Направленные на опухоль моноклональные антитела против fzd10 и их применение

Направленные на опухоль моноклональные антитела против fzd10 и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США No. 60/815257, поданной 21 июня 2006 г. Полное содержание указанной выше заявки включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, которое способно связывать гомолог 10 белка Frizzled (FZD10), такому как моноклональное антитело мыши, гибридное антитело и гуманизированное антитело. Настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики заболевания, связанного с FZD10; способу диагностики или прогнозирования заболевания, связанного с FZD10; и способу визуализации FZD10 у субъекта in vivo.

Предшествующий уровень техники

Моноклональные антитела против молекул, специфичных для рака, как доказано, пригодны для лечения рака (Harris, M. (2004). Lancet Oncol, 5, 292-302). В дополнение к успешным примерам клинического применения гуманизированных или гибридных антител, таких как трастузумаб (Baselga, J. (2004). Oncology, 61, Supl 2 14-21), ритуксимаб (Maloney, D.G., et al. (1997). Blood, 90, 2188-95) и бевацизумаб (Ferrara, N., et al. (2004). Nat Rev Drug Discov, 3, 391-400) при раке молочной железы, злокачественной лимфоме и раке ободочной кишки, ряд моноклональных антител против других молекулярных мишеней находится в разработке и оценивается в отношении их противоопухолевой активности. Эти моноклональные антитела, как предполагается, дадут надежду больным с опухолями, не поддающимися эффективному лечению. Одним из других важных достоинств этих моноклональных антител является достижение избирательных терапевтических эффектов на раковые клетки без тяжелых токсических эффектов, обусловленных их специфическим взаимодействием с клетками, экспрессирующими молекулы-мишени (Crist, W.M., et al. (2001). J Clin Oncol, 19, 3091-102. Wunder, J.S., et al. (1998). J Bone Joint Surg Am, 80, 1020-33; Ferguson, W.S. and Goorin, A.M. (2001) Cancer Invest, 19, 292-315).

Помимо саркомы мягких тканей, остеосаркома, саркома Юинга и рабдомиосаркома чувствительны к химиотерапии и эти заболевания могут хорошо поддаваться лечению с помощью химиотерапии. С другой стороны, веретеноклеточные саркомы устойчивы к химиотерапии и облучению, и имеющие их больные характеризуются плохим прогнозом. Для синовиальной саркомы (SS) эффективным является хирургическое лечение больных на ранней стадии, но для больных на поздней стадии эффективное терапевтическое лекарство не доступно. Следовательно, разработка новых терапевтических способов воздействия, как ожидается, изменит прогноз у больных в лучшую сторону.

Широкий геномный анализ экспрессии генов в опухолях дает полезную информацию для идентификации новых молекулярных мишеней в целях разработки новых противораковых лекарственных средств и маркеров опухолей. В предшествующем исследовании авторы настоящего изобретения проанализировали профиль экспрессии генов ряда сарком мягких тканей с применением широкого геномного анализа с микроматрицей кДНК, состоящей из 23040 генов, и продемонстрировали, что гомолог 10 Frizzled (FZD10) (GenBank NO. доступа AB027464 (SEQ ID NO:1) и BAA84093 (SEQ ID NO:2)) специфично и часто положительно регулировался в SS (Nagayama, S., et al. (2002) Cancer Res, 62, 5859-66; и WO2004/020668). Продукт гена FZD10 представляет собой член семейства Frizzled и предполагаемый рецептор, передающий сигналы WNT (Koike, J., et al. (1999). Biochem Biophys Res Commun, 262, 39-43). Дополнительный анализ показал, что FZD10 специфично экспрессируется в SS, и не экспрессируется или экспрессируется на почти неопределимом уровне в других нормальных органах, за исключением плаценты, что позволяет предположить, что лекарственные агенты, направленные на эту молекулу, не должны вызывать или будут вызывать мало побочных эффектов (Nagayama, S., et al. (2002). Cancer Res, 62, 5859-66). Эксперименты с иРНК показали, что FZD10 в значительной степени вовлечен в рост опухоли SS (WO2006/013733). Более того, авторы настоящего изобретения разработали поликлональное антитело кролика против внеклеточного домена FZD10 (FZD10-ECD) и обнаружили, что это антитело обладает противоопухолевой активностью в мышиной модели ксенотрансплантата SS (Nagayama, S., et al. (2005). Oncogene, 24, 6201-12; и WO2005/004912). В целом, лечение антителами против FZD10 может, как ожидается, улучшить клинический исход SS.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем описании ниже сообщается, что созданы моноклональные антитела мыши против FZD10 с помощью метода клеточной иммунизации для возможного клинического применения. Активность этих антител в отношении связывания с опухолью in vivo оценивалась с использованием систем визуализации флуоресценции in vivo с флуоресценцией в ближней инфракрасной части спектра в дополнение к традиционному методу с радиоизотопами. В настоящем описании авторы установили специфичность связывания моноклональных антител против FZD10 как in vitro, так и in vivo, а также интернализацию этих антител в клетках, экспрессирующих FZD10, и обнаружили, что у мышей, несущих ксенотрансплантат SYO-1, обработанных однократно через хвостовую вену Mab против FZD10, меченным ⁹⁰Y в дозе 100 мкКи, наблюдался существенный противоопухолевый эффект.

Основываясь на представленных выше данных, авторы настоящего изобретения пришли к заключению, что мышиные моноклональные антитела против FZD10 обладают терапевтическим потенциалом при лечении и диагностике SS и других опухолей, сверхэкспрессирующих FZD10.

Следовательно, в первом аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело или его фрагмент, которое включает V (вариабельную) область H (тяжелой) цепи, включающую область, определяющую комплементарность (CDR), имеющую аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 15, 17 и 19, или CDR, функционально эквивалентную ей, и V (вариабельную) область L (легкой) цепи, включающую CDR, имеющую аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 23, 25 и 27, CDR, функционально эквивалентную ей, которое способно связывать гомолог 10 белка Frizzled (FZD10) или его частичный пептид.

В одном варианте осуществления антитело или его фрагмент выбраны из группы, состоящей из антитела мыши, гибридного антитела, гуманизированного антитела, фрагмента антитела и одноцепочечного антитела.

В предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой антитело мыши. Предпочтительно, антитело мыши включает цепь H, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57, и/или цепь L, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59. Например, антитело мыши может продуцироваться клоном гибридомы 92-13 (FERM BP-10628).

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой гибридное антитело. Предпочтительно, гибридное антитело включает область V цепи H, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, например, гибридное антитело может включать цепь H, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46. Предпочтительно, гибридное антитело включает область V цепи L, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, например, гибридное антитело может включать цепь L, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48.

Более предпочтительно, гибридное антитело включает область V цепи H, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, и область V цепи L, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21. Например, гибридное антитело включает цепь H, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46, и цепь L, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48.

В одном варианте осуществления гибридное антитело дополнительно включает C (константную) область антитела человека.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело. В одном варианте осуществления гуманизированное антитело дополнительно включает FR (каркасную) область антитела человека и/или C-область антитела человека.

Во втором аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело или его фрагмент, которое включает V (вариабельную) область H (тяжелой) цепи, включающую область, определяющую комплементарность (CDR), имеющую аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 31, 33 и 35, или CDR, функционально эквивалентную ей, и V-область L (легкой) цепи, включающую CDR, имеющую аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 39, 41 и 43, или CDR, функционально эквивалентную ей, которое способно связывать гомолог 10 белка Frizzled (FZD10) или его частичный пептид.

В одном варианте осуществления антитело или его фрагмент выбраны из группы, состоящей из антитела мыши, гибридного антитела, гуманизированного антитела, фрагмента антитела и одноцепочечного антитела.

В предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой антитело мыши. Предпочтительно, антитело мыши включает цепь H, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61, и/или цепь L, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63. Например, антитело мыши может быть продуцировано клоном гибридомы 93-22 (FERM BP-10620).

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой гибридное антитело. Предпочтительно, гибридное антитело включает область V цепи H, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29, например, гибридное антитело включает цепь H, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50. Предпочтительно, гибридное антитело включает область V цепи L, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, например, гибридное антитело включает цепь L, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52.

Более предпочтительно, гибридное антитело включает область V цепи H, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29, и область V цепи L, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37. Например, гибридное антитело включает цепь H, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50, и цепь L, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления гибридное антитело дополнительно включает C (константную) область антитела человека.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело. В одном варианте осуществления гуманизированное антитело дополнительно включает FR (каркасную) область антитела человека и/или C-область антитела человека.

В еще одном альтернативном варианте осуществления антитело или его фрагмент может быть помечено радиоизотопной меткой или флуоресцентной меткой. Такая радиоизотопная метка включает ⁹⁰иттрий (⁹⁰Y), ¹²⁵йод (¹²⁵I) и ¹¹¹индий (¹¹¹In).

В третьем аспекте в настоящем изобретении предлагается клон гибридомы 92-13 (FERM BP-10628), который продуцирует моноклональное антитело 92-13 мыши.

В четвертом аспекте в настоящем изобретении предлагается клон гибридомы 93-22 (FERM BP-10620), который продуцирует моноклональное антитело 93-22 мыши.

В пятом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения или профилактики заболевания, которое связано с гомологом 10 белка Frizzled (FZD10) у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или его фрагмента. В одном варианте осуществления заболевание, которое связано с FZD10, выбрано из синовиальной саркомы (SS), колоректального рака, рака желудка, хронического миелоидного лейкоза (CML) и острого миелоидного лейкоза (AML).

В шестом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ диагностики или прогнозирования заболевания, которое связано с гомологом 10 белка Frizzled (FZD10), или предрасположенности к развитию заболевания у субъекта, включающий

(a) контактирование образца или препарата от субъекта с антителом или фрагментом, указанными выше;

(b) определение белка FZD10 в образце или препарате; и

(c) решение о том, страдает или нет субъект заболеванием или подвержен риску его развития, на основе относительного содержания белка FZD10 по сравнению с контролем.

В одном варианте осуществления заболевание, которое связано с FZD10, выбрано из синовиальной саркомы (SS), колоректального рака, рака желудка, хронического миелоидного лейкоза (CML) и острого миелоидного лейкоза (AML).

В седьмом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ визуализации in vivo гомолога 10 белка Frizzled (FZD10) у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или фрагмента, указанных выше.

В восьмом аспекте в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболевания, связанного с гомологом 10 Frizzled (FZD10), содержащая антитело или фрагмент, указанные выше, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В девятом аспекте в настоящем изобретении предлагается набор для диагностики или прогнозирования заболевания, связанного с гомологом 10 Frizzled (FZD10), содержащий антитело или фрагмент, указанные выше.

В десятом аспекте в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция для визуализации in vivo гомолога 10 белка Frizzled (FZD10), содержащая антитело или фрагмент, указанные выше.

В одиннадцатом аспекте в настоящем изобретении предлагается применение антитела или фрагмента, указанных выше, для получения набора для диагностики или прогнозирования заболевания, связанного с гомологом 10 Frizzled (FZD10).

В двенадцатом аспекте в настоящем изобретении предлагается применение антитела или фрагмента, указанных выше, для получения композиции для профилактики или лечения заболевания, связанного с гомологом 10 Frizzled (FZD10).

Термин «заболевание, которое связано с FZD10» (связанное с FZD10 заболевание), относится к заболеванию, которое связано со сверхэкспрессией белка FZD10. Такие заболевания включают, но не ограничиваются этим, синовиальную саркому (SS), колоректальный рак, рак желудка, хронический миелоидный лейкоз (CML) и острый миелоидный лейкоз (AML).

Термин «фрагмент» обозначает любой фрагмент антитела, который может быть получен из антитела против белка FZD10, и содержит определенные CDR. Такие фрагменты включают, но не ограничиваются этим, Fab фрагмент, F(ab')₂ фрагмент и Fv фрагмент.

Термин «модифицированное антитело» обозначает любое антитело, которое может происходить из антитела против FZD10, и содержит определенные CDR. Такое модифицированное антитело включает, но не ограничивается этим, ПЭГ-модифицированное антитело. Фрагмент антитела или модифицированный фрагмент может легко узнаваться специалистом в данной области техники и продуцироваться с использованием любых методов, известных в данной области техники.

Термин «субъект» в настоящем описании относится к субъекту, который страдает заболеванием, связанным с FZD10, и также к субъекту, предположительно имеющему заболевание, связанное с FZD10. Субъектом по настоящему изобретению могут быть животные, включая млекопитающих и птиц. Например, млекопитающие включают человека, мышей, крыс, обезьян, кроликов и собак.

Краткое описание чертежей

На фиг. с 1a по 1f представлена характеристика специфичности связывания двух моноклональных антител против FZD10.

На фиг. 1a представлен анализ с помощью проточной цитометрии четырех антител, 39-2 и 39-10 (раскрытых в патенте WO2005/004912), 92-13 и 93-22, с использованием пяти линий SS (SYO-1, YaFuSS, HS-SY-2, Fuji и 1973/99) и одной линии клеток колоректального рака (LoVo). Сплошными линиями показана интенсивность флуоресценции, определяемая с помощью каждого из mAb; прерывистыми линиями изображена интенсивность флуоресценции клеток, проинкубированных с неиммунными IgG мыши в качестве отрицательного контроля.

На фиг. 1b представлена полуколичественная ОТ-ПЦР FZD10 в тех же линиях опухолевых клеток, что и используемые на фиг. 1a. Экспрессия гена β2-микроглобулина (β2-MG) служила в качестве внутреннего контроля.

На фиг. 1c представлен анализ с помощью проточной цитометрии антител 92-13 (верхние панели) и 93-22 (нижние панели) против экзогенного FZD10. Линию клеток рака ободочной кишки SNU-C5 трансфицировали пустым вектором pCAGGS (левые панели) или pCAGGS-FZD10-myc/His (правые панели) и анализировали через 48 часов после трансфекции. Сплошными линиями показана интенсивность флуоресценции, определяемая с помощью каждого из mAb; прерывистыми линиями изображена интенсивность флуоресценции клеток, проинкубированных с неиммунными IgG мыши в качестве отрицательного контроля.

На фиг. 1d представлено связывание меченных ¹²⁵I 39-10, 39-2, 92-13 и 93-22 с нормальными клетками крови человека. Радиоактивно меченные Mab инкубировали каждое со свежевыделенными нормальными клетками крови человека от трех субъектов (A, B и C) в отсутствие (незакрашенный столбик) или в присутствии (закрашенный столбик) идентичных немеченых антител.

На фиг. 1e представлена связывающая активность меченных ¹²⁵I Mab. Постоянное количество радиоактивно меченных Mab инкубировали с клеткой SYO-1 и возрастающим количеством немеченых антител. Наносили процент радиоактивности, связанной с клетками, против количества немеченого антитела. Закрашенный кружок; 92-13, незакрашенный кружок; 93-22.

На фиг. 1f представлен анализ с помощью проточной цитометрии аутоблока и перекрестного блока. Alexa-488-меченные 92-13 (верхние панели) и 93-22 (нижние панели) инкубировали с клеткой SYO-1 в (i) PBS, или в присутствии 100 мкг (ii) немеченых 92-13 и (iii) немеченых 93-22. На штрихованной гистограмме представлена интенсивность флуоресценции, определенная с помощью каждого из Alexa-488-меченных Mab; прерывистые линии изображают интенсивность флуоресценции клеток, инкубированных с PBS в качестве отрицательного контроля.

На фиг. 2 представлен иммуногистохимический анализ в SS и на нормальных замороженных срезах тканей человека без антитела (a, d, g, j и m), 92-13 (b, e, h, k и n) и 93-22 (c, f, i, l и o). (a-c), синовиальная саркома; (d-f), почка; (g-i), печень, (j-l), сердце; (m-o), мозг. Исходное увеличение: ×100.

На фиг. 3 представлено биологическое распределение ¹¹¹In-меченных и ¹²⁵I-меченных антител. 10 кВк (a), ¹¹¹In-меченных 92-13, (b), ¹²⁵I-меченных 92-13, (c), ¹¹¹In-меченных 93-22 и (d), ¹²⁵I-меченных 93-22 вводили внутривенно голым BALB/c мышам, несущим опухоль SYO-1. Органы и опухоль вырезали через 1 час (незакрашенный столбик), 24 часа (заштрихованный столбик) и 48 часов (закрашенный столбик) и измеряли радиоактивность. Представленные данные являются репрезентативными данными двух независимых экспериментов.

На фиг. 4a представлена визуализация in vivo флуоресценции мышей, несущих опухоль SYO-1, после введения Alexa 647-меченных 92-13 или 93-22. Флуоресцентно меченные Mab вводили в дозе 20 мкг на мышь внутрибрюшинно. Все флуоресцентные изображения получали при 60-секундном времени экспозиции (f/стоп = 2) перед введением, непосредственно после введения (0 часов), через 24, 48 и 96 часов. Стрелки указывают на расположение опухоли. S.C. опухоль локализована дорзально для 92-13 (верхние панели) и туловищно для 93-22 (нижние панели). Флуоресцентный сигнал от Alexa647 был псевдоокрашен в соответствии с цветным столбиком, представленным справа. В случае 93-22 (нижняя панель) головки стрелок указывают на место введения.

На фиг. 4b и 4c представлена иллюстративная визуализация извлеченных органов и опухолей от мышей, представленных на фиг. 4a, 4b; 92-13, и 4c; 93-22. i, опухоль SYO-1; ii, печень; iii, селезенка; iv, почка; v, поджелудочная железа; vi, ободочная кишка.

На фиг. 5a представлена визуализация in vivo флуоресценции мышей, несущих опухоль LoVo, после введения Alexa647-меченных 92-13 или 93-22. Флуоресцентно меченные Mab вводили как на фиг. 4. Все флуоресцентные изображения получали при 60-секундном времени экспозиции (f/стоп = 2) непосредственно после введения (0 часов), через 48, 72, 96 и 120 часов (h). Стрелка указывает на расположение опухоли. S.c. опухоль локализована в правом предплечье как для 92-13 (верхние панели), так и для 93-22 (нижние панели).

На фиг. 5b и 5c представлена иллюстративная визуализация извлеченных органов и опухолей мышей, представленных на фиг. 5a, 5b; 92-13, и 5c; 93-22. i, опухоль LoVo; ii, печень; iii, селезенка; iv, почка; v, поджелудочная железа; vi, ободочная кишка.

На фиг. 6 представлена интернализация 92-13 и 93-22, оцениваемая с помощью конфокальной микроскопии. Клетки обрабатывали PBS (a, d и g), 50 мкг/мл 92-13 (b, e и h) или 93-22 (c, f, i) в течение 3 часов при 37^oC, 5% CO₂. Антитела, связанные с клеточной поверхностью, десорбировали в кислой среде 0,1 М глициновым буфером (рН 2,5). Клетки фиксировали, пермиабилизировали и затем блокировали 3% BSA. Внутриклеточные антитела определяли с помощью козьих антимышиных IgG-Alexa488, и ядро окрашивали DAPI. (a - c), SYO-1; (d - f), YaFuSS; (g - i) LoVo.

На фиг. 7 представлено влияние ⁹⁰Y-меченных 92-13 на рост опухоли. Когда опухоли прививались (0,4-2,7см³), мышам вводили однократно в хвостовую вену 100 мкКи ⁹⁰Y-меченных 92-13.

На фиг. 8 представлена индуцируемая гибридными как 92-13, так и 93-22, ADCC конкретно в отношении к гиперэкспрессирующим FZD10 клеткам SYO-1. 1 мкг/мл гибридного антитела 93-22 (ch93-22) или гибридного антитела 92-13 (ch92-13) добавляли в различном соотношении эффектор:мишень. В качестве эффекторной клетки использовали PBMC от различных людей доноров; (a), (c) ADCC гибридных 92-13 против клетки SYO-1 с пятью здоровыми людьми донорами PBMC. (b), (d) ADCC гибридных 93-22 против клетки LoVo с двумя здоровыми людьми донорами PBMC. Количественная оценка цитотоксичности по активности LDH описана в (Nagayama, S., et al. Oncogene, 24, 6201-12).

Подробное описание и предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения

Гомолог 10 Frizzled (FZD10) представляет собой член семейства Frizzled, который является рецептором, проводящим сигнал от Wnt. Как описано в настоящем изобретении ниже, авторы успешно создали моноклональные антитела мыши и гибридные антитела против белка FZD10, которые могут быть пригодны для использования в медицине.

Моноклональные антитела мыши, специфичные для FZD10 (92-13 и 93-22 Mab), созданы путем иммунизации мышей клетками, трансфицированными FZD10. Как показано путем анализа с использованием проточной цитометрии (FACS), Mab, как 92-13, так и 93-22, обладают специфической связывающей активностью против FZD10 в линии клеток SS, клетках SYO-1 и клетках COS7, трансфицированными FZD10. Для подтверждения специфической связывающей активности этих антител in vivo авторы настоящего изобретения вводили флуоресцентно меченные Mab внутрибрюшинно или внутривенно мышам, несущим ксенотрансплантаты SS, и нашли с помощью использования флуоресцентной системы визуализации in vivo и радиоактивности, что эти Mab связываются с опухолями, экспрессирующими FZD10, а не с любыми другими нормальными тканями мышей. Последующий иммуногистохимический анализ с Mab подтвердил отсутствие или едва выявляемый уровень белка FZD10 в нормальных органах человека за исключением плаценты. Более того, интересно, что авторы настоящего изобретения нашли, используя конфокальную лазерную сканирующую микроскопию, что Mab интернализуются в клеточной линии SS, SYO-1, но не в негативную в отношении FZD10 линию клеток, LoVo. Неожиданно оказалось, что у мышей, несущих ксенотрансплантат SYO-1, с однократным введением в хвостовую вену ⁹⁰Y-меченного Mab (92-13) против FZD10 в дозе 100 мкКи, наблюдался существенный противоопухолевый эффект. Суммируя вышеизложенное, авторы пришли к заключению, что эти специфические Mab против FZD10 могут быть использованы в качестве нового диагностического маркера или для лечения SS с минимальным риском побочных реакций или их отсутствием.

Часто очень трудно выработать антитела против белков с семью трансмембранными доменами из-за сложной структуры этих белков. В предшествующем исследовании авторы настоящего изобретения показали, что FZD10 образует гомоолигомер (Nagayama, S., et al. (2005). Oncogene, 24, 6201-12). После многих неудачных попыток создания моноклональных антител против FZD10, которые могут узнавать природную форму FZD10, путем использования полноразмерных или частично рекомбинантных белков FZD10 авторы настоящего изобретения наконец использовали иммунизацию путем инъекции живых клеток COS-7, гиперэкспрессирующих FZD10, в подушечки лап мышей Balb/c и успешно получили две гибридомы, продуцирующие антитела против FZD10, которые обладали способностью узнавать природную форму FZD10 в живых клетках, как показано FACS анализом. Так как эти антитела не определяют белок FZD10 при вестерн-блоттинге, авторы настоящего изобретения предположили, что эти Mab узнают третичную структуру FZD10.

Для исследования распределения in vivo Mab 92-13 и 93-22 авторы настоящего изобретения использовали два метода; один основывался на радиоизотопных методах с использованием ¹²⁵I и ¹¹¹In-меченных антител, а другой основывался на флуоресцентной визуализации с применением антител, меченных в ближней инфракрасной части спектра (Alexa647). Флуоресцирующий в ближней инфракрасной части спектра, главным образом индоцианиновый краситель, сейчас широко используется при визуализации in vivo для диагностической цели, так как свет этой длины волны проникает в живую ткань вполне эффективно (Chen, X., et al. (2004). Cancer Res, 64, 8009-14). Результаты, полученные с помощью двух подходов, очень согласовывались друг с другом и указывали на то, что 92-13 и 93-22 связываются с опухолевыми клетками SYO-1, а не с другими нормальными тканями. Для подтверждения того, могут ли эти антитела использоваться для клинического применения, авторы настоящего изобретения дополнительно проверили связывающую активность антител против нормальных клеток крови. Связывающая активность ¹²⁵I-меченных 92-13 и 93-22 против нормальных клеток крови человека была не определима у всех трех индивидуальных доноров (фиг. 1d). Эти результаты согласовывались с полученными при анализе FACS с использованием мононуклеарной клетки периферической крови человека (данные не показаны), что предполагает клиническую применимость этих двух антител с небольшой возможностью побочного эффекта у больных SS, благодаря высокоспецифичному связывающему сродству к молекуле FZD10. Более того, эксперименты in vitro с использованием конфокальной микроскопии выявили, что специфическое связывание Mab 92-13 и 93-22 с FZD10 клеточной поверхности индуцирует интернализацию антител (фиг. 6). Как описано ранее (Stein, R., et al. (2001). Criti Rev Oncol Hematol, 39, 173-80; Stein, R., et al. (2005). Clin Cancer Res, 11, 2727-34), если меченые Mab интернализуются после связывания, ¹²⁵I-меченное антитело метаболизируется в лизосомах и диффундирует из опухолевой клетки-мишени, тогда как ¹¹¹In-меченное антитело остается в лизосомах. Как видно на фиг. 3, радиоактивность ¹¹¹In-меченного антитела и ¹²⁵I-меченного антитела в опухолях существенно различалась (фиг. 3, a и b, c и d). Эти данные предполагают, что Mab 92-13 (и 93-22) могут специфически интернализовываться в клетках SS через белок FZD10.

Когда антитела используются для лечения рака, следующие три механизма, как считается, индуцируют противоопухолевую активность; (i) в случае, если молекула-мишень вовлечена в стимуляцию роста, нейтрализация антителами должна блокировать передачу ростового сигнала и затем подавлять рост опухолевых клеток; (ii) второй возможностью является эффекторная активность в плане индукции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или зависимой от комплемента цитотоксичности (CDC). (iii) Третьим случаем являются радиоактивные изотопы или противоопухолевое лекарство, которые конъюгируются с антителами и эффективно доставляются к опухолевым клеткам-мишеням. Хотя авторы настоящего изобретения ранее показали, что молекула-мишень FZD10 вовлечена в рост опухоли SS, ни Mab 92-13, ни 93-22 не проявляли нейтрализующего эффекта in vitro при добавлении к клеточным культуральным средам (данные не показаны) или in vivo при введении мышам опухоленосителям (данные не показаны).

Конъюгированные с антителами радиоактивный изотоп или противораковое лекарство, такие как зевалин (антитело против CD20, конъюгированное с ⁹⁰иттрием) и милотарг (антитело против CD33, конъюгированное с калихеамицином), как доказано, являются высокоэффективными в плане придания цитотоксичности антителам (Wiseman, G.A. and Witzig, T.E. (2005). Cancer Biother Radiopharm, 20, 185-8; van der Velden, V.H., et al. (2001). Blood, 97, 3197-204; Carter, P. (2001). Nat Rev Cancer, 1, 118-29). Милотарг проявляет свою противоопухолевую активность путем высвобождения противоопухолевого лекарства, калихеамицина, в опухолевой клетке после его интернализации (van der Velden, V.H., et al. (2001). Blood, 97, 3197-204). В примерах для терапевтических экспериментов создан конъюгат ⁹⁰иттрий-DTPA-92-13 и исследована его противоопухолевая активность. В модели ксенотрансплантата мыши опухоли быстро уменьшались после обработки ⁹⁰иттрий-DTPA-92-13 (фиг. 7). Замечено, что опухоли, включая опухоль более крупного объема (> 1 см³), не проявляли рефракции до 34 дней после введения, и не наблюдалось сильной токсичности. Так как антитела 92-13 и 93-22 против FZD10, очевидно, эффективно интернализовывались в антиген-позитивных клетках, как показано на фиг. 6, конъюгация противоракового лекарства с обоими Mab, 92-13 и 93-22, также, как ожидается, проявит сильный противораковый эффект на клетки SS. Относительно эффекторной активности, как гибридные 92-13, так и 93-22, индуцировали ADCC специфично в отношении FZD10-гиперэкспрессирующих клеток SYO-1 (фиг. 8, a и c), но не в отношении FZD10-негативных клеток LoVo (фиг. 8, b и d). Особенно гибридные 92-13 проявляли более высокую индукцию цитотоксичности по сравнению с гибридными 93-22, однако, их активность зависела от донора эффекторных клеток, возможно из-за полиморфизма рецептора Fc. В заключение авторы настоящего изобретения успешно получили моноклональные антитела, которые способны специфически связываться с FZD10 на FZD10-гиперэкспрессирующих опухолевых клетках in vitro и in vivo. Резюмируя, авторы настоящего изобретения уверены, что моноклональные антитела против FZD10 обладают большим потенциалом в плане разработки новой лекарственной терапии для лечения SS и других опухолей, которые гиперэкспрессируют FZD10.

1. Получение антитела

Антитела, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, специфично направлены против белка FZD10, получаемого при заболевании, связанном с FZD10. Используемый в настоящем описании термин «антитело» означает молекулу антитела, как целиком, так и в виде ее фрагментов, таких как Fab фрагменты, F(ab')₂ фрагменты и Fv фрагменты, которая может связываться с белком или его пептидными фрагментами в качестве антигенов. Антитело может представлять собой либо поликлональное антитело, либо моноклональное антитело. Оно может быть также гуманизированным или гибридным антителом, или одноцепочечным Fv (scFv) антителом. Антитела (поликлональные антитела и моноклональные антитела) для использования в настоящем изобретении могут быть получены, например, с помощью следующего способа.

(1) Моноклональное антитело

Исходно получают антиген для продукции антитела, пригодного для настоящего изобретения. Белок FZD10 или его частичный пептид может быть использован в качестве иммуногенного белка. Альтернативно, клетка, экспрессирующая белок FZD10 или его частичный пептид, может быть также использована в качестве иммуногена. Аминокислотная последовательность белка FZD10, используемого в качестве иммуногена в настоящем изобретении, и последовательность кДНК, кодирующая белок, есть в открытом доступе в GenBank под No. доступа BAA84093 (SEQ ID NO: 1) и AB027464 (SEQ ID NO: 2), соответственно. Белок FZD10 или его частичный пептид для использования в качестве иммуногена могут быть получены синтетически в соответствии с процедурой, известной в данной области техники, такой как метод твердофазного пептидного синтеза, с использованием доступной информации об аминокислотной последовательности. Пептидные фрагменты белка FZD10 включают, но не ограничиваются этим, пептид, содержащий остатки 1-225 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, что соответствует N-концевому внеклеточному домену белка FZD10 (FZD10-ECD).

Белок или его частичный пептид, или экспрессирующая их клетка могут быть получены при использовании информации о последовательности кДНК, кодирующей белок FZD10 или его частичный пептид, в соответствии с известной процедурой рекомбинации генов. Получение белка или его пептидного фрагмента, а также экспрессирующей их клетки в соответствии с такой процедурой генной рекомбинации будет проиллюстрировано ниже.

Рекомбинантный вектор для продукции белка может быть получен путем сшивки указанной выше последовательности кДНК с подходящим вектором. Трансформант может быть получен путем введения рекомбинантного вектора для продукции белка в хозяина, так, чтобы белок-мишень FZD10 или его частичный пептид могли экспрессироваться.

В качестве вектора используют фаг или плазмиду, которые способны автономно реплицироваться в используемом хозяине. Примеры плазмидной ДНК включают pCAGGS, pET28, pGEX4T, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19 и другие плазмидные ДНК, происходящие из Escherichia coli; pUB110, pTP5 и другие плазмидные ДНК, происходящие из Bacillus subtilis; и YEp13, YEp24, YCp50 и другие плазмидные ДНК, происходящие из дрожжей. Примеры ДНК фагов включают фаги лямбда, такие как λgt11 и λZAP. Кроме того, могут быть использованы векторы вирусов животных, такие как ретровирусный вектор и вектор коровьей оспы и могут быть также использованы векторы вирусов насекомых, такие как бакуловирусный вектор.

ДНК, кодирующую белок FZD10 или его частичный пептид (обозначаемую в настоящем описании далее как ДНК FZD10), вставляют в вектор, например, с помощью следующего метода. В этом методе очищенную ДНК расщепляют с помощью подходящего рестрикционного фермента и вставляют в сайт рестрикции ферментом или в сайт множественного клонирования подходящей ДНК вектора для лигирования в вектор.

В дополнение к промотору и ДНК FZD10 любые энхансеры и другие цис-элементы, сигналы сплайсинга, сигнал добавления поли-A, селективные маркеры, сайт рибосомального связывания (RBS) и другие элементы могут быть лигированы в рекомбинантный вектор для продукции белка для использования в клетках млекопитающих, если это желательно.

Для лигирования фрагмента ДНК с фрагментом вектора может быть использована известная лигаза ДНК. Фрагмент ДНК и фрагмент вектора отжигают и лигируют, получая тем самым рекомбинантный вектор для продукции белка.

Хозяин для использования при трансформации специально не ограничивается до тех пор, пока он позволяет экспрессироваться в нем белку FZD10 или его частичному пептиду. Примеры хозяина включают бактерии, например E. coli и Bacillus; дрожжи, например Saccharomyces cerevisiae; клетки животных, например клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO) и клетки насекомых.

Например, когда в качестве хозяина используют бактерию, рекомбинантный вектор для продукции белка должен предпочтительно обладать способностью к автономной репликации в бактерии-хозяине и включать промотор, сайт рибосомального связывания, ДНК FZD10 и последовательность терминации транскрипции. Рекомбинантный вектор может дополнительно включать ген для регуляции промотора. Пример Escherichia coli включает Escherichia coli BRL, и примером Bacillus является Bacillus subtilis. В настоящем описании может быть использован любой промотор, который может экспрессироваться в хозяине, таком как Escherichia coli.

Рекомбинантный вектор может быть введен в бактерию-хозяина с помощью любого из методов, известных в данной области техники. Такие методы включают, например, метод с использованием ионов кальция и электропорацию. Когда в качестве хозяина используют клетку дрожжей, клетку животных или клетку насекомых, трансформант может быть получен в соответствии с методом, известным в данной области техники, и затем белок FZD10 или его частичный пептид может быть получен в хозяине (трансформанте).

Белок FZD10 или его частичный пептид для использования в качестве иммуногена в настоящем изобретении может быть получен из культуры созданного выше трансформанта. «Культура» относится к любому культуральному супернатанту, культивируемым клеткам, культивируемым микроорганизмам и их гомогенатам. Трансформант культивируется в культуральной среде с помощью традиционного метода культивирования хозяина.

Культуральная среда для культивирования трансформанта, полученного с использованием Escherichia coli, дрожжей или других микроорганизмов в качестве хозяев, может быть либо природной средой, либо синтетической средой, до тех пор, пока она включает источник углерода, источник азота, неорганические соли и другие компоненты, используемые микроорганизмом, и позволяет трансформанту эффективно расти.

Трансформант обычно культивируют путем встряхивания культуры или аэра