2411720 - Генетическая модификация mon89788 сои и способы ее определения

Генетическая модификация mon89788 сои и способы ее определения

Иллюстрации

Показать все

Растения и семена сои, включающие генетическую трансформацию MON89788, обладают устойчивостью к глифосату. Раскрываются также способы определения присутствия в образце молекул ДНК, кодирующих указанную генетическую трансформацию. 12 н. и 12 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

Реферат

ОПИСАНИЕ

Предпосылки изобретения

Эта заявка притязает на приоритет предварительной заявки США № 60/685,584, зарегистрированной 27 мая, 2005, содержание которой включено в данное описание посредством ссылки.

1. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новому и отличительному образцу трансгенной трансформации сои, обозначенному как генная модификация MON89788, полученному из него культурному сорту сои, частей растений и продуктов. К изобретению также относятся способы определения присутствия молекулы ДНК, специфичной для MON89788, в экстракте частей растения или экстракте семян.

2. Описание связанной области

Соя (Glycine max) представляет собой важную сельскохозяйственную культуру во многих областях мира. Для усовершенствования агрономических свойств и качества продукта к сое были применены способы биотехнологии. Одно такое агрономическое свойство, важное в получении сои, представляет собой устойчивость к гербицидам, в частности устойчивость к гербициду глифосату. Линия сои, устойчивая к гербицидам, была бы полезным свойством при борьбе с сорняками.

N-фосфонометилглицин, также известный как глифосат, представляет собой хорошо известный гербицид, который обладает активностью к широкому спектру видов растений. Глифосат представляет собой активный ингредиент Roundup® (Monsanto Co., St. Louis, MO), безопасный гербицид, имеющий подходящий короткий период полужизни в окружающей среде. При нанесении на поверхность растения, глифосат системно перемещается по растению. Глифосат является фитотоксичным вследствие его подавления пути шикимовой кислоты, который обеспечивает прекурсор в синтезе ароматических аминокислот. Глифосат подавляет фермент 5-енолпирувил-3-фосфошикиматсинтазу (EPSPS), обнаруженную в растениях.

Устойчивость к глифосату может достигаться экспрессией вариантов EPSPS, которые обладают более низким сродством к глифосату и поэтому сохраняют свою каталитическую активность в присутствии глифосата (патенты США № 5633435; 5094945; 4535060 и 6040497). Ферменты, которые разрушают глифосат в тканях растений (патент США № 5463175), также способны придавать клеточную устойчивость к глифосату. Такие гены используют для получения трансгенных сельскохозяйственных культур, которые устойчивы к глифосату, тем самым, позволяя использовать глифосат для эффективной борьбы с сорняками с минимальным опасением повреждения сельскохозяственной культуры. Например, устойчивость к глифосату была генетически сконструирована в кукурузе (патент США № 5554798), пшенице (патент США 6689880), хлопке (патент США 6740488), сое (WO 9200377) и рапсе (патентная заявка США 20040018518). Трансгены устойчивости к глифосату и трансгены устойчивости к другим гербицидам, например, ген bar, (Toki et al., 1992; Thompson et al., 1987; фосфинотрицин ацетилтрансфераза (DeBlock et al., 1987), для устойчивости к гербициду глюфозината) также полезны в качестве селектируемых маркеров или оценивающих маркеров, и могут обеспечить полезный фенотип для отбора растений, связанных с другими агрономически полезными свойствами.

Известно, что экспрессия чужеродных генов в растениях находится под влиянием их хромосомного положения, возможно вследствие структуры хроматина (например, гетерохроматин) или близости элементов регуляции транскрипции (например, энхансеры) вблизи сайта интеграции (Weising et al., 1988). По этой причине это часто является необходимым для скрининга большого числа случаев для того, чтобы идентифицировать случай, характеризующийся оптимальной экспрессией представляющего интерес гена. Например, было обнаружено, что в растениях и в других организмах может существовать значительная разница в уровнях экспрессии внедренного гена среди оцениваемых случаев. Также могут существовать различия в пространственных и временных структурах экспрессии, например различия в относительной экспрессии трансгена в различных тканях растений, которые не могут соответствовать структурам, ожидаемым из элементов регуляции транскрипции, представленным во внедренном генном конструкте. По этой причине принято получать от сотен до тысяч различных генетически модифицированных образцов и производить скрининг таких образцов до единичного варианта, который обладает желательными в коммерческих целях уровнями экспрессии трансгенов и структурами. Образец, который обладает желательными уровнями и структурами экспрессии трансгенов, является полезным для интрогрессии трансгена внутрь других генетических фонов путем случайного полового скрещивания с использованием традиционных способов селекции. Потомство таких скрещиваний поддерживает характеристики экспрессии трансгенов исходного трансформанта. Эта стратегия используется, чтобы обеспечить надежную экспрессию генов в ряде разновидностей, которые хорошо адаптируются к местным условиям произрастания.

Было бы выгодно уметь определять присутствие конкретного образца для того, чтобы определить, содержит ли потомство полового скрещивания интересующий трансген. Кроме того, способ определения конкретного образца был бы полезен для соответствия нормам, требующих предрыночного разрешения и, в частности, для маркировки пищевых продуктов, полученных из растений сельскохозяственных культур. Возможно определить присутствие трансгена любым хорошо известным способом обнаружения полинуклеиновых кислот, таким как полимеразная цепная реакция (PCR) или гибридизация ДНК с использованием полинуклеиновых кислот в качестве зондов. Эти способы определения обычно фокусируются на часто употребляемых генетических элементах, таких как промоторы, терминаторы, маркерные гены и так далее. В результате, такие способы не могут быть полезными для проведения различий между различными генетически модифицированными образцами (линиями), в частности такими, которые получены с использованием того же самого ДНК конструкта за исключением последовательности хромосомной ДНК ("фланкирующая ДНК"), расположенной рядом с включенной трансгенной ДНК. Специфический PCR анализ для линий обсуждается, например, Windels et al. (1999), который идентифицировал линию устойчивых к глифосату сои 40-3-2 путем PCR с использованием набора праймеров, перекрывающих участок соединения между вставленным трансгеном и фланкирующей ДНК, в частности, используя один праймер, который включал в себя последовательность из вставки, и второй праймер, который включал в себя последовательность из фланкирующей ДНК. Способы обнаружения специфической ДНК генетически модифицированного трансгенного растения также были описаны в патентах США № 6893826; 6825400; 6740488; 6733974 и 6689880; 6900014 и 6818807, содержание каждой из которых включено полностью в данное описание посредством ссылки.

Это изобретение относятся к генетически модифицированной глифосатустойчивой сое MON89788 (также названной как MON19788 или GM_A19788) и к молекулам ДНК, содержащимся в этих растениях сои, которые являются полезными в способах определения растения и его потомства, и тканей растения, полученных из MON89788.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к трансгенной генетически модифицированной сое, обозначенной как MON89788 (также названной как MON19788), и ее потомству, имеющему показательные семена, депонированным в American Type Culture Collection (ATCC) под номером PTA-6708. Другим аспектом изобретения являются клетки растений или регенерируемые части растения или семян сои с генной модификацией MON89788. Также изобретение включает в себя части растений сои с генной модификацией MON89788, которые включают, но не ограничиваются перечисленным, клетки, пыльцу, семязачаток, цветы, побеги, корни, листья и продукты, полученные из MON89788, например соевую крупу, муку и масло.

Один аспект изобретения относится к композициям и способам для определения присутствия трансгенной/геномной соединенной области ДНК растения или семени или продуктов, полученных из частей растений или семян сои с генной модификацией MON89788. Представлены молекулы ДНК, которые включают, по меньшей мере, одну молекулу ДНК с трансгенным/геномным участком соединения, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 (см. последовательности в конце описания изобретения), и их комплементы, где соединенная молекула перекрывает вставленный сайт, который включает гетерологичную ДНК, вставленную в геном клетки сои, и геномную ДНК из клетки сои, фланкирующую вставленный сайт сои с генной модификацией MON89788. Такие соединенные последовательности могут, в одном аспекте изобретения, быть определены как включающие нуклеотиды 1093-1113 или 5396-5416 из SEQ ID NO:9, соответственно. В других аспектах изобретения, соединения могут быть определены как включающие дополнительные участки фланкирующего генома или трансгена, например, и могут быть определены как включающие одну или более последовательностей, представленную нуклеотидами 1073-1113, 1043-1113, 1093-1133, 1093-1163, 1043-1163, 5376-5416, 5346-5416, 5396-5436, 5396-5416, 5396-5466 или 5346-5466 из SEQ ID NO:9. Поэтому такие последовательности и растения, и семена, включающие эти последовательности, являются одним из аспектов изобретения.

Представлена новая молекула ДНК, которая представляет собой трансгенную/геномную область ДНК SEQ ID NO:3 или ее комплемент, из сои с генной модификацией MON89788. Растение сои и семена, включающие SEQ ID NO:3 в своем геноме, представляют собой один из аспектов настоящего изобретения. SEQ ID NO:3 дополнительно включает SEQ ID NO:1 полностью.

Согласно другому аспекту изобретения, представлена молекула ДНК, которая представляет собой трансгенную/геномную область ДНК SEQ ID NO:4, или ее комплемент, в котором эта молекула ДНК является новой для сои с генной модификацией MON89788. Растение сои и семена, включающие SEQ ID NO:4 в своем геноме, представляет собой один из аспектов настоящего изобретения. SEQ ID NO:4 дополнительно включает SEQ ID NO:2 полностью.

Согласно другому аспекту изобретения, представлены две молекулы нуклеиновых кислот для использования в способе обнаружения ДНК, в котором первая молекула нуклеиновой кислоты включает, по меньшей мере, 11 или более смежных полинуклеотидов любого участка трангенного участка молекулы ДНК из SEQ ID NO:3, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой молекулу сходной длины любого участка 5' фланкирующей области геномной ДНК сои из SEQ ID NO:3, в которой эти молекулы нуклеиновых кислот при совместном использовании являются полезными в качестве праймеров в способе амплификации ДНК, в котором производят ампликон. Ампликон, полученный с использованием этих праймеров в способе амплификации ДНК, является диагностическим для ДНК генной модификации MON89788. Ампликон, полученный с описанными праймерами, которые гомологичны или комплементарны участку из SEQ ID NO:3, включающему SEQ ID NO:1, является одним из аспектов изобретения.

Согласно другому аспекту изобретения, две молекулы нуклеиновых кислот предоставлены для использования в способе обнаружения ДНК, в котором первая молекула нуклеиновой кислоты включает, по меньшей мере, 11 или больше смежных полинуклеотидов любого участка трансгенной области молекулы ДНК из SEQ ID NO:4, и вторая молекула нуклеиновой кислоты аналогичной длины любого участка 3' фланкирующей геномной ДНК сои из SEQ ID NO:4, в которой эти молекулы нуклеиновых кислот при совместном использовании являются полезными в качестве праймеров в способе амплификации ДНК, в котором производят ампликон. Ампликон, полученный с использованием этих праймеров в способе амплификации ДНК, является диагностическим для ДНК генной модификации MON89788. Ампликон, полученный с описанными праймерами, которые гомологичны или комплементарны участку из SEQ ID NO:4, включающему SEQ ID NO:2, является одним из аспектов изобретения.

Любая пара праймеров нуклеиновых кислот, полученная из SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:9 или их комлементов, которые при использовании в реакции амплификации ДНК, производят диагностический ампликон для ткани из сои с генной модификацией MON89788, такой как ампликон, который включает SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или любой участок из SEQ ID NO:9, соответственно, представляет собой другой вариант осуществления изобретения. В конкретном варианте осуществления, пара праймеров может содержать праймер A (SEQ ID NO:5) и праймер D (SEQ ID NO:8).

Другой аспект изобретения представляет растение сои, или семена, или продукт, полученный из растения или семян, включающих генную модификацию MON89788, в которой геномная ДНК при выделении из растения сои, или семян, или продуктов, производит ампликон в способе амплификации ДНК, который включает SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

Еще один аспект изобретения представляет растение сои, или семена, или продукт, полученный из растения или семян, включающих MON89788, в которых геномная ДНК при выделении из растения сои, или семян, или продуктов, производит ампликон в способе амплификации ДНК, где в способе амплификации ДНК используются молекулы ДНК праймеров SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6.

Еще один аспект изобретения представляет собой растение сои, семена, продукт или товарный продукт (продукт потребления), полученные из растения или семян, включающих генную модификацию MON89788, в которой геномная ДНК при выделении из растения сои, или семян, или продуктов, производит ампликон в способе амплификации ДНК, где в способе амплификации ДНК используются молекулы ДНК праймеров SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8. Продукт или товарный продукт может включать в себя, без ограничения, пищевой продукт или продукт питания, включающий или полученный из одного или более следующих продуктов растений сои, включающих генную модификацию MON89788: лецитин, жирные кислоты, глицерин, стерол, пищевое масло, обезжиренные соевые хлопья, соевые крупы, включающие в себя обезжиренные и высушенные соевые крупы, свернувшееся соевое молоко, соевый творог, соевую муку, концентрат соевого белка, выделенный соевый белок, растворенный в воде растительный белок, текстурат сои и соевое белковое волокно.

Согласно другому аспекту изобретения, представлен способ определения в образце присутствия ДНК, соответствующей, в частности, ДНК сои с генной модификацией MON89788. Такой способ включает: (a) контактирование образца, включающего ДНК с зондом, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с геномной ДНК из сои с генной модификацией MON89788 и не гибридизуется в жестких условиях гибридизации с ДНК контрольного растения сои; (b) подвергание образца и зонда жестким условиям гибридизации; и (c) определение гибридизации зонда с ДНК сои с генной модификацией MON89788, в котором указанный зонд включает SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Образец может включать в себя семена, растения потомства, или часть растения, включающие генную модификацию сои MON89788, или любой из следующих продуктов, полученных из растения, включающего MON89788: лецитин, жирные кислоты, глицерин, стерол, пищевое масло, обезжиренные соевые хлопья, соевые крупы, включающие в себя обезжиренные и высушенные соевые крупы, свернувшееся соевое молоко, соевый творог, соевую муку, концентрат соевого белка, выделенный соевый белок, растворенный в воде растительный белок, текстурат сои и соевое белковое волокно. Набор, включающий ДНК зонд, содержащий молекулу ДНК, которая гомологична или комплементарна к SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, представляет собой один из аспектов изобретения. Набор, содержащий молекулу ДНК, включающую SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, или SEQ ID NO:20, или их комплементы, также представляют собой один из аспектов изобретения.

Согласно другому аспекту изобретения, представлен способ получения растения сои, которое устойчиво к применению глифосата, который включает в себя стадии: (a) половое скрещивание первого родительского устойчивого к глифосату растения сои, включающего генную модификацию MON89788, и второго родительского растения сои, которые не имеют устойчивость к глифосату, получая при этом множество растений потомства; и (b) выделение растения потомства, которое устойчиво к применению глифосата. Способы селекции могут дополнительно включать в себя стадии скрещивания родительского растения, включающего генную модификацию сои MON89788, со вторым родительским растением сои, которое также устойчиво к глифосату, и выделение устойчивого к глифосату потомства с помощью молекулярной маркерной ДНК, генетически связанной с устойчивым к глифосату фенотипом, обнаруженным у каждого родителя.

Другой аспект изобретения представляет собой способ борьбы с сорняками на поле растений сои, включающих генную модификацию MON89788, в котором указанный способ включает засеивание поля семенами сои, содержащими генную модификацию MON89788, где указанные показательные семена депонированы в ATCC под инвентарным № PTA-6708, обеспечение роста указанных семян и обработку указанных растений эффективной дозой глифосата для борьбы с сорняками на указанных полях.

Изложенные выше и другие аспекты изобретения станут более понятны из следующего подробного описания и прилагаемых чертежей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. Организация трансгенной вставки в геном растения сои, включающего генную модификацию MON89788.

Фиг.2A-2B. Обработка товарных продуктов из сои.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение относится к новой трансформированной сое с генетической модификацией, обозначенной как MON89788, которая обеспечивает устойчивость к глифосату, и частям растений, и семенам, и продуктам, произведенных из растений, частей растений, семян, и продуктов, включающих указанную генетическую модификацию. Изобретение представляет молекулы ДНК, которые являются новыми в геноме клеток сои, включающем генетическую модификацию MON89788 и молекулы ДНК, которые могут быть использованы в различных способах обнаружения ДНК для идентификации ДНК MON89788 в образце. Изобретение представляет способ борьбы с сорняками в поле растений, содержащих MON89788, путем обработки сорняков в поле, содержащем растения, содержащие генетическую модификацию MON89788, гербицидом глифосатом.

Следующие определения и способы представлены для лучшего описания настоящего изобретения и для инструктирования специалистов в данной области в практике настоящего изобретения. Если не указано особо, термины представлены, чтобы быть понятными специалистам, компетентным в данной области. Определения общих терминов в молекулярной биологии также можно обнаружить в Rieger et al. (1991) и Lewin (1994). Используется номенклатура для оснований ДНК, как представлено в § 1.822 37 CFR.

Для использования в данном описании, термин "соя" означает Glycine max и включает в себя все модификации растения, которые могут быть выведены из сои.

Для использования в данном описании, термин "включающий" означает "включающий, но не ограничивающийся".

"Глифосат" относится к N-фосфонометилглицину и его солям. Глифосат представляет собой активный компонент Roundup® гербицида (Monsanto Co.). Обработка "гербицидом глифосатом" относится к обработкам с использованием гербецидов Roundup®, Roundup Ultra®, Roundup Pro® или любым другим гербицидным соединением, содержащим глифосат. Примеры коммерческих препаратов глифосата включают, без ограничений, препараты, продаваемые Monsanto Company как гербициды ROUNDUP®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® ULTRAMAX, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIACTIVE, ROUNDUP® BIOFORCE, RODEO®, POLARIS®, SPARK® и ACCORD®, все из которых содержат глифосат в виде его соли изопропиламмония; ROUNDUP® WEATHERMAX (калиевая соль глифосата), препараты, продаваемые Monsanto Company как гербициды ROUNDUP® DRY и RIVAL®, которые содержат глифосат в виде его аммонийной соли; препараты, продаваемые Monsanto Company как ROUNDUP® GEOFORCE, которые содержат глифосат в виде его натриевой соли; и препараты, продаваемые Syngenta Crop Protection как гербицид TOUCHDOWN®, который содержит глифосат в виде его триметилсульфониевой соли. Обработка поля, содержащего растения сои, устойчивые к глифосату, включающие линию MON89788, любыми из этих соединений гербицида глифосата будет контролировать рост сорняков на поле и не будет влиять на рост или урожайность растений сои, включающих генетическую модификацию MON89788.

Трансгенную "генетическую модификацию" получают трансформацией клеток растения гетерологичной ДНК, например, нуклеиновокислотным конструктом, который включает в себя интересующий трансген, восстановлением популяции растений, полученных в результате вставки трансгена в геном растения, и селекцией отдельного растения, характеризующегося вставкой в отдельный участок генома. Термин "генетически модифицированный" относится к исходной трансформации и потомству трансформанта, которые включают в себя гетерологичную ДНК. Термин "генетически модифицированный" также относится к потомству, полученному путем полового скрещивания между трансформантом и другой модификацией, который включает в себя гетерологичную трансгенную ДНК и фланкирующую геномную ДНК. Термин “генетически модифицированный" также относится к ДНК исходного трансформанта, включающего вставленную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, непосредственно примыкающую к вставленной ДНК, для которой можно было бы ожидать ее перемещение в потомство, которое получает вставленную ДНК, включающую в себя интересующий трансген как результат полового скрещивания одной родительской клеточной линии, которая включает в себя вставленную ДНК (например, исходный трансформант и потомство, полученное в результате самоопыления), и родительской линии, которая не содержит вставленную ДНК.

Растение сои, устойчивое к глифосату, может быть выращено первым половым скрещиванием первого родительского растения сои, состоящего из растения сои, выращенного из трансгенного глифосат-устойчивого растения сои, включающего MON89788, или растение сои, которое является потомством скрещивания такого растения, которое экспрессирует глифосат-устойчивый фенотип, и второго родительского растения сои, которое не обладает устойчивостью к глифосату, получая, таким образом, множество растений первого потомства; и затем отбирая растение потомства, которое устойчиво к применению гербицида глифосата. Эти стадии дополнительно могут включать обратное скрещивание глифосат-устойчивого растения потомства со вторым родительским растением сои или третьим родительским растением сои с последующим отбором потомства путем применения глифосата или идентификацией молекулярных маркеров, связанных со свойством, получая, таким образом, растение сои, которое устойчиво к применению гербицида глифосата. Можно использовать молекулярные маркеры, которые включают соединенные молекулы ДНК, идентифицированные в 5' и 3' участках вставки трансгена в генетическую модификацию MON89788.

Также понятно, что два различных трансгенных растения могут также быть скрещены с получением потомства, которое содержит два независимо выделенных экзогенных трансгена. Также рассмотрено обратное скрещивание с родительским растением и перекрестное скрещивание с нетрансгенным растением, как описано ранее для вегетативного размножения. Описания других способов селекции, которые распространены для различных свойств и сельскохозяйственных культур, можно обнаружить в одной из нескольких ссылок, например, Fehr, (1987).

"Зонд" это выделенная нуклеиновая кислота, к которой прикрепляют обычную детектируемую метку или репортерную молекулу, например, радиоактивный изотоп, лиганд, хемилюминесцентный агент или фермент. Такой зонд комплементарен к цепи мишенной нуклеиновой кислоты, и в случае настоящего изобретения - к цепи геномной ДНК растения сои, включающего генетическую модификацию MON89788, в любом из растения сои или семян, или из образца или экстракта растения или семян, которые включают указанную генетическую модификацию ДНК. Зонды согласно настоящему изобретению включают в себя не только дезоксирибонуклеиновую или рибонуклеиновую кислоты, но также полиамиды и другие материалы зондов, которые связываются специфически с мишенной последовательностью ДНК и могут использоваться для обнаружения присутствия этой мишенной последовательности ДНК.

"Праймеры" представляют собой выделенные полинуклеиновые кислоты, которые отжигаются в комплементарные цепи мишенной полинуклеиновой кислоты путем гибридизации нуклеиновой кислоты с образованием гибрида между праймером и мишенной цепью полинуклеиновой кислоты, с последующим удлинением вдоль мишенной цепи полинуклеиновой кислоты с помощью полимеразы, например, ДНК полимеразы. Пары праймеров настоящего изобретения связаны с использованием их для амплификации молекулы мишенной полинуклеиновой кислоты, например, полимеразной цепной реакцией (PCR) или другими обычными способами амплификации нуклеиновых кислот.

Зонды и праймеры обычно имеют 11 полинуклеотидов или более в длину, предпочтительно 18 полинуклеотидов или более, более предпочтительно 24 полинуклеотидов или 30 полинуклеотидов или более. Такие зонды и праймеры гибридизуются специфически с мишенной молекулой при гибридизации в условиях высокой жесткости. Предпочтительно, зонды и праймеры согласно настоящему изобретению обладают полной идентичностью последовательностей с мишенной молекулой, хотя зонды, отличающие от последовательности мишени и которые сохраняют способность к гибридизации к последовательности мишени в условиях высокой жесткости, могут быть сконструированы стандартными способами.

Способы получения и использования зондов и праймеров описаны, например, в Sambrook et al. (1989); Ausubel et al. (1992); и Innis et al. (1990). Пары PCR-праймеров (набор праймеров) могут быть выведены из известной последовательности, например, используя компьютерные программы, специально предназначенные для этого, такие как Primer (Version 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).

Праймеры и зонды, основанные на фланкирующей геномной ДНК и последовательностях вставки, раскрытые в данном описании (SEQ ID NO:1-4 и 9), могут использоваться для подтверждения и, если необходимо, для исправления раскрытых последовательностей стандартными способами, например, путем выделения соответствующей молекулы ДНК из депонированных семян, включающих MON89788, и для определения последовательности нуклеиновых кислот таких молекул. Дополнительно связанные молекулы ДНК можно выделить из генома клетки, включающей MON89788, который включает трансгенную вставку и геномную фланкирующую область, и фрагменты этих молекул можно использовать в качестве праймеров или зондов.

Зонды и праймеры нуклеиновых кислот настоящего изобретения гибридизируются при жестких условиях с мишенной последовательностью ДНК. Любой обычный способ гибридизации или амплификации нуклеиновых кислот можно использовать для идентификации присутствия ДНК из линии MON89788 в образце. Молекулы нуклеиновых кислот или их фрагменты поддаются специфической гибридизации с другими молекулами нуклеиновых кислот при некоторых обстоятельствах. Как использовано в данном описании, считается, что две молекулы нуклеиновых кислот поддаются специфической гибридизации друг с другом, если две молекулы способны к образованию антипараллельной, двухцепочной структуры нуклеиновых кислот и являются достаточно длинными для сохранения этой структуры в условиях высокой жесткости. Считается, что молекула нуклеиновой кислоты является "комплементарной" другой молекуле нуклеиновой кислоты, если они проявляют полную комплементарность. Как использовано в данном описании, считается, что молекулы проявляют "полную комплементарность", когда каждый нуклеотид одной из молекул комплементарен нуклеотиду другой. Считается, что две молекулы являются "минимально комплементарными", если они могут гибридизоваться друг с другом достаточно стабильно, чтобы позволить им остаться отожженными друг с другом при, по меньшей мере, обычных условиях "низкой жесткости". Аналогично, считается, что молекулы являются "комплементарными", если они могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью, чтобы позволить им остаться отожженными друг с другом при обычных условиях "высокой жесткости". Обычные жесткие условия описаны Sambrook et al., 1989, и Haymes et al. (1985). Таким образом отступления от полной комплементарности позволительны, поскольку такие отступления никогда не предотвращают полностью способность молекул образовывать двухцепочечную структуру. Чтобы молекула нуклеиновых кислот выполняла функцию праймера или зонда, необходима только достаточная комплементарность последовательности, чтобы быть способной к образованию стабильной двухцепочечной структуры в использованных конкретном растворителе и концентрациях соли.

Как использовано в данном описании, значительно гомологичная последовательность представляет собой последовательность нуклеиновых кислот, которая специфически гибридизуется с комплементарной последовательностью нуклеиновых кислот, с которой она сопоставима в условиях высокой жесткости. Подходящие жесткие условия, которые способствуют гибридизации ДНК, например, 6,0 X хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при примерно 45°C, с последующей отмывкой 2,0 x SSC при 50°C, известны специалисту в данной области или могут быть найдены в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Например, концентрацию соли на стадии отмывки можно выбрать от низкой жесткости, примерно 2,0 x SSC при 50°C, до высокой жесткости, примерно 0,2 x SSC при 50°C. Кроме того, температуру на стадии отмывки можно увеличить от условий низкой жесткости при комнатной температуре, примерно 22°C, до условий высокой жесткости при примерно 65°C. Можно изменять как температуру, так и соль, или можно оставлять постоянными либо температуру, либо концентрацию соли, тогда как оставшийся параметр изменится. В предпочтительном варианте осуществления, нуклеиновая кислота настоящего изобретения специфически гибридизуется с одной или более молекулам нуклеиновых кислот, представленными в SEQ ID NO:1-4 и 9, их комплементами или фрагментами, при умеренно жестких условиях, например, при примерно 2,0 x SSC и примерно 65°C. В частности, в предпочтительном варианте осуществления, нуклеиновая кислота настоящего изобретения специфически гибридизовалась с одной или более молекулам нуклеиновых кислот, представленными в SEQ ID NO:1-4 и 9, их комплементах или фрагментах, при условиях высокой жесткости. В одном аспекте настоящего изобретения, предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения включает последовательность нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или их комплементах или фрагментах. В другом аспекте настоящего изобретения, предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения имеет от 80% до 100% или от 90% до 100% идентичности последовательности с последовательностью нуклеиновых кислот, представленных в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или их комплементах или фрагментах. Молекулярные маркерные молекулы ДНК, которые включают SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, или их комплементы или фрагменты, можно использовать в качестве маркеров в способах селекции растений для идентификации потомства генетического скрещивания, сходного со способами, описанными для простого маркерного анализа повторов последовательности ДНК, в Cregan et al. (1997); каждое из которых полностью включено в данное описание посредством ссылки. Гибридизация зонда с мишенной молекулой ДНК может быть определена любыми способами, известными специалистам в данной области, и они могут включать, но ими не ограничиваться, флуоресцентные метки, радиоактивные метки, метки, основанные на антителах, и хемилюминесцентные метки.

Рассматривая амплификацию мишенной последовательности нуклеиновых кислот (например, PCR) с использованием специфической амплификационной пары праймеров, "жесткие условия" представляют собой условия, которые позволяют паре праймеров гибридизоваться только с мишенной последовательностью нуклеиновых кислот, с которой праймер, имеющий соответствующую последовательность дикого типа (или ее комплемент), может связываться и предпочтительно производить уникальный продукт амплификации, ампликон, в термальной реакции амплификации ДНК.

Термин "специфический для (мишенной последовательности)" показывает, что зонд или праймер гибридизуется в строгих условиях гибридизации только с мишенной последовательностью в образце, включающем мишенную последовательность.

Как использовано в данном описании, "амплифицированная ДНК" или "ампликон" относятся к продукту амплификации нуклеиновых кислот мишенной последовательности нуклеиновых кислот, которая является частью матрицы нуклеиновых кислот. Например, для определения, содержит ли растение сои, полученное половым скрещиванием, трансген с генетической модификацией MON89788, или включает ли образец сои, собранный с поля, MON89788, или экстракт сои, такой как крупа, мука или масло, включает ли MON89788. ДНК, выделенные из образца ткани растения сои или экстракта, может быть подвергнута способу амплификации нуклеиновых кислот с использованием пары праймеров, которые включают в себя праймер, полученный из прилегающей геномной области инсерционного сайта вставленной гетерологичной трансгенной ДНК, и второй праймер, полученный из вставленной гетерологичной трансгеной ДНК для производства ампликона, который является диагностическим для случая присутствия ДНК. Ампликон имеет длину и имеет последовательность, которая также является диагностической для случая. Ампликон может изменять длину от общей длины пары праймеров, плюс одна нуклеотидная пара основания, или плюс примерно пятьдесят пар нуклеотидных оснований, или плюс примерно двести пятьдесят пар нуклеотидных оснований, или плюс примерно триста пятьдесят пар нуклеотидных оснований или больше.

Альтернативно, пару праймеров можно получить из фланкирующей геномной последовательности на обеих сторонах вставленной ДНК, с тем, чтобы получить ампликон, который включает в себя полную вставленную нуклеотидную последовательность. Член пары праймеров, полученной из геномной последовательности растения, может располагаться на расстоянии от вставленной трансгенной молекулы ДНК, это расстояние может изменяться от одной нуклеотидной пары основания выше до примерно двадцати тысяч пар нуклеотидных оснований. В частности, использование термина "ампликон” исключает димеры праймеров, которые могут образовываться в термальной реакции амплификации ДНК.

Амплификация нуклеиновых кислот может проводиться любым из разных способов реакции амплификации нуклеиновых кислот, известных в данной области, включающих в себя полимеразную цепную реакцию (PCR). Множество способов амплификации известны в данной области и описаны, inter alia, в патентах США № 4683195 и 4683202 и в Innis et al. (1990). Способы амплификации PCR были разработаны для увеличения до 22 тыс.п.о. геномной ДНК и до 42 тыс.п.о. ДНК бактериофагов (Cheng et al., 1994). Эти способы, а также другие способы, известные в данной области амплификации ДНК, могут использоваться в практике настоящего изобретения. Последовательность гетерологичной вставки ДНК или фланкирующей последовательности из линии сои MON89788 может быть верифицирована и исправлена, если необходимо, путем амплифицирования таких молекул из генома линии, используя праймеры, полученные из последовательностей, представленных в данном описании, последующими способами стандартного секвенирования ДНК, примененных к PCR ампликону или к выделенной клонированной трансгенной/геномной ДНК.

Ампликон, полученный этими способами, можно обнаружить множеством способов. Один такой способ представляет Genetic Bit Analysis (Nikiforov et al., 1994), где олигонуклеотид ДНК предназначен для перекрывания как примыкающей фланкирующей геномной последовательности ДНК, так и вставленной трансгенной последовательности ДНК. Олигонуклеотид иммобилизован на стенках микролуночного планшета. После PCR интересующей области (используя один праймер во вставленной последовательности и один в примыкающей фланкирующей геномной послед

Генетическая модификация mon89788 сои и способы ее определения

Патент 2411720