффект из-за того факта, что экспрессия генов, содержащихся в нетерапевтической части, влечет за собой опасность для рецептора такой плазмиды, риск возникновения неспецифических эффектов, риск хромосомной интеграции и т.д.

Методы адсорбционной хроматографии проводятся не только на обычном уплотненном слое (хроматография с уплотненным слоем адсорбента; РВС), но также и на вспученном слое (адсорбция на слой вспученного адсорбента; ЕВА) или в псевдоожижженном слое (адсорбция в псевдоожижженном слое; FBA). Во всех этих хроматографических методах в качестве адсорбционного носителя используются частицы.

В других хроматографических методах, применяемых при разделении и очистке, в качестве стационарной фазы используется волокнистый материал. Например, в J. Chromatography 1992, 598/2: pp.169-180 описывается непрерывная стационарная фаза, состоящая из нитей, сплетенных в ткань, которую сворачивают и упаковывают в жидкостные хроматографические колонки. Описываемые нити имеют характеристическую ширину 200-400 мкм и изготавливаются из 10-20 мкм волокон, состоящих на 95% из поли(м-фениленизофталемида) и на 5% из поли(п-фенилентере-фталемида).

В J. Oleo Science 2002, 51/12: 789-798 описывается метод жидкостной хроматографии с использованием в качестве стационарной фазы полиэфирных и целлюлозных филаментных нитей для удаления жирных пятен из волоконного субстрата при помощи водного мицеллярного раствора поверхностно-активного вещества.

В ЕР 328256 раскрывается стекловолокно, покрытое пористым гидрофильным связующим материалом, который производится для связывания подходящего лиганда или биологического материала в хроматографическом процессе.

WO 03/00407 относится к волокну из гидроксида алюминия, который обладает высоким положительным зарядом и составляет в диаметре приблизительно 2 нанометра. Таким волокном можно отфильтровать бактерии и наноразмерные частицы, например, вирусы и коллоидные частицы, при высокой скорости пропускания через фильтр. Они могут также использоваться для очистки и стерилизации воды, биологических, медицинских и фармацевтических жидкостей, в качестве коллектора/концентратора для детектирования и анализа микробов и вирусов, а также в качестве субстрата для выращивания клеток.

В данной области техники известна микропроволока, покрытая аморфным стеклом. Благодаря ее магнитным свойствам, проявляющимся при высоких частотах она используется в миниатюрных электронных компонентах и для фильтрации электромагнитных помех в печатных схемах и кабелях. Микропроволока также обладает проводящими свойствами, и поэтому ее можно использовать в таких электромагнитных элементах, как миниатюрные катушки, миниатюрные провода, высоковольтные трансформаторы и миниатюрные антенны. Тем не менее, еще не предлагалось использовать микропроволоку, покрытую аморфным стеклом, в способе очистки, разделения, детектирования, модификации и/или иммобилизации субстратов, содержащих текучую среду.

В J. Magnetism и Magnetic Materials 2002, 249: 357-367 описывается использование нанопористых мембран, частично наполненных магнитными полыми проводами, для разделения магнитных частиц, находящихся в текучей среде. Магнитные частицы, предварительно нагруженные определенными биологическими объектами, разделяются путем пропускания содержащей их текучей среде через мембрану при приложении внешнего магнитного поля таким образом, чтобы намагнитились ферромагнитные цилиндры, и поэтому биологические объекты, связанные с магнитными частицами, захватываются стенками капилляров, тогда как несвязанные объекты проходят мимо.

В J. Magnetism и Magnetic Materials 2005, 293: 671-676 описывается чувствительность аморфной микропроволоки, покрытой стеклом, к эффекту Гигантского магнитного сопротивления (GMI) при детектировании магнитных наночастиц, осаждаемых на их поверхности и располагаемых вблизи от нее при приложении магнитного поля. Микропроволоку покрывают полимером, содержащим специфические биорецепторы для биомолекул, находящихся на поверхности магнитных микрочастиц, которые впоследствии детектируются.

WO 2005/101464 относится к микропроволоке, покрытой метгласом, где биохимические реагенты и ферменты реакции ПЦР инкапсулированы или загружены в нано- или микропоры, вытравленные на стеклянной поверхности, которая либо является частью покрытой стеклом микропроволоки, либо наносится на нее путем погружения, распыления или каким-либо другим методом.

Раскрытие изобретения

Проблема, решаемая настоящим изобретением, состоит в разработке улучшенного способа очистки, разделения, детектирования, модификации и/или иммобилизации химических объектов или биологических объектов, находящихся в текучей среде, в котором были бы устранены или минимизированы некоторые недостатки, указанные выше для других методов.

Решение заключается в сопособе, который осуществляется с использованием устройства, содержащего одну или несколько опор из микропроволоки, закрепленных на концах и представляющих стационарную фазу. Упомянутые опоры из микропроволоки пригодны для связывания химических или биологических объектов и используются в так называемой технологии "Static Support Bed" (SSB), где указанное устройство помещают в колонку или реактор для использования в хроматографии или для выращивания клеточных культур.

Соответственно, первый аспект настоящего изобретения относится к устройству для очистки, разделения, детектирования, модификации и/или иммобилизация химических объектов или биологических объектов, находящихся в текучей среде, где указанное устройство содержит одну или несколько опор из микропроволоки, закрепленных своими концами. Эти опоры из микропроволоки имеют многослойную структуру, сегрегированную в центральный стержень, и один или несколько покрывающих слоев и пригодны для связывания химических объектов или биологических объектов, где поверхность микропроволоки модифицирована путем присоединения лигандов или нанесением на нее функционального покрытия и где указанная очистка, разделение, детектирование, модификация и/или иммобилизация происходит за счет связывания химического или биологического объекта с функциональным покрытием или лигандами, находящимися на поверхности опор из микропроволоки, с условием, что если магнитное поле оказывает влияние на указанное устройство, то его не используют для разделения восприимчивых действию магнитного поля частиц, находящихся в текучей среде, посредством магнитного взаимодействия между опорами из микропроволоки и указанными магнитовосприимчивыми частицами.

Опоры из микропроволоки также являются объектом изобретения. Таким образом, второй аспект изобретения относится к опорам из микропроволоки, которые интегрированы в устройство изобретения и имеют указанные выше характеристики. Итак, указанные опоры из микропроволоки имеют многослойную структуру, сегрегированную в центральный стержень, и один или несколько покрывающих слоев, где поверхность микропроволоки модифицируется путем:

а) присоединения лигандов или

б) покрытием ее функциональным слоем с условием, что функциональный слой не является полимерным покрытием.

Третий аспект изобретения относится к способу очистки, разделения, детектирования, модификации и/или иммобилизация химических объектов или биологических объектов, находящихся в текучей среде, с использованием устройства, определенного выше, где указанный способ включает в себя: а) загрузку жидкого образца, содержащего химические объекты или биологические объекты, во внутренний объем канала, содержащего устройство; б) связывание химических объектов или биологических объектов на опорах из микропроволоки, входящих в состав устройства; в) необязательно, проведение химической или биологической модификации объекта, например, биокаталитической модификации молекулы; г) необязательно, промывка канала и слив нежелательных компонентов и примесей жидкого образца; и д) элюирование конечных химических объектов или конечных биологических объектов с условием, что если магнитное поле оказывает влияние на указанное устройство, то оно не может использоваться для разделения чувствительных к действию магнитного поля частиц, находящихся в текучей среде, посредством магнитного взаимодействия между опорами из микропроволоки и указанными магнитовосприимчивыми частицами.

Этот способ, в частности, применим для разделения, очистки и/или модификации биомолекул, таких как белки, гликопротеины, нуклеиновые кислоты, например, РНК, ДНК, кДНК, олигонуклеотиды и плазмиды, пептиды, гормоны, антигены, антитела, липиды и комплексы, включающие одну или несколько таких молекул.

Определения

В последующем, будет подразумеваться, что термин "биологический объект" включает в себя компоненты биологического происхождения. Он включает в себя клетки животных, растений, грибковые или микробные клетки, тканевые культуры, антитела, антибиотики, антигены, плазмиды, олигонуклеотиды, пептиды, гормоны, коферменты, ферменты, белки, либо природного происхождения, либо рекомбинантно полученные, гликозилированные или негликозилированные, клеточные компоненты, нуклеиновые кислоты, вирусы, углеводы, текучей среде, содержащиеся в организме, компоненты крови, микроорганизмы и их производные, или их части, а также какие-либо другие биологические молекулы, представляющие интерес.

Используемое в данном контексте понятие "химический объект" включает в себя любое органическое или неорганическое соединение, включая лекарственные средства.

Используемое в данном контексте понятие "очистка" относится к процессу отделения интересующего вещества от чужеродных или загрязняющих элементов в образце за счет удаления примесей.

Используемое в данном контексте понятие "разделение" относится к процессу, при котором смесь веществ преобразуется в два или более отличающихся по составу продукта.

Используемое в данном контексте понятие "модификация" относится к видоизменению структуры молекулы химическими или биологическими способами.

Используемое в данном контексте понятие "иммобилизация" относится к процессу присоединения химического соединения или биомолекулы за счет ковалентных или нековалентныхсвязей. Иммобилизация клеток для получения вакцин, белков, эукариотических генов, тканевых трансплантатов, белков из рекомбинантной ДНК и т.д. является отдельным примером использования микропроволоки настоящего изобретения.

Используемое в данном контексте понятие "максимальный размер поперечного сечения" какого-либо заданного объекта относится к максимальному расстоянию, которое можно обнаружить между любыми двумя точками, находящимися в пределах самого большого периметра, определяемого по линии пересечения объекта и плоского перпендикуляра к самому длинному размеру объекта.

Используемый в данном контексте термин "микропроволока" относится к твердому веществу, т.е. неполому, тонкому элементу, имеющему круглое или некруглое поперечное сечение с максимальным размером менее 1000 мкм. Термины "микропроволока" и " опора из микропроволоки" используются в данном контексте взаимозаменяемо.

Используемое в данном контексте понятие "устройство" относится к подложке, состоящей из одной или нескольких опор из микропроволоки, которые сгруппированы в повторяющуюся конфигурацию и закреплены любым из двух концов.

Используемое в данном контексте понятие "связка опор из микропроволоки" относится к множеству опор из микропроволоки, т.е. несколько (более одной) опор из микропроволоки сгруппированы вместе в повторяющуюся конфигурацию.

Осуществление изобретения

Важной проблемой промышленных процессов на сегодняшний день является ограничение их применения в промышленных масштабах из-за используемой технологии. Данное ограничение может приводить к тому, что процесс, осуществляемый успешно в лабораторных масштабах, при приложении его к большим промышленным масштабам работает неудовлетворительно, не давая ожидаемые результаты.

Поэтому размеры устройств для неподвижных насадок, согласно настоящему изобретению, предпочтительно находятся в интервале от 0,5 см максимального размера поперечного сечения и 0,5 см длины до 1,5 м максимального размера поперечного сечения и 10 м длины. Однако из-за высокой производительности технологии SSB редко используют очень большие устройства на основе технологии SSB, более предпочтительно, когда размеры устройств для неподвижных насадок для промышленных процессов находятся в интервале от 0,5 см максимального размера поперечного сечения и 5 см длины до 50 см максимального размера поперечного сечения и 1,5 м длины.

Одним из преимуществ технологии SSB является ее способность предоставлять большую доступную площадь поверхности в сочетании с высокой пористостью в пределах границ устройства по технологии SSB. Это преимущество является результатом нитевидной формы опор из микропроволоки, используемых в настоящем изобретении, т.е. они придают устройству настоящего изобретения определенную пористость - чем более тонкая опора из микропроволоки используется, тем большей будет доступная площадь поверхности в пределах устройства по технологии SSB. Однако, более толстые опоры из микропроволоки более устойчивы к разрыву, по этой причине большие устройства или жесткие условия процесса требуют использования более толстых опор из микропроволоки.

Длина опор из микропроволоки, в частности, не ограничивается каким-либо особым диапазоном, который в определенной мере, как правило, равен или больше длины колонки или реактора. Тем не менее, из вышеуказанных соображений вытекает вывод об удобстве использования опор из микропроволоки, у которых предпочтительно максимальный размер поперечного сечения находится в интервале от 1 мкм до 1000 мкм, а для поддержания их нитевидной формы соотношение длины к максимальному размеру поперечного сечения должно быть более 5. Более предпочтительно, когда их максимальный размер поперечного сечения находится в интервале от 1 мкм до 100 мкм, а соотношение длины к максимальному размеру поперечного сечения более 50. Еще более предпочтительно, когда соотношение длины к максимальному размеру поперечного сечения более 500. Наиболее предпочтительно, когда соотношение длины к максимальному размеру поперечного сечения более 1000.

Технология с использованием устройства настоящего изобретения, как описано в данном тексте, является наиболее выгодной при использовании в технологических процессах, в которых применяются большие объемы текучей среды, большие скорости потока текучей среды, вязкие текучие среды и текучие среды с твердыми частицами в суспензии. В любом из этих четырех случаев применение существующих технологий приводит либо к низкой производительности, либо к ограничивающему противодавлению.

Противодавление возникает тогда, когда устройство для технологической обработки, устанавливаемое в подвергаемые обработке потоки текучей среды, оказывает сопротивление потоку. Это сопротивление является следствием большой вязкости или большой прилагаемой к потоку скорости в сопоставлении с пористостью при заданном поперечном сечении устройства. На пористость влияет конструкция устройства, размер и геометрия опор, находящихся в пределах устройства, а также эффект фильтрации на твердых частицах в суспензии, которые накапливаются в пределах устройства и понижают его эффективную пористость.

В технологии с использованием устройства по изобретению опоры из микропроволоки закрепляются любым из двух концов для того, чтобы получалилось устройство, где пространственное распределение опор из микропроволоки остается стабильным независимо от природы используемой текучей среды или от используемой скорости потока. Закрепление концов приводит к тому, что смежные опоры из микропроволоки образуют определенный угол. Для того чтобы предотвратить противодавление и эффект фильтрации на твердых частицах в суспензии, наиболее удобным вариантом распределения опор из микропроволоки в пределах устройства по изобретению является случай, когда смежные опоры из микропроволоки друг с другом образуют угол в ноль градусов. Однако, важно, чтобы твердые частицы с размером, превышающим расстояние между смежными опорами из микропроволоки, свободно проходили через устройство за счет раздвигания смежных опор из микропроволоки и временной деформации пространственного распределения смежных опор из микропроволоки, что приводит к тому, что смежные опоры из микропроволоки образуют угол вплоть до 10 градусов. Более того, из-за ограничений в дизайне и конструкции может потребоваться увеличение угла между смежными опорами из микропроволоки вплоть до 45 градусов.

Поэтому, согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, любая взятая в отдельности опора из микропроволоки образует угол от 0° до 45° с любой другой прилегающей опорой из микропроволоки. Более предпочтительно, любая взятая в отдельности опора из микропроволоки образует угол от 0° до 10° с любой другой прилегающей опорой из микропроволоки.

В предпочтительном варианте осуществления опоры из микропроволоки размещают в колонке или реакторе таким образом, чтобы они вытягивались полностью от одного до другого конца колонки или реактора, закрепляясь своими концами, а подаваемый поток протекал от одного конца к другому. В особенно предпочтительном варианте осуществления опоры из микропроволоки размещают таким способом, чтобы подаваемый поток образовывал угол от 0° до 45° с опорами из микропроволоки. Тем не менее, возможны и другие способы размещения.

Для полного охвата внутреннего объема колонки или реактора с опорами из микропроволоки требуется равномерное распределение по всей колонке или реактору опор из микропроволоки, как таковых или сгруппированных в связки. Такого равномерного распределения можно достигнуть путем закрепления опор из микропроволоки или связок своими концами на любом конце колонки или реактора таким образом, чтобы закрепленные концы образовывали сетчатую, зигзагообразную структуру или структуру в виде параллельных линий на любом конце колонки или реактора.

Соответственно, устройство по изобретению размещают в пределах колонки или реактора по схеме оптимизированного распределения таким образом, чтобы достигались желаемые размеры и равномерная пористость колонки. Эти значения сохраняются постоянными на всем протяжении срока службы любого устройства по изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, опоры из микропроволоки устройства по изобретению имеют центральный стержень и покрывающие слои, изготовленные из различных материалов. Поэтому опоры из микропроволоки согласно данному предпочтительному варианту осуществления не имеют полой структуры, в отличие от проводов, подобных полым волокнам. Материалы центрального стержня и покрывающих слоев выбираются из группы, включающей стеклянные, металлические, керамические, полимерные и пластиковые материалы. В более предпочтительном варианте осуществления центральный стержень указанных опор из микропроволоки изготавливают из металла, и, по меньшей мере, один покрывающий слой изготавливают из стекла. Металлический стержень опор из микропроволоки может иметь аморфную и/или кристаллическую микроструктуру. Предпочтительно, когда металлический стержень имеет аморфную микроструктуру.

В предпочтительном варианте осуществления, стержень опор из микропроволоки изготавливают из металла, металлических сплавов или комбинации по меньшей мере одного металла и металлического сплава. Предпочтительными металлами, используемыми как таковые, или металлическими сплавами являются медь, золото, серебро, платина, кобальт, никель, железо, кремний, германий, бор, углерод, фосфор, олово, молибден, индий, галлий, свиней, гафний и цирконий. В более предпочтительном варианте осуществления стержень опор из микропроволоки состоит из сплава, содержащего кобальт, железо, никель, хром, бор, кремний и молибден.

Примеры составов стержня, особо предпочитаемых в настоящем изобретении, показаны в Таблице 1.

Таблица 1
	Со %	Fe %	Ni %	Cr %	B %	Si %	Mo %
1	68,7	4	1	0	13	11	0
2	50,7	3,98	0	23,65	11,96	9,71	0
3	60,51	3,99	0	12,13	13,53	9,84	0
4	59,85	3,94	0	11,7	13,06	13,06	0
5	58,34	3,84	0	11,7	13,06	13,06	0
6	58,14	4,17	0	11,66	13,02	13,01	0
7	58,9	4,19	0	12,42	13,13	11,36	0
8	58,64	4,67	0	12,36	13,05	11,28	0
9	57,33	4,7	0	13,14	13,02	11,19	0,62
10	56,51	4,84	0	13,08	14,16	11,41	0
11	58,04	4,62	0	12,92	12,8	11,01	0,61
12	58,25	4,49	0	12,52	13,47	10,68	0,59
13	57,96	4,73	0	12	13,2	11,11	1

Стекловидная покрывающая композиция может содержать наряду с другими оксидами металлов, такие оксиды, как SiO₂, Al₂O₃, В₂О₃, Na₂O и K₂O.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, поверхность опор из микропроволоки модифицируется путем присоединения лигандов или нанесением на нее функционального покрытия, поэтому очистка, разделение, детектирование, модификация и/или иммобилизация происходит посредством связывания химического объекта или биологического объекта на функциональном покрытии или с лигандами, присутствующими на поверхности опор из микропроволоки.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, поверхность опор из микропроволоки подходящим образом модифицируется нанесением на поверхность белкового, желатинового или коллагенового покрытия. Следовательно, в данном случае поверхность опоры из микропроволоки модифицируется подходящим образом посредством функционального покрытия. Таким образом, используемый в данном контексте термин "функциональное покрытие", относится к покрытию, которое может взаимодействовать посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия с целевым объектом.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения поверхность опор из микропроволоки модифицируется подходящим образом посредством присоединения лиганда к поверхности опоры из микропроволоки, непосредственно или через линкер. Предпочтительными лигандами являются те, которые выбираются из группы, состоящей из клеток, биологических тканей, антител, антибиотиков, антигенов, нуклеиновых кислот, пептидов, гормонов, коферментов, биологических катализаторов, химических катализаторов, химических реагентов, липидов, сахаров, аминокислот, белков, нуклеотидов, соединения, содержащего функциональный заместитель, выбираемый из группы, состоящей из диэтиламиноэтила, четвертичного аминоэтила, четвертичного аммония, карбоксиметила, сульфопропила, метилсульфоната, бутила, октила, фенила и их смесей. В частности предпочтительными лигандами являются клетки, биологические ткани, антитела, антибиотики, антигены, нуклеиновые кислоты, пептиды, гормоны, коферменты, биологические катализаторы, химические катализаторы, химические реагенты, липиды, сахара, аминокислоты, белки, нуклеотиды и их смеси.

Предпочтительными линкерами являются те, которые выбираются из группы, включающей полимерный слой, белковый слой, желатиновый слой, коллагеновый слой, клетки, антитела, антигены, нуклеиновые кислоты, пептиды, коферменты, липиды, сахара, аминокислоты, белки, нуклеотиды, циануровый хлорид, хинин, п-ртутьбензоат, фенилборную кислоту и соединение, содержащее функциональный заместитель, выбираемый из группы, включающей альдегид, ароматический амин, нитрен, малеимид, карбоновую кислоту, изоцианат, диэтиламиноэтил, четвертичный аминоэтил, четвертичный аммоний, карбоксиметил, сульфопропил, метилсульфонат, бутил, октил, фенил и их смеси.

Микропроволоку со стеклянным покрытием можно получить любым подходящим методом, известным в данной области техники, например, методом Тэйлора-Улитовского (Fizika Metallov I Metallovedeneie 1987, 67: 73). Можно использовать различные металлические композиции стержней, а также можно использовать различные составы стеклянных покрытий.

Определенную выше функционализированную опору из микропроволоки со стеклянным покрытием можно получить по способу, включающему в себя следующие стадии: (1) заготовка опоры из микропроволоки со стеклянным покрытием; (2) окисление его поверхности; (3) активация поверхности полученной окисленной микропроволоки и (4) функционализация подходящим лигандом посредством ковалентного или нековалентного присоединения лиганда к линкеру, прикрепленному на стадии (3).

Предпочтительно стадия окисления (2) включает в себя обработку при помощи смеси H₂O₂ и водного раствора NH₃ (1:4) с последующей обработкой концентрированной N₂S₀₄, Можно также использовать другие условия окисления (сравни J. Am. Chem. Soc; 2003, 125, 12096; Langimur, 2004, 20, 7753; Anal. Chem.; 1993, 65, 1635; J. Am. Chem. Soc; 1996, 118, 9033).

Предпочтительно, стадия активации (3) включает в себя присоединение подходящего линкера к поверхности микропроволоки, которая содержит подходящие функциоанльные группы для ковалентного или нековалентного (электростатическое, гидрофильное, гидрофобное или аффинное взаимодействие) связывания с лигандом. Стадию активации (3) опор из микропроволоки можно выполнить в один этап или через несколько реакционных стадий. Например, стадия активация (3) может быть проведена по способу, включающему в себя следующие этапы: (3-1) взаимодействие окисленной микропроволоки с силановым соединением и (3-2) взаимодействие полученного изделия из микропроволоки, полученного на этапе (3-1), с соединением, содержащим малеимидную, карбоксильную или изоцианатную группу. Предпочтительными силановыми соединениями являются 3-аминопропилэтоксисилан, 7-окт-1-енилтрихлорсилан и 3-изоцианатпропилэтоксисилан.

Стадию функционализации (4) можно провести путем соединения линкера, прикрепленного к поверхности опор из микропроволоки, с лигандом посредством электростатических взаимодействий, гидрофильных взаимодействий, гидрофобных взаимодействий, аффинных взаимодействий или ковалентных связей. Такого соединения можно достичь при помощи следующих комбинаций:

а) ковалентного связывания лигандов:

а. 1) аминной функцинальной группы на лиганде, связываемой через иминную связь с альдегидной функциональной группой на поверхности;

а. 2) аминной функциональной группы на лиганде, связываемой посредством нуклеофильного замещения на поверхности, функционализированной циануровым хлоридом;

а. 3) аминной функциональной группы на лиганде, связываемой посредством присоединения по Михаэлю к хиноновым функциональным группам на поверхности;

а. 4) тирозинового или гистидинового остатка на лиганде, связываемого через азогруппу с ароматическими аминами, присоединенными к поверхности;

а. 5) аминного остатка на лиганде, связываемого с нитреновой функциональной группой на поверхности, образуемой посредством фотохимической активации фенилазидных групп;

а. 6) тиольной функциональной группы на лиганде, связываемой с п-ртутьбензоатной, йодацетамидной или малеимидной группами на поверхности посредством силоксанового мостика, дисульфидных связей или присоединения по Михаэлю;

а. 7) цис-диольного центра (присутствующего на сахарах гликопротеинов) на лиганде, который может связываться с фенилборнокислотными группами на поверхности;

а. 8) карбоксильных или изоцианатных групп на поверхности, присоединяемых к аминным группам на лиганде;

б) нековалентное связывание лигандов:

б. 1) электростатическое взаимодействие, как, например, взаимодействие через заряженные тиолы между самособирающимся слоем октадецилтиола и додецилтиолом на поверхности и фумаратредуктазой,

б. 2) гидрофильное или гидрофобное взаимодействия, как, например, АТФаза, встроенная в липосому, связанную с поверхностью посредством взаимодействия липосомы со слоем димиристоилфосфатидилэтаноламина на поверхности,

б. 3) афинных взаимодействий, как, например, антитело-меченные лиганды, связанные с поверхностями, покрытыми антигеном, биотин-меченные лиганды, связанные с поверхностями, покрытыми авидином или стрептавидином, гликопротеины, связанные с поверхностями, покрытыми пектином, альфа-О-маннопираноза, содержащая лиганд, связанный с поверхностями, покрытыми конкавалином А, холинсвязывающий домен на лиганде, связанный с поверхностями, покрытыми холином, FAD-зависимый фермент, связанный с поверхностями, покрытыми FAD (флавин аденин динуклеотидом), и кофакторзависимые ферменты, связанные с поверхностями, покрытыми кофакторным аналогом.

Описываемый в этом документе метод адсорбции на устройстве по изобретению может использоваться в различных сферах применения. Так, он может использоваться в способе:

(1) как биокалатилический реактор посредством иммобилизации ферментов на поверхности опор из микропроволоки;

(2) для модификации химических или биологических молекул при помощи катализатора (который либо является биокатализатором, либо нет), связанного с поверхностью опоры из микропроволоки;

(3) для отделения химических или биологических молекул от текучей среды, в которой они содержатся, посредством взаимодействия указанных химических или биологических молекул с взаимодействующими объектами, связанными с поверхностью опоры из микропроволоки;

(4) для одновременного проведения разделения и модификации химических или биологических молекул, содержащихся в текучей среде, посредством воздействия катализатора на указанные химические или биологические молекулы при связывании их с взаимодействующим объектом, который при этом является как катализатором, так и взаимодействующим объектом или только одним из них, связанным с поверхностью опоры из микропроволоки;

(5) для иммобилизации химических или биологических молекул, которые дополнительно взаимодействуют с химическими или биологическими молекулами, содержащимися в текучей среде, любым из вышеописанных способов;

(6) для модификации состава текучей среды посредством активации клеток на компонентах указанной текучей среде, при этом указанные клетки связаны с поверхностью опоры из микропроволоки;

(7) для увеличения количества делящихся клеток путем деления указанных клеток на поверхности опоры из микропроволоки;

(8) для модификации состава текучей среды путем обмена химических или биологических молекул, содержащихся в указанной текучей среде на химические или биологические молекулы, связанные с поверхностью опоры из микропроволоки;

(9) для разработки химических реакций, включающих в себя одну или несколько стадий, посредством воздействия одного или нескольких агентов на молекулярные объекты, связанные с поверхностью опоры из микропроволоки, т.е. выступающего в качестве опоры из микропроволоки для твердофазного синтеза;

(10) для модификации физических свойств текучей среды за счет действия различных объектов, иммобилизованных на поверхности опоры из микропроволоки, или посредством воздействия физических сил, сообщаемых текучей среде через опору из микропроволоки;

(11) для очистки плазмидной ДНК посредством взаимодействия указанной плазмидной ДНК с поверхностью опор из микропроволоки, функционализированной подходящими олигонуклеотидами, которые комплементарны целевой последовательности, внедренной в плазмидную ДНК;

(12) для биокаталитической модификации плазмидов за счет функционализации поверхности опор из микропроволоки подходящими олигонуклеотидами, которые комплементарны целевой последовательности, внедренной в плазмиду, а также за счет функционализации рестрикционным ферментом и ферментом лигаза;

(13) для иммобилизации и культивирования клеток на поверхности опор из микропроволоки. Эту микропроволоку с иммобилизованными клетками на поверхности можно использовать в качестве биоферментера для выращивания клеток;

(14) для твердофазной ПЦР путем иммобилизации подходящих для этого метода затравок;

(15) для обеззараживания текучей среды путем иммобилизации загрязняющих агентов на поверхности опор из микропроволоки;

(16) для любого из вышеуказанных приложений при обращении с вязкими текучими средами с высокой концентрацией тве