Противоопухолевые биоконъюгаты гиалуроновой кислоты или ее производных, полученные непрямой химической конъюгацией

Противоопухолевые биоконъюгаты гиалуроновой кислоты или ее производных, полученные непрямой химической конъюгацией

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Развитие опухоли, ее рост и развитие первичных и вторичных метастазов являются чрезвычайно сложными биологическими процессами, для которых требуется последовательное формирование клеточных событий (органо-селективных), скоординированных друг с другом.

Диссеминация опухолевых клеток, которая приводит к образованию метастазов, происходит в результате их отделения от первичного места образования, с последующим их проникновением в кровеносное русло и/или в лимфатическую систему.

В последние несколько лет увеличивающиеся знания о существенных процессах, которые вызывают начало, развитие, диссеминацию и имплантацию опухоли и ее метастазирование, не только предлагают исследователям возможность изучения, синтеза и/или экспериментального изучения новых химических молекул в качестве новых противоопухолевых агентов, но также способствуют изучению и совершенствованию новых терапевтических подходов, которые преодолевают проблемы, связанные с токсичностью антинеопластических лекарственных средств, и, кроме того, способствуют пониманию химико-биологических механизмов, которые вызывают резистентность к указанному выше лекарственному средству.

Одна из главных причин, связанных с лечением опухолей, фактически относится к возможной «резистентности» опухоли к фармакологическому лечению после первоначального положительного эффекта.

Эти «резистентности» связаны с биологическими/биохимическими изменениями в функционировании опухолевой клетки, такими как, например:

- изменения в клеточном транспорте лекарственного средства;

- изменение аффинности к ней со стороны возможного ингибитора метаболизма;

- значительное увеличение способности самой клетки инактивировать лекарственное средство.

Опубликованные в последнее время научные исследования (Mistra et al., The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(28): 25285-25288) показали, как предварительная/одновременная обработка in vitro опухолевых клеток, резистентных к некоторым химиотерапевтическим лекарственным средствам, олигомерами гиалуроновой кислоты (НА), имеющими очень низкую молекулярную массу, восстанавливает первоначальную чувствительность клетки к лекарственному средству. Экспериментальные данные, полученные до настоящего времени, однако, полностью не объясняют, как/почему восстанавливается чувствительность к химиотерапии, хотя наблюдалось, что эти олигомеры способны вмешиваться в различные молекулярные события в клетке, ответственные за приобретение резистентности к лекарственному средству и, следовательно, в рост и распространение опухоли.

Фармакологическое действие вышеназванного олигомера становится возможным, потому что, поскольку он сам связывается с рецептором CD-44 (специфическим для гиалуроновой кислоты), он начинает негативно влиять на связь нативная НА-рецептор, взаимодействие, которое является ответственным за координацию многочисленных функций клеток, и прежде всего опухолевой клетки.

Посредством связывания со своим рецептором, присутствующим в клеточной мембране (и последующей его интернализации), НА фактически участвует в активации многих событий, которые имеют первостепенное значение для жизни клетки, таких как, например, регулирование процессов адгезии/развития и клеточной миграции, она инициирует механизм хемотаксиса во время воспалительных процессов, играет важную роль в процессах заживления и, как упомянуто выше, в миграции опухолевых клеток с образованием метастазов.

Многие солидные опухоли действительно демонстрируют высокие количества НА, которая может в результате способствовать проникновению опухолевых клеток в другие ткани и органы.

Опухолевые формы, такие как, например, карциномы, меланомы, лимфомы, опухоли молочной железы, колоноректальные опухоли и опухоли легких, сверхэкспрессируют трансмембранный рецептор CD-44: в этих клеточных линиях эксперименты, проведенные с антирецепторными антителами (которые в результате «блокируют» рецептор, предотвращая его связывание с нативной НА), показали эффективную способность ингибировать новообразования и опухолевые метастазы, таким образом демонстрируя, как «вмешательство» в связывание НА с ее рецептором вызывает нарушение многочисленных событий, имеющих принципиальную важность для жизни клетки, и демонстрируют, следовательно, реальное участие НА в развитии опухолевой массы.

Известно, что некоторые противоопухолевые лекарственные средства, которые в течение многих лет используются в онкологии с удовлетворительными клиническими результатами, были химически модифицированы для того, чтобы:

- преодолеть проблему присущей им токсичности с целью осуществления новой лечебной стратегии, состоящей в направлении антинеопластического лекарственного средства непосредственно в опухолевую клетку, связывая его с НА, так как многие опухолевые фенотипы, как подробнее описано выше, сверхэкспрессируют на своей клеточной поверхности специфический CD-44 рецептор к НА (это является активным нацеливающим механизмом, который усиливает клеточную эффективность лекарственного средства, уменьшая его системную токсичность). Связывание и интернализация полимера также переносит лекарственное средство внутрь опухолевой клетки, повышая его эффективность;

- повысить их растворимость (показано, что связывание жирорастворимых лекарственных средств с сильно гидрофильными молекулами, такими как, например, НА, значительно увеличивает растворимость самого лекарственного средства в кровеносной системе).

Растворимость химиотерапевтических лекарственных средств в кровеносной системе фактически является существенным условием их фармакологической эффективности, однако некоторые лекарственные средства, для которых подтверждена исключительная активность в различных типах опухолей, такие как кампотецины и их производные иринотекан и топотекан, паклитаксел и алкалоиды, винка-производные, из-за высокой степени их нерастворимости имеют проблемы в отношении внутривенного введения (а для гормонов и антигормонов также внутримышечного), которые могут ограничить и сузить их клиническое применение.

По причинам, изложенным выше (растворимость и токсичность), были синтезированы новые химиотерапевтические лекарственные средства, которые создают при помощи химической связи (непосредственной или непрямой, через спейсер, состоящий из аминокислот или пептидов с короткой аминокислотной цепочкой) или простой ассоциации некоторых антинеопластических лекарственных средств, содержащих лактоновое кольцо (таких как, например, доксорубицин, паклитаксел, винкристин, винбластин и производные камптотецина), с гиалуроновой кислотой (патент US 6291671).

Другие конъюгаты содержат антинеопластические лекарственные средства, такие как паклитаксел и кампотецины, связанные с полимером, состоящим из полиглутаминовой кислоты, возможно в ассоциации с НА (патент US 5977163).

Также известны другие новые типы химиотерапевтических лекарственных средств, представленные противоопухолевым доксорубицином, ковалентно связанным как с НА (химически модифицированной дигидразидом), так и с носителем, таким как полимер гидроксипропилметакриламид (международная патентная заявка WO 02/090390).

Также известны новые лекарственные средства с носителем, состоящие из полисахаридов, химически конъюгированных с аминокислотными цепочками, в свою очередь, ковалентно связанных с антинеопластическими лекарственными средствами, такими как доксорубицин (патент US 5688931). Кроме того, по той же причине, были усовершенствованы другие системы доставки, заключающиеся, например, в инкапсулировании доксорубицина в липосомы, содержащие липидные производные НА (Peer D. et al., Neoplasia, 2004, 6(4): 343-353; Eliaz R.E. et al., Cancer Research, 2001, 61: 2592-2601).

Известно, например, что, для того, чтобы преодолеть проблемы, связанные с производными кампотецина, изменить их фармакокинетический профиль и уменьшить их токсичность, увеличивая их терапевтическую эффективность, иринотекан конъюгировали с полимером/носителем карбоксиметилдекстраном при помощи спейсера, представляющего собой триглицинпептид (Satoshi Okuno et al., Cancer Research, 2000, 60:2988-2995: патент US 5892043).

Полученное в результате пролекарство демонстрирует активность в отношении терапевтической эффективности, так как оно остается в кровеносном русле в течение продолжительного периода времени, с увеличением накопления в опухолевой массе, с одновременным понижением системной токсичности; однако для многих конъюгатов, описанных ранее, не имеется определенных экспериментальных данных, подтверждающих их эффективность по сравнению с неконъюгированным лекарственным средством.

Также известны производные паклитаксела, ковалентно связанные с НА, предварительно дериватизированной гидразидом (патент US 5874417), или связанные с НА непосредственно или непрямо при помощи спейсера различной природы, способного образовывать разные типы химических связей, что повышает растворимость и, следовательно, эффективность лекарственного средства (патентная заявка ЕР 1560854).

В настоящем изобретении описаны и заявлены новые конъюгаты НА, полученные при помощи непрямой связи между полисахаридом и жирорастворимыми антинеопластическими лекарственными средствами, такими как, например, иринотекан и винка-алкалоиды, или с растворимыми или частично растворимыми химиотерапевтическими лекарственными средствами, такими как, например, доксорубицин и продукты-аналоги пиримидина, для уменьшения проблем, связанных с их растворимостью (если она имеется), их токсичностью и, главным образом, для восстановления и увеличения терапевтической эффективности лекарственного средства в опухолевых клетках, которые приобрели фармакологическую резистентность к самому лекарственному средству. Уровень техники, представленный производными, описанными ранее, следовательно, превзойден, так как заявитель может продемонстрировать фармакологическое превосходство новых конъюгатов, объекта данного изобретения, обусловленное крайне высокой цитотоксической способностью этих производных в отношении неопластических клеток.

Такая новая фармакологическая эффективность делает возможным применение в клинической фармакологии инновационных химиотерапевтических терапий для лечения первичных и/или вторичных опухолей, которые более не реагируют на какое-либо медицинское лечение, после формирования MDR (мультилекарственной резистентности), которая, как правило, ставит под угрозу возможность эффективного лечения пациента и поэтому в конечном счете существенно снижает среднюю продолжительность его жизни.

Решая проблему/преодолевая MDR, новые производные, объект настоящего изобретения, изменяет окончательный прогноз в отношении пациента и, следовательно, делает возможным решение проблемы/уменьшение опухолевой патологии.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении описаны и заявлена новая группа и способ получения конъюгатов/производных, состоящих из гиалуроновой кислоты (НА) (и/или ее производных) и противоопухолевых лекарственных средств, конъюгированных непрямым образом при помощи молекулярного моста, называемого «спейсер», состоящего из алифатической, аралифатической, алициклической или гетероциклической цепи, линейного или разветвленного, с гетероатомами или без них.

В частности, объектом данного изобретения являются химико-фармацевтические конъюгаты гиалуроновой кислоты и/или ее производных, полученные посредством непрямого связывания между полисахаридом и лекарственным средством с противоопухолевым действием, при помощи молекулярного спейсера, который образует эфирную или амидную связь с карбоксильной группой НА и/или ее производных, при условии, что указанный спейсер не является гидразидом или полипептидом.

НА (и/или одно из ее производных) и лекарственное средство, таким образом, непрямо конъюгированы посредством одной или более ковалентных связей эфирного или амидного типа, в которые частично или полностью вовлечены карбоксильные группы полисахарида и химические функциональные группы (например, гидроксильная, карбоксильная, аминогруппа и т.д.), принадлежащие спейсеру, который, в свою очередь, связан с противоопухолевым лекарственным средством, выбранным, как подробно описано ниже.

Производные, которые могут быть получены по настоящему изобретению, имеют различные физико-химические свойства, которые можно модулировать посредством выбора типа связи и степени замещения, так чтобы улучшить характеристики исходного химиотерапевтического лекарственного средства, такие как:

- растворимость,

- механические и реологические характеристики,

- устойчивость к гидролитическому разложению,

что делает новый конъюгат более эффективным в его цитотоксическом действии, производное, которое будет иметь новый механизм действия, таким образом преодолевая фармакологическую резистентность к самому лекарственному средству, приобретенную опухолевой клеткой (как описано выше).

Как известно, многие противоопухолевые лекарственные средства имеют ограниченную растворимость в воде или солевых растворах либо нерастворимы в них; это означает, что для их введения следует прибегать к органическим растворителям и маслам, которые, несмотря на то, что они переводят лекарственное средство в раствор, обладают собственной токсичностью и побочными эффектами, в результате чего требуется медицинское вмешательство перед введением продукта.

В некоторых случаях, для химиотерапевтического лекарственного средства иринотекан, активную форму (SN38), даже химически модифицируют (пролекарство), чтобы сделать его растворимым и способствовать высвобождению его метаболита, который активен после внутривенного введения. Это, однако, служит причиной низкой доступности метаболита SN38 в целевом сайте, в результате чего требуется введение высоких цитотоксичных доз с последующим усилением нежелательных побочных эффектов.

В международной литературе (Mathijssen RH et al., Clin Cancer Res, 2001, 7: 2182-2194) указано, что противоопухолевая активность SN38 в 100-1000 раз выше, чем у его имеющегося в продаже пролекарства; следовательно, возможность конъюгирования SN38 с гиалуроновой кислотой или с одним из ее производных по настоящему изобретению обеспечивает возможность получения соединений с повышенной эффективностью и, благодаря необходимости введения более низких дозировок, с меньшими побочными эффектами, связанными с диспергированием лекарственного средства в зонах, не пораженных неоплазией. Конъюгирование противоопухолевых лекарственных средств с НА также дает возможность "направлять" действующее вещество на его цель и, следовательно, в неопластическую ткань. Акцент, таким образом, делается на активный нацеливающий механизм между конъюгатом и неопластической клеткой, который увеличивает местную концентрацию лекарственного средства вблизи неопластической зоны и, следовательно, его эффективность. Таким образом, путем уменьшения распространения производного в здоровые ткани, кроме того, обеспечивается большая толерантность продукта по сравнению со свободным лекарственным средством.

Вторым важным преимуществом настоящего изобретения, главным образом благодаря присутствию химически модифицированной НА, является возможность технологического преобразования конъюгата в трехмерный биоматериал (для местного применения), получаемый в различных формах, таких как, например, гидрогель, нано- или микросферы или волокна, в свою очередь, формованные в сплетеные или несплетеные продукты; в этом случае химически модифицированная полисахаридная матрица находится в близком контакте с опухолевой массой, действует как система контролируемой доставки лекарственного средства в месте применения и, следовательно, способствует большей эффективности самого лекарственного средства. При осуществлении антинеопластического действия, производные разлагаются естественным и безопасным для организма образом, полностью высвобождая противоопухолевый активный компонент и гиалуроновую кислоту. Продукты, получаемые в изобретении, находятся ли они в форме классических фармакологических композиций или разлагаемых биоматериалов, следовательно, характеризуются большей толерантностью по сравнению с немодифицированным действующим веществом и более высокой фармакологической активностью, в некоторых случаях даже на несколько порядков выше активности, проявляемой образующим их действующим веществом; оба эффекта могут быть отнесены к специфической аффинности гиалуроновой кислоты к рецепторам, таким как CD44, присутствующим в опухолевых клетках. Эти эффекты выдвигаются на первый план, когда конъюгированное лекарственное средство вводят в форме трехмерного вещества, в непосредственном контакте с неоплазией. Совокупность этих характеристик такова, что производные/конъюгаты по настоящему изобретению очевидным образом превосходят известные из уровня техники в местной или системной терапии неоплазии различных видов и разного происхождения, которые также стали резистентными к традиционному химиотерапевтическому лечению.

Гиалуроновая кислота, используемая в настоящем изобретении, имеет молекулярную массу в диапазоне от 400 до 3000000 Да, предпочтительно в диапазоне от 5000 до 1000000 Да и еще более предпочтительно - от 30000 до 500000 Да, и может иметь экстрактивное, ферментативное или биосинтетическое происхождение. В ковалентную связь со спейсером вовлечена карбоксильная группа D-глюкуроновой кислоты, повторяющейся единицы полимера, в процентном отношении, варьирующимся от 1 до 100% (степень замещения), которая образует эфирную или амидную связь с функциональной группой выбранного молекулярного спейсера, который, таким образом, действует как связь между гиалуроновой кислотой и химиотерапевтическим лекарственным средством.

Спейсерный агент состоит из алифатической, аралифатической, алициклической или гетероциклической цепочки, линейной или разветвленной, содержащей или не содержащей гетероатомы, которая может включать гидроксильную, карбоксильную. карбонильную, аминную группы (за исключением гидразидов и полипептидов), эпоксигруппы, хлорангидриды, тиолы, нитрилы, галогены, ангидриды, изоцианаты и изотиоцианаты; предпочтительными являются бромиды, иодиды и хлорангидриды карбоновых кислот с С₂-С₁₀алифатической цепочкой, и особенно бромиды, такие как бромпропионовая кислота или броммасляная кислота. Степень замещения предпочтительно меняется от 1 до 50%, и даже более предпочтительно от 1 до 20%; для конъюгации с доксорубицином предпочтительным является замещение от 3 до 15%, в то время как для конъюгации с SN38 предпочтительно замещение от 1 до 10%.

Производные НА, которые могут быть использованы в новых конъюгатах, объекты настоящего изобретения, перечислены ниже:

1. НА, образующая соль с органическими и/или неорганическими основаниями, имеющая молекулярную массу 50-730 кДа (ЕР 0138572 В1) или высокомолекулярная с массой 750-1230 кДа (ЕР 535200 В1);

2. Hyaff®: эфиры НА со спиртами алифатического, аралифатического, циклоалифатического, ароматического, циклического и гетероциклического ряда, с процентом этерификации, который может меняться в зависимости от типа и длины используемого спирта, от 1 до 75%, предпочтительно от 30 до 50% (ЕР 216453 В1);

3. Hyadd™: амиды НА с аминами алифатического, аралифатического, циклоалифатического, ароматического, циклического и гетероциклического ряда, с процентом амидирования в диапазоне от 1 до 10%, предпочтительно 4% (ЕР 1095064 В1);

4. О-сульфатированные производные НА со степенью сульфатации вплоть до 4 (ЕР 0702699 В1);

5. АСР®: внутренние эфиры НА с процентом внутренней этерификации в диапазоне от 0,5 до 10% и предпочтительно 5% (ЕР 03417545 В1);

6. Деацетилаты НА: полученные деацетилированием N-ацетилглюкозаминового фрагмента с процентом деацетилирования предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 30%, в то время как все карбоксильные группы НА могут образовывать соли с органическими и/или неорганическими основаниями (ЕР 1313772 В1);

7. Нуохх™: перкарбоксилированные производные НА получают путем окисления первичного гидроксила N-ацетилглюкозаминового фрагмента со степенью перкарбоксилирования от 0,1 до 100%, предпочтительно от 25 до 75%. Все карбоксильные группы НА могут образовывать соли с органическими и/или неорганическими основаниями (патентная заявка ЕР 1339753).

Лекарственные средства, используемые в реакции конъюгации с НА, предпочтительно принадлежат к следующим категориям:

- нитрозомочевины,

- антиметаболиты: такие как, например, продукты-аналоги фолиевой кислоты (среди которых метотрексат), продукты-аналоги пиримидина (среди которых фторурацил и 1-β-D-арабинофуранозилцитозин: Ara-С),

- алкалоиды: такие как, например, винкристин и винбластин (винка-алкалоиды) и активный метаболит иринотекана, SN38,

- антибиотики и аналогичные продукты: такие как, например, доксорубицин и эпирубицин,

- модификаторы биологического ответа,

- дитерпеноиды,

- синтетические гормоны и антигормоны: такие как, например, экстрадиол.

Доксорубицин и метаболит иринотекана SN38 особенно удобны для целей данного изобретения.

Определенные лекарственные средства и гиалуроновую кислоту (и/или одно из ее производных) связывают непрямо посредством спейсера путем образования эфирных связей согласно следующим методикам:

1) осуществляют взаимодействие функциональной группы подходящим образом выбранного спейсера (такой как, например, карбоксильная группа, аминогруппа, галогенид и т.д.), также содержащего вторую группу (называемую «уходящей группой»), способную взаимодействовать с карбоксильной функциональной группой НА (например галогенид: бром, йод или хлор), с функциональной группой, принадлежащей представленной противоопухолевой молекуле, например гидроксилом, амином, карбоксилом или меркаптаном. Реакция возможно может потребовать активации одной из вовлекаемых функциональных групп при помощи активирующего агента (например, активации карбоксильной группы при помощи карбодиимидов). Во второй фазе соединение, состоящее из модифицированного лекарственного средства, взаимодействует посредством непосредственного контакта с тетраалкиламмониевой солью (предпочтительно тетрабутиламмониевой) НА в безводной среде, что приводит к нуклеофильному замещению уходящей группы (например бромида) на карбоксил НА, что вызывает образование эфирной связи между НА и спейсером;

2) карбоксильную группу гиалуроновой кислоты или одного из ее производных связывают посредством нуклеофильного присоединения с подходящим спейсером, который затем связывается с функциональной группой противоопухолевой молекулы (любыми способами, известными специалистам в этой области);

3) карбоксильную группу НА или одного из ее производных активируют активирующим агентом, например карбодиимидом, и осуществляют взаимодействие с гидроксильной функциональной группой подходящим образом выбранного спейсера, который предварительно или впоследствии связывают с лекарственным средством (любыми способами, известными специалистам в этой области).

Определенные лекарственные средства и гиалуроновую кислоту (и/или одно из ее производных) связывают непрямо с помощью спейсера путем образования амидных связей согласно следующими методикам:

1) карбоксильную группу гиалуроновой кислоты или одного из ее производных активируют активирующим агентом, таким как, например, карбодиимид, и осуществляют взаимодействие с аминной функциональной группой подходящим образом выбранного спейсера, который предварительно или впоследствии связывают с выбранным лекарственным средством (любыми способами, известными специалистам в данной области).

Онкологические применения, относящиеся к применению конъюгатов, состоящих из гиалуроновой кислоты (и/или одного из ее производных) и противоопухолевого действующего вещества, тесно связаны с реакцией неоплазии на конъюгированное лекарственное средство. В соответствии с предполагаемыми применениями биоконъюгаты, следовательно, можно вводить перорально, внутривенно, внутриартериально, интратекально, внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно, внутрисуставно, местно, чрескожно, локорегионально или в комбинации (вследствие этого заявлен способ как местного, так системного введения). Неоплазии, вовлеченные в лечение, могут, например, представлять собой (без ограничений) опухоли поджелудочной железы, молочной железы, колоноректальные, легкого и органов дыхания in toto (в целом), головы и области шеи, печени, желудка, яичек, яичника, эндометрия, предстательной железы, мочевого пузыря, головного мозга, лейкемию, лимфомы, меланому, саркому Капоши, остеосаркому, нейробластому и рак кожи.

Некоторые примеры получения биоконъюгатов гиалуроновой кислоты и/или ее производных и химиотерапевтических лекарственных средств с противоопухолевой активностью представлены ниже в исключительно иллюстративных и неограничивающих целях.

Пример 1.

Получение эфирного производного гиалуроновой кислоты, имеющей молекулярную массу 200 кДа, и SN38 со степенью замещения примерно 15% (Фиг.1).

199 мг SN38 растворяют в 50 мл ацетонитрила и к раствору добавляют 383 мг 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (EDC), 258 мг 4-броммасляной кислоты и 40 мг DMAP. За изменением раствора следят с помощью тонкослойной хроматографии (стационарная фаза оксид кремния с флуоресцентным индикатором и элюентом хлороформ-ацетонитрил в соотношении 60:40). Продукт выделяют посредством осаждения и очищают хроматографией на колонке с диоксидом кремния, используя хлороформ:метанол 99:1 в качестве элюента. Полученный таким образом промежуточный продукт сушат при комнатной температуре в глубоком вакууме. 0,84 г тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НАТВА) растворяют в 43 мл N-метил-2-пирролидона (NMP) при комнатной температуре. Промежуточный продукт добавляют к раствору, и всю смесь оставляют взаимодействовать при комнатной температуре. Через 7 суток взаимодействия раствор разбавляют 5 мл воды и 5 мл насыщенного хлорида натрия. Всю смесь оставляют перемешиваться в течение 1 часа, чтобы обеспечить возможность обмена натрия на ТВА-ион. Потом по каплям добавляют этанол, и полученный волокнистый продукт растворяют в воде, подвергают диализу и наконец лиофилизируют.

Пример 2.

Получение эфирного производного гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 31 кДа) и SN38 со степенью замещения карбоксила примерно 10%.

200 мг SN38 растворяют в 50 мл DMSO (диметилсульфоксид), и к раствору добавляют 1,00 г этиленкарбоната. Раствор нагревают до 50°С, и за изменением раствора следят посредством тонкослойной хроматографии на пластинках с диоксидом кремния. В конце взаимодействия продукт выделяют путем осаждения и сушат при комнатной температуре в глубоком вакууме. 175 мг полученного таким образом промежуточного продукта растворяют в безводной смеси DMSO/пиридин 90:10 с 85 мг пара-толуолсульфонилхлорида. После преобразования промежуточного продукта в соответствующий тозилат, его выделяют осаждением и растворяют в растворе НАТВА в NMP (0,68 г полимера в 34 мл NMP). Всю смесь оставляют взаимодействовать в течение 7 суток при комнатной температуре. К раствору добавляют 4 мл насыщенного раствора NaCI, и смесь оставляют при постоянном перемешивании в течение 1 часа, чтобы обеспечить обмен натрия и ТВА-иона. Затем по каплям добавляют этанол, и полученный волокнистый продукт растворяют в воде, подвергают диализу и наконец лиофилизируют.

Пример 3.

Получение эфирного производного гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 55 кДа) с винбластином со степенью замещения карбоксила примерно 10%.

308 мг винбластина растворяют в 30 мл хлороформа, и затем добавляют 120 мг 4-броммасляной кислоты и 150 мг EDC. Через некоторое время к раствору добавляют воду для удаления бромида и карбодиимида. Органический раствор обезвоживают при помощи сульфата натрия, и растворитель удаляют выпариванием на роторном испарителе. 300 мг полученного таким образом промежуточного продукта добавляют к 1,70 г НАТВА, растворенной в безводном NMP, и раствор оставляют при перемешивании при комнатной температуре в течение 7 суток. Наконец всю смесь оставляют при непрерывном перемешивании в течение 1 часа с 6 мл насыщенного раствора NaCl, чтобы обеспечить замещение натрия на ТВА-ион. Потом по каплям добавляют этанол, и полученный волокнистый продукт растворяют в воде, подвергают диализу и наконец лиофилизируют.

Пример 4.

Получение эфирного производного гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 440 кДа) и 5-фторурацила со степенью замещения карбоксила примерно 15%.

680 мг этилен карбоната и примерно 10 мг NaOH добавляют к 510 мг фторурацила, растворенного в 15 мл DMF (диметилформамид). Всю смесь нагревают, и реакционную смесь оставляют для взаимодействия в течение 1 часа при температуре дефлегмации. Продукт, выделенный осаждением, растворяют в безводной смеси DMSO/пиридин 50/50 с 1,00 г пара-толуолсульфонилхлорида. Через 15 часов продукт выделяют осаждением и добавляют к раствору НАТВА, растворенному в DMSO (3,6 г в 180 мл DMSO). Раствор оставляют при непрерывном перемешивании при 38°С в течение примерно 3 суток и в конце добавляют 20 мл MilliQ-воды, и 7 мл насыщенного раствора NaCl. Всю смесь оставляют при перемешивании в течение 1 часа, обеспечивая обмен натрия и ТВА-иона. Затем добавляют по каплям этанол, и полученный волокнистый продукт растворяют в воде, подвергают диализу и лиофилизируют.

Пример 5.

Получение эфирного производного гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 200 кДа) и 1-β-D-арабинофуранозилцитозина (Ara-С) со степенью замещения карбоксила примерно 18%.

100 мг Ara-С, 80 мг EDC и 69 мг 4-броммасляной кислоты растворяют в 10 мл воды. Вся смесь взаимодействует в течение примерно 1 часа, и в конце растворитель удаляют выпариванием при пониженном давлении на роторном испарителе. Продукт очищают посредством разделения на хроматографической колонке. Полученный таким образом промежуточный продукт растворяют в растворе с концентрацией 20 мг/мл 1,10 г НАТВА в DMSO и подвергают взаимодействию в течение 7 суток при комнатной температуре. 5 мл насыщенного раствора NaCl добавляют для извлечения продукта, таким образом обеспечивая солеобразование между карбоксильными группами гиалуроновой кислоты и натрием. Полимер осаждают, добавляя по каплям этанол, и после фильтрации и повторного растворения в воде диализуют для удаления остатков растворителя и соли и окончательно лиофилизируют.

Пример 6.

Получение эфирного производного гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 120 кДа) и 17β-экстрадиола со степенью замещения карбоксила примерно 20%.

140 мг 17β-экстрадиола растворяют в 50 мл DMSO, и к раствору добавляют 380 мг 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (EDC), 262 мг 4-броммасляной кислоты. Продукт выделяют осаждением и очищают хроматографией на колонке с диоксидом кремния. Полученный таким образом промежуточный продукт сушат при комнатной температуре в глубоком вакууме. 0,80 г тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НАТВА) растворяют в 40 мл N-метил-2-пирролидона (NMP) при комнатной температуре. Промежуточный продукт добавляют к раствору, и всю смесь оставляют взаимодействовать при комнатной температуре. Через 7 суток взаимодействия раствор разбавляют 5 мл воды и 5 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Всю смесь оставляют при непрерывном перемешивании в течение 1 часа, чтобы обеспечить обмен натрия и ТВА-иона. Потом по каплям добавляют этанол, и полученный волокнистый продукт растворяют в воде, подвергают диализу и наконец лиофилизируют.

Пример 7.

Получение неполного эфира гиалуроновой кислоты (200 кДа) и SN38 и автосшивание производного НА.

200 мг SN38 растворяют в 50 мл DMSO и к раствору добавляют 375 мг 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (EDC), 330 мг 4-броммасляной кислоты. Изменение раствора контролируют посредством тонкослойной хроматографии (неподвижная фаза - диоксид кремния, с флуоресцентным индикатором и элюент хлороформ-ацетонитрил 60:40). Продукт выделяют путем осаждения и очищают хроматографией на колонке диоксида кремния, используя хлороформ:метанол в соотношении 99:1 в качестве элюента. Полученный таким образом промежуточный продукт сушат при комнатной температуре в глубоком вакууме. 0,84 г тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НАТВА) растворяют в 43 мл N-метил-2-пирролидона (NMP) при комнатной температуре. Раствор оставляют взаимодействовать в течение 7 суток, затем к реакционному раствору добавляют 34 мг триэтиламина, и всю смесь непрерывно перемешивают в течение 30 минут.

Раствор 87 мг 2-хлор-1-метил-пиридина в 10 мл DMSO по каплям медленно добавляют в течение 45 минут, и всю смесь выдерживают при 30°С в течение 15 часов.

Затем добавляют раствор, состоящий из 15 мл воды и 0,5 г хлорида натрия, и полученную смесь медленно вливают в 300 мл ацетона при непрерывном перемешивании. Образуется осадок, который фильтруют, промывают три раза 25 мл смеси ацетон-вода 5:1 и три раза ацетоном (50 мл). Продукт сушат в глубоком вакууме при 38°С.

Пример 10.

Получение эфирного производного гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 200 кДа) и доксорубицина со степенью замещения карбоксила примерно 10%.

325 мг гидрохлорида доксорубицина растворяют в 50 мл NMP, после добавления 0,3 мл Et₃N к раствору добавляют 420 мг 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (ЕОС) и 280 мг 4-броммасляной кислоты. За изменением раствора следят посредством ТСХ-хроматографии (неподвижная фаза оксид кремния с флуоресцентным индикатором и элюентом дихлорметан-метанол 80:20). Продукт очищают хроматографией на колонке, используя хлороформ:метанол 99:1 в качестве элюента.

Полученный таким образом промежуточный продукт сушат при комнатной температуре в глубоком вакууме. 0,75 г гиалуроновой кислоты тетрабутиламмониевой соли (НАТВА) растворяют в 40 мл N-метил-2-пирролидона (NMP) при комнатной температуре. К раствору добавляют промежуточный продукт, и всю смесь оставляют взаимодействовать при комнатной температуре. Через 7 суток взаимодействия раствор разбавляют 5 мл воды и 5 мл насыщенного хлорида натрия. Всю смесь оставляют при перемешивании на 1 час, чтобы обеспечить обмен натрия и ТВА-иона. Затем по каплям добавляют этанол, и полученный волокнистый продукт растворяют в воде, диализуют и наконец лиофилизируют.

Пример 11.

Получение сложноэфирного производного Hyaff11® P50 и SN-38 со степенью замещения примерно 2%.

Стадия А

500 мг SN-38 растворяют в 50 мл DMF (диметилформамид). Затем добавляют 0,8866 г EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) и сразу после получения прозрачного раствора добавляют 0,7018 г 4-броммасляной кислоты (4,19 ммоль, 3,1 экв.) и в конце добавляют 0,1163 г DMAP (4-диметиламинопиридин).

Примерно через 1 час реакцию, которую контролировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на силикагеле 60 F₂₅₄, считают завершенной и осаждают примерно в 200 мл деминерализованной воды: продукт извлекают фильтрацией на Gooch 4, промывают несколько раз слегка подкисленной водой (рН=4) и извлекают в CH₂Cl₂ для очистки в гравитационной хроматографической колонке и элюируют в градиенте.

Промежуточное соединение, полученное таким образом (BrC4SN38), сушат и характеризуют.

Стадия Б

3,0 г Hyaff11® P50 (полученного согласно Примеру 1 из ЕР 1140240) растворяют в 900 мл воды, и полученный раствор затем фильтруют через стеклянную колонку, предварительно упакованную 100 см³ смолы Dowex, активированной тетрабутиламмонием (ТВА). Раствор Hyaff11® P50, элюированный в форме соли ТВА, собирают и лиофилизируют; получают 4,10 г продукта.

Стадия В

В трехгорлую колбу, снабженную термостатируемым кожухом и магнитной мешалкой, вводят 3,241 г Hyaff11® P50 соли ТВА, которые растворяют в 350 мл DMSO (диметилсульфоксид); это оставляют перемешиваться вплоть до полного растворения, поддерживая температуру в реакторе при 38°С.

Отдельно при этом растворяют 200 мг промежуточного соединения BrC4SN38 (полученного согласно Стадии А) в 20 мл DMSO и затем добавляют к раствору предварительно полученного Hyaff11® P50. Реакцию этерификации оставляют перемешиваться в течение примерно 24 часов при 38°С.

В конце реакции затем добавляют 14 мл насыщенного раствора NaBr по каплям и затем оставляют перемешиваться в течение приме