Варианты ил-21

Варианты ил-21

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым вариантам ИЛ-21, где указанные варианты полезны для терапии.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Пептиды ИЛ-21 были впервые раскрыты в WO 00/53761 как SEQ ID No:2. Пропептид представляет собой пептид из 161 аминокислотного остатка. Для удобства эта последовательность повторена в настоящей заявке как SEQ ID No:1. Первоначально считали, что зрелый пептид представляет собой пептид, состоящий из аминокислот №33-162 последовательности SEQ ID No:1; однако затем (WO 2004/112703) предположили, что зрелый пептид представляет собой в действительности аминокислоты №30-162, что представлено как SEQ ID No:11 с дополнительным N-концевым метионином в настоящей заявке.

ИЛ-21 представляет собой цитокин. Цитокины в целом стимулируют пролиферацию, дифференциацию и/или активацию клеток гемопоэтической линии или принимают участие в механизмах иммунного и воспалительного ответа организма. Интерлейкины представляют собой семейство цитокинов, которые опосредуют иммунологические ответы посредством продуцирования различных цитокинов, и они осуществляют адаптивный иммунитет к антигенам. Зрелые Т клетки могут быть активированы, например, антигеном или другим стимулом, на продуцирование, например, цитокинов, молекул биохимической передачи сигнала или рецепторов, которые далее влияют на судьбу популяции Т клеток.

Цитокины, продуцируемые Т клеткой, классифицированы на тип 1 и тип 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998). Цитокины типа 1 включают ИЛ-2, ИФН-γ, LT-α, и они вовлечены в воспалительные ответы, иммунитет к вирусам, иммунитет к внутриклеточным паразитам и отторжение аллотрансплантата. Цитокины типа 2 включают ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ-13, и они вовлечены в гуморальные ответы, иммунитет к гельминтам и аллергический ответ. Общие цитокины между типом 1 и 2 включают ИЛ-3, GM-CSF и TNF-α. Имеются некоторые данные, позволяющие предположить, что популяции Т клеток, продуцирующие тип 1 и тип 2, преимущественно мигрируют в различные типы воспаленной ткани.

Зрелые Т клетки могут быть активированы, например, антигеном или другим стимулом, на продуцирование, например, цитокинов, молекул биохимической передачи сигнала или рецепторов, которые далее влияют на судьбу популяции Т клеток.

В клетки могут быть активированы посредством рецепторов на их клеточной поверхности, включая рецептор В клеток и другие вспомогательные молекулы для осуществления вспомогательных клеточных функций, таких как продуцирование цитокинов и антител.

Естественные клетки-киллеры (NK) имеют общую клетку-предшественника с Т клетками и В клетками и играют роль в иммунном контроле. МК-клетки, которые включают вплоть до 15% лимфоцитов крови, не экспрессируют рецепторы антигенов и, следовательно, не используют распознавание ГКС (главным комплексом гистосовместимости) как потребность для связывания с клеткой-мишенью. МК-клетки вовлечены в распознавание и уничтожение некоторых опухолевых клеток и клеток, инфицированных вирусами. Считают, что in vivo NK-клетки требуют активации, однако показано, что in vitro МК-клетки уничтожают некоторые типы опухолевых клеток посредством активации, зависимой от лиганда KIR.

Несмотря на эффективность, проявляемую ИЛ-21 при лечении различных заболеваний, остается необходимость в вариантах ИЛ-21 с улучшенными или альтернативными свойствами, такими как активность, избирательность, стабильность и время циркуляции или период биологической полужизни, для удовлетворения медицинских нужд.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно сделали открытие, что активность ИЛ-21 в высокой степени сохраняется или даже улучшается, когда аминокислоты в области 66-98 делегированы и/или заменены. В настоящем контексте нумерация аминокислот соответствует зрелому 133-аминокислотному пептиду (аминокислоты №30-162 пропептида, SEQ ID No:1). Данная последовательность приведена как SEQ ID No:11, включая дополнительный N-концевой метионин, с получением 134-аминокислотного пептида. SEQ ID No:2 представляет собой аминокислоты №30-162 пропептида, SEQ ID No:1, без дополнительного N-концевого метионина с получением 133-аминокислотного пептида. Соответственно, в одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему

а) первую последовательность, полученную в результате делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из а.к. с аминокислоты №65 до аминокислоты №96 последовательности SEQ ID No:2;

или

б) последовательность, полученную в результате консервативной замены вплоть до 10 аминокислот в указанной первой последовательности.

В одном воплощении в изобретении предложено применение пептида по настоящему изобретению в терапии.

В одном воплощении изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей пептид по настоящему изобретению.

В одном воплощении в изобретении предложен терапевтический способ, при котором вводят терапевтически эффективное количество пептида по настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.

В одном воплощении изобретение относится к применению пептида по настоящему изобретению при изготовлении лекарственного средства.

В одном воплощении изобретение относится к нуклеиново-кислотной конструкции, кодирующей пептид по настоящему изобретению; к векторам, содержащим указанные конструкции; и к клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы.

В одном воплощении изобретение относится к специфичным антителам против пептида по настоящему изобретению.

ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

Фиг.1. Baf3/hIL-21R/Stat-Luc анализ вариантов ИЛ-21

Надосадочная жидкость из клеток HEK293-FS, трансфицированных указанными конструкциями ИЛ-21, была проанализирована в анализе гена-репортера BAf3-hIL-21R/Stat-Luc. Содержание белка оценивали с помощью ЭЛАЙЗА (твердофазного иммуноферментного анализа).

■ ИЛ-21 дикого типа; ▲ делеционный мутант ИЛ-21 [А83-R86] (SEQ ID No: 3); и ∆ вариант ИЛ-21, в котором последовательность [К77-Т92] заменена (SEQ ID No: 7).

Фиг.2. Кривые доза-ответ для hIL-WT и ChimIL-21/4

Очищенные белки были проанализированы в анализе гена-репортера с использованием клеток Ваf3/hИЛ-21Rа. Кривые представляют собой суммирование независимых экспериментов (n=4), где все проведены в трех повторах. Активность выражена в виде процента максимального ответа. Представлены полученные значения ЕС50±S.E.M. Chim-IL21 представляет собой ИЛ-21 sub[K77-Т92].

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящем контексте единственное число предназначено для обозначения одного или более чем одного.

В настоящем контексте термин "пептид" предназначен для обозначения двух или более чем двух аминокислот, которые связаны пептидной связью. Указанные кислоты могут быть кодируемыми или некодируемыми, и в этот термин также включают производные пептида, где одна или более чем одна аминокислота в пептиде химически замещена, например, ПЭГ или липофильной группой. Термины "пептид" и "полипептид" использованы взаимозаменяемо и предназначены для обозначения одного и того же.

В настоящем контексте термин "фармацевтически приемлемая соль" предназначен для обозначения солей, которые не являются вредными для пациента. Такие соли включают фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты, фармацевтически приемлемые соли металлов, аммония и соли алкилированного аммония. Соли присоединения кислоты включают соли как неорганических кислот, так и органических кислот. Репрезентативные примеры пригодных неорганических кислот включают соляную, бромисто-водородную, йодисто-водородную, фосфорную, серную, азотную кислоту и тому подобное. Репрезентативные примеры пригодных органических кислот включают муравьиную, уксусную, трихлоруксусную, трифторуксусную, пропионовую, бензойную, коричную, лимонную, фумаровую, гликолевую, молочную, малеиновую, яблочную, малоновую, миндальную, щавелевую, пикриновую, пировиноградную, салициловую, янтарную, метансульфоновую, этансульфоновую, винную, аскорбиновую, памовую, бисметиленсалициловую, этандисульфоновую, глюконовую, цитраконовую, аспарагиновую, стеариновую, пальмитиновую, ЭДТА, гликолевую, пара-аминобензойную, глутаминовую, бензолсульфоновую, пара-толуолсульфоновую кислоту и тому подобное. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых солей присоединения неорганической или органической кислоты включают фармацевтически приемлемые соли, приведенные в J. Pharm. Sci. 1977, 66, 2, которая включена здесь путем ссылки. Примеры солей металлов включают соли лития, натрия, калия, магния и тому подобное. Примеры солей аммония и алкилированного аммония включают соли аммония, метиламмония, диметиламмония, триметиламмония, этиламмония, гидроксиэтиламмония, диэтиламмония, бутиламмония, тетраметиламмония и тому подобное.

"Терапевтически эффективное количество" пептида, как используют здесь, означает количество, достаточное для лечения, облегчения или частичной остановки клинических проявлений данного заболевания и его осложнений. Количество, адекватное для осуществления этого, определяют как "терапевтически эффективное количество". Эффективные количества для каждой цели будут зависеть как от типа и тяжести заболевания или повреждения, так и от массы и общего состояния субъекта. Должно быть понятно, что определение подходящей дозировки может быть достигнуто с использованием рутинного экспериментирования путем конструирования матрицы значений и тестирования различных точек в этой матрице, которое находится в пределах компетенции обычного практикующего врача или ветеринара.

Термин "терапия" и "лечение", как используют здесь, означает управляемую помощь пациенту в целях борьбы с состоянием, таким как заболевание или расстройство. В этот термин следует включать полный спектр терапий для данного состояния, которым страдает пациент, таких как введение активного соединения для облегчения симптомов или осложнений, для замедления прогрессирования заболевания, расстройства или состояния, для облегчения или ослабления симптомов и осложнений и/или для лечения или элиминации заболевания, расстройства или состояния, а также для предупреждения состояния, где предупреждение следует понимать как управляемую помощь пациенту в целях борьбы с заболеванием, состоянием или расстройством и включать в него введение активных пептидов для предупреждения возникновения симптомов или осложнений. Пациент, подлежащий лечению, предпочтительно представляет собой млекопитающее, в частности, человека, но может также включать животных, таких как собаки, кошки, коровы, овцы и свиньи. Должно быть понятно, что терапевтический и профилактический (превентивный) режимы представляют отдельные аспекты настоящего изобретения.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему

а) первую последовательность, полученную в результате делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №65 до аминокислоты №96 SEQ ID No:2;

или

б) последовательность, полученную в результате консервативной замены вплоть до 10 аминокислот в указанной первой последовательности. В частности, по меньшей мере 2, как, например, по меньшей мере 3, как, например, по меньшей мере 4, как, например, по меньшей мере 5, как, например, по меньшей мере 6 аминокислот делегированы и/или заменены в указанной первой последовательности.

Изобретение также относится к пептидам, полученным путем консервативных замен в более конкретных воплощениях пептида по настоящему изобретению, описанных ниже.

В частности, вплоть 10, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот могут быть консервативно заменены. В настоящем контексте замена является консервативной, когда один аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком из той же группы, то есть другим аминокислотным остатком с подобными свойствами. Аминокислоты можно для удобства разделить на следующие группы на основании их свойств: основные аминокислоты (такие как аргинин и лизин), кислые аминокислоты (такие как глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярные аминокислоты (такие как глутамин, гистидин, метионин и аспарагин), алифатические или гидрофобные аминокислоты (такие как аланин, лейцин, изолейцин, валин), ароматические аминокислоты (такие как фенилаланин, триптофан, тирозин) и малые аминокислоты (такие как глицин, аланин, серин и треонин).

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №86 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №88 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №90 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №82 до аминокислоты №88 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №77 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №71 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №65 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №77 до аминокислоты №96 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №86 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №88 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №90 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате делеции одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №82 до аминокислоты №88 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате замены и делеции двух или более чем двух аминокислот в области, состоящей из аминокислоты №77 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате замены и делеции двух или более чем двух аминокислот в области, состоящей из аминокислоты №71 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате замены и делеции двух или более чем двух аминокислот в области, состоящей из аминокислоты №65 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, содержащему последовательность, полученную в результате замены и делеции двух или более чем двух аминокислот в области, состоящей из аминокислоты №77 до аминокислоты №96 SEQ ID No: 2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №86 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №88 SEQ ID NO:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №90 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №82 до аминокислоты №88 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №77 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №71 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №65 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции и/или замены одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №77 до аминокислоты №96 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №86 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №88 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №83 до аминокислоты №90 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем делеции одной или более чем одной аминокислоты в области, состоящей из аминокислоты №82 до аминокислоты №88 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем замены и делеции двух или более чем двух аминокислот в области, состоящей из аминокислоты №77 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем замены и делеции двух или более чем двух аминокислот в области, состоящей из аминокислоты №71 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем замены и делеции двух или более чем двух аминокислот в области, состоящей из аминокислоты №65 до аминокислоты №92 SEQ ID No:2.

В одном воплощении изобретение относится к пептиду, полученному путем замены и делеции двух или более чем двух аминокислот в области, состоящей из аминокислоты №77 до аминокислоты №96 SEQ ID No:2.

Как обсуждено выше, ИЛ-21 экспрессируется в виде 161-аминокислотного пептида, но претерпевает посттрансляционный процессинг путем удаления аминокислот №1-29 или путем удаления аминокислот №1-31. В настоящее изобретение, таким образом, следует также включать пептиды, содержащие последовательность, полученную в результате удаления и/или делеции одной или более чем одной аминокислоты из области, состоящей из аминокислоты №65 до аминокислоты №96, где N-конец удлинен N-концевыми 29 аминокислотами из SEQ ID No:1 или N-концевой 31 аминокислотой из SEQ ID No:1.

Когда пептиды экспрессируют в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО, N-концевой сигнальный пептид часто удаляется так называемой сигнальной пептидазой, что приводит к зрелому пептиду. В данной области техники хорошо известно, что для экспрессии тех же гетерологичных пептидов в прокариотических клетках, таких как, например, Е.соli, часто необходимо посредством рекомбинантной технологии, хорошо известной специалистам в данной области техники, ввести дополнительный N-концевой метионин в последовательность зрелого пептида. Таким образом, подразумевают, что настоящее изобретение включает вышеупомянутые пептиды с N-концевым метионином и без него.

В одном воплощении изобретение относится к пептидам, выбранным из:

A) SEQ ID No:3 (делеция A83-R86), SEQ ID No:4 (делеция А83-К88), SEQ ID No:5 (делеция A83-R90) и SEQ ID No:6 (делеция N82-K88); и

Б) пептиды А) с дополнительным N-концевым Met;

B) пептиды А)-Б), где вплоть до 10 аминокислот консервативно заменены.

В одном воплощении изобретение относится к пептидам, выбранным из

Г) SEQ ID No:7 (К77-Т92 замена), SEQ ID No:8 (I71-T92 замена), SEQ ID No:9 (R65-T92 замена) и SEQ ID No:10 (K77-C96) замена; и

Д) пептиды Г) с дополнительным N-концевым Met; и

Е) пептиды Г)-Д), где вплоть до 10 аминокислот консервативно заменены.

В одном воплощении изобретение относится к фармацевтически приемлемым солям вышеуказанных пептидов.

Можно получить дополнительные производные пептидов по настоящему изобретению посредством присоединения групп, которые будут способствовать продлению времени циркуляции в плазме и/или периода биологического полураспада, либо которые будут снижать иммуногенность. В данной области техники хорошо известно, что такие эффекты могут быть получены путем присоединения определенных групп, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ); липофильные группы, такие как жирные кислоты; белки плазмы, такие как альбумин; или группировки, связывающие альбумин. В качестве примеров уровня техники см., например, WO 01/79271, US 5739208 и WO 03/44056.

Как используют здесь, термин "нуклеиново-кислотная конструкция" предназначен для обозначения любой молекулы нуклеиновой кислоты происхождения кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК или РНК. Термин "конструкция" предназначен для обозначения сегмента нуклеиновой кислоты, который может быть одно- или двухцепочечным и может быть основан на полноразмерной или частичной встречающейся в природе нуклеотидной последовательности, кодирующей интересующий белок. Эта конструкция может возможно содержать другие сегменты нуклеиновой кислоты.

Нуклеиново-кислотная конструкция по изобретению, кодирующая белок по изобретению, может пригодно иметь геномное или кДНК происхождение, например может быть получена путем изготовления геномной или кДНК библиотеки и скрининга на последовательности ДНК, кодирующие весь белок или его участок, путем гибридизации с использованием синтетических олигонуклеотидных зондов в соответствии со стандартными методиками (см. Sambrook et al., цит. выше). Для целей настоящего изобретения последовательность ДНК, кодирующая белок, предпочтительно имеет человеческое происхождение, то есть получена из библиотеки человеческой геномной ДНК или кДНК. В частности, последовательность ДНК может иметь человеческое происхождение, например, кДНК из конкретного типа органов или клеток человека или ген, полученный из человеческой геномной ДНК.

Нуклеиново-кислотная конструкция по изобретению, кодирующая пептид, может быть также получена синтетическим путем с помощью разработанных стандартных способов, например, фосфоамидитного метода, описанного Веаuсаgе and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, или метода, описанного Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805. В соответствии с фосфоамидитным методом синтезируют олигонуклеотиды, например, в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, подвергают отжигу, лигируют и клонируют в подходящих векторах.

Кроме того, нуклеиново-кислотная конструкция может иметь смешанное синтетическое и геномное, смешанное синтетическое и кДНК или смешанное геномное и кДНК происхождение, полученная в результате лигирования фрагментов синтетического, геномного или кДНК происхождения (как пригодно), где эти фрагменты соответствуют различным участкам целой нуклеиново-кислотной конструкции, в соответствии со стандартными методиками.

Нуклеиново-кислотную конструкцию можно также получить с помощью полимеразной цепной реакции, используя специфичные праймеры, например, как описано в US 4683202 или Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491.

Нуклеиново-кислотная конструкция предпочтительно представляет собой конструкцию ДНК, и далее будет использован исключительно этот термин.

РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВЕКТОР

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему конструкцию ДНК по изобретению.

Рекомбинантный вектор, в который встраивают конструкцию ДНК по изобретению, может представлять собой любой вектор, который можно удобно подвергать методикам рекомбинантных ДНК, и выбор вектора будет часто зависеть от клетки-хозяина, в которую его вводят. Таким образом, вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, то есть вектор, который существует в виде экстрахромосомной молекулы, репликация которой не зависит от репликации хромосомы, например, плазмиду. Альтернативно вектор может представлять собой такой вектор, который при введении в клетку-хозяина интегрирует в геном этой клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую он интегрирован.

Вектор предпочтительно представляет собой экспрессионный вектор, в котором последовательность ДНК, кодирующая белок по изобретению, оперативно сцеплена с дополнительными сегментами, необходимыми для транскрипции ДНК. Как правило, экспрессионный вектор образован из плазмиды или вирусной ДНК, либо может содержать и те, и другие элементы. Термин "оперативно сцепленный" указывает на то, что сегменты упорядочены таким образом, что функционируют в соответствии с их предназначенными целями, то есть транскрипция инициируется в промоторе и продолжается на протяжении всей последовательности ДНК, кодирующей белок.

Промотор может представлять собой любую последовательность ДНК, которая проявляет транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине, и может быть образован из генов, кодирующих белки, либо гомологичных, либо гетерологичных для клетки-хозяина.

Примерами подходящих промоторов для направления транскрипции ДНК, кодирующей белок по изобретению, в клетках млекопитающих являются промотор SV40 (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1. (1981), 854-864), промотор МТ-1 (гена металлотионеина) (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814) или главный поздний промотор аденовируса 2.

Примером подходящего промотора для использования в клетках насекомых является полиэдриновый промотор (US 4745051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311. (1992) 7-11), промотор Р10 (J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp.765-776), промотор основного белка вируса полиэдроза Autographa californica (EP 397485), промотор немедленно-раннего гена 1 бакуловируса (US 5155037; US 5162222) или промотор замедленно-раннего гена 39К бакуловируса (US 5155037; US 5162222).

Примеры подходящих промоторов для использования в дрожжевых клетках-хозяевах включают промоторы из дрожжевых гликолитических генов (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) или генов алкогольдегидрогеназ (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, eds.), Plenum Press, New York, 1982), либо промоторы ТРИ (US 4599311) или ADH2-4c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652-654).

Примерами подходящих промоторов для использования в клетках-хозяевах нитевидных грибов являются, например, промотор ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) или промотор tpiA. Примерами других полезных промоторов являются промоторы, имеющие происхождение из гена, кодирующего ТАКА-амилазу A. oryzae, аспарагиновую протеиназу Rhizomucor miehei, нейтральную α-амилазу A. niger, кислотоустойчивую α-амилазу A. niger, глюкоамилазу А. niger или A. awamori (gluA), липазу Rhizomucor miehei щелочную протеазу A. oryzae, триозофосфатизомеразу A. oryzae или ацетамидазу A. nidulans. Предпочтительными являются промоторы ТАКА-амилазы и gluA.

Примеры подходящих промоторов для использования в бактериальных клетках-хозяевах включают промотор гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus, гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis, гена BAN амилазы Bacillus amyloliquefaciens, гена щелочной протеазы Bacillus subtilis или гена ксилозидазы Bacillus pumilus, либо промоторы P_R или P_L фага лямбда, либо промоторы Е. coli lac, trp или tac.

Последовательность ДНК, кодирующая белок по изобретению, может быть также, если необходимо, оперативно соединена с подходящим терминатором, таким как терминатор гормона роста человека (Palmiter et al., op. cit), либо терминаторы (для хозяев-грибов) ТРI1 (Alber and Kawasaki, op. cit.) или ADH3 (McKnight et al., op. cit.). Вектор может дополнительно содержать элементы, такие как сигналы полиаденилирования (например, из SV40 или области 5 Elb аденовируса), последовательности транскрипционных энхансеров (например, энхансер SV40) и последовательности трансляционных энхансеров (например, кодирующие последовательности VA РНК аденовирусов).

Рекомбинантный вектор по изобретению может дополнительно содержать последовательность ДНК, обеспечивающую репликацию вектора в данной клетке-хозяине. Примером такой последовательности (когда клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего) является точка начала репликации SV40.

Когда клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку, пригодными последовательностями, обеспечивающими репликацию вектора, являются гены репликации REP 1-3 и точка начала репликации дрожжевой 2µ плазмиды.

Когда клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку, последовательностями, обеспечивающими репликацию вектора, являются гены, кодирующие комплекс ДНК-полимеразы III, и точка начала репликации.

Вектор может также содержать селективный маркер, например, ген, продукт которого комплементирует дефект клетки-хозяина, такой как ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (DHFR), или ген TPI Schizosaccharomyces pombe (описанный Р.R. Russell, Gene 40, 1985, pp.125-130), либо ген, который придает устойчивость к лекарственному средству, например, к ампициллину, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, неомицину, гигромицину или метотрексату. Для нитевидных грибов селективные маркеры включают amdS. pyrG. argB. niaD и sC.

Чтобы направить белок по настоящему изобретению в секреторный биохимический путь клеток-хозяев, в рекомбинантном векторе можно обеспечить секреторную сигнальную последовательность (также известную как лидерная последовательность, препропоследовательность или препоследовательность). Эта секреторная сигнальная последовательность соединена с последовательностью ДНК, кодирующей белок, в правильной рамке считывания. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены 5' к последовательности ДНК, кодирующей белок. Секреторная сигнальная последовательность может представлять собой такую последовательность, которая в норме связана с белком, либо последовательность из гена, кодирующего другой секретируемый белок.

Для секреции из дрожжевых клеток секреторная сигнальная последовательность может кодировать любой сигнальный пептид, который обеспечивает эффективную направленность экспрессируемого белка в секреторный биохимический путь клетки. Этот сигнальный пептид может представлять собой встречающийся в природе сигнальный пептид или его функциональный участок, либо может представлять собой синтетический пептид. Пригодные сигнальные пептиды, которые были обнаружены, представляют собой сигнальный пептид α-фактора (см. US 4870008), сигнальный пептид слюнной амилазы мыши (см. О.Hagenbuchle et al., Nature 289. 1981, pp.643-646), модифицированный сигнальный пептид карбоксипептидазы (см. L.A.Vails et al., Cell 48, 1987, pp.887-897), сигнальный пептид BAR1 дрожжей (см. WO 87/02670) или сигнальный пептид дрожжевой аспарагиновой протеазы 3 (YAP3) (см. М.Egel-Mitani et al., Yeast 6. 1990, pp.127-137).

Для эффективной секреции в дрожжах последовательность, кодирующая лидерный пептид, может быть также встроена ниже сигнальной последовательности и выше последовательности ДНК, кодирующей белок.

Функция лидерного пептида состоит в том, чтобы дать возможность направленной доставки экспрессируемого белка из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи и далее в секреторную везикулу для секреции в культуральную среду (то есть экспортирования белка через клеточную стенку или по меньшей мере через клеточную мембрану в периплазматическое пространство дрожжевой клетки). Лидерный пептид может представлять собой лидерный пептид дрожжевого α-фактора (использование которого описано, например, в US 4546082, ЕР 16201, ЕР 123294, ЕР 123544 и ЕР 163529). Альтернативно лидерный пептид может представлять собой синтетический лидерный пептид, который представляет собой, иными словами, лидерный пептид, не обнаруженный в природе. Синтетические лидерные пептиды можно, например, сконструировать, как описано в WO 89/02463 или WO 92/11378.

Для использования в нитевидных грибах сигнальный пептид может для удобства иметь происхождение из гена, кодирующего амилазу или глюкоамилазу Aspergillus sp., гена, кодирующего липазу или протеазу Rhizomucor miehei или липазу Humicola lanuginosa. Сигнальный пептид предпочтительно имеет происхождение из гена, кодирующего ТАКА-амилазу A. oryzae, нейтральную α-амилазу A. niger, кислотоустойчивую амилазу A. niger или глюкоамилазу A. niger.

Для использования в клетках насекомых сигнальный пептид может для удобства иметь происхождение из гена насекомых (см. WO 90/05783), как, например, сигнальный пептид предшественника адипокинетического гормона бабочки Manduca sexta (см. US 5023328).

Методики, используемые для лигирования последовательностей ДНК, кодирующих белок по настоящему изобретению, промотор и возможно терминатор и/или секреторную сигнальную последовательность, соответственно, и для встраивания их в подходящие векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации, хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Sambrook et al., цит. выше).

КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА

Клетка-хозяин, в которую вводят конструкцию ДНК или рекомбинантный вектор по изобретению, может представлять собой любую клетку, которая способна продуцировать белок по настоящему изобретению, и включает бактериальные, дрожжевые, грибные и высшие эукариотические клетки.

Примерами бактериальных клеток-хозяев, которые при культивировании способны продуцировать белок по изобретению, являются грамположительные бактерии, такие как штаммы Bacillus, такие как штаммы B. subtilis, В. licheniformis, В. lentus, В. brevis, В. stearothermophilus, В. alkalophilus, В. amyloliquefaciens, В. coagulans, В. circulans, В. lautus, В. megatherium или B. thuringiensis, либо штаммы Streptomyces, таких как S. lividans или S. murinus, или грамотрицательные бактерии, такие как Echerichia coli. Трансформацию бактерий можно осуществлять путем трансформации протопластов или путем использования компетентных клеток способом, который сам по себе известен (см. Sambrook et al., цит. выше).

При экспрессии белка в бактериях, таких как Е. соli, этот белок может удерживаться в цитоплазме, типично в виде нерастворимых гранул (известных как тельца включения), либо может направляться в периплазматическое пространство последовательностью бактериальной секреции. В первом случае клетки лизируют, и гранулы выделяют и денатурируют, после чего белок снова претерпевает укладку в результате разбавления денатурирующего агента. В последнем случае белок можно выделить из периплазматического пространства путем разрушения клеток, например, в результате озвучивания ультразвуком или осмотического шока, с высвобождением содержимого периплазматического пространства и выделением белка.

Примерами пригодных клеточных линий млекопитающих являются клеточные линии COS (АТСС CRL 1650), ВНК (АТСС CRL 1632, АТСС CCL 10), CHL (АТСС CCL39) или СНО (АТСС CCL 61). Способы трансфекции клеток млекопитающих и экспрессии последовательностей ДНК, введенных в эти клетки, описаны, например, в Kaufman and Sharp, J.Mol.Biol. 159 (1982). 601-621; Southern and Berg, J.Mol.Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; и Neumann et al., EMBO J. 1(1982), 841-845.

Примеры пригодных дрожжевых клеток включают клетки Saccharomyces spp. или Schizosaccharomyces spp., в частности штаммы Saccharomyces cerevisiae или Saccharomyces kluyveri. Способы трансформации дрожжевых клеток гетерологичной ДНК и продуцирование гетерологичных белков из них описаны, например, в US 4599311, US 4931373, US 4870008, 5037743 и US 4845075, все из которых включены здесь путем ссылки. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определя