Способ профилактики желудочно- кишечных заболеваний у животных или людей, способ лечения желудочно-кишечных заболеваний у животных или людей и лекарственное средство для лечения или профилактики желудочно-кишечных заболеваний у животных или людей

Способ профилактики желудочно- кишечных заболеваний у животных или людей, способ лечения желудочно-кишечных заболеваний у животных или людей и лекарственное средство для лечения или профилактики желудочно-кишечных заболеваний у животных или людей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описание

Настоящая заявка испрашивает приоритет заявки на патент США под серийным № 60/740518, поданной 29 ноября 2005 г.

Предшествующий уровень техники

Изобретение относится в целом к введению бактерий для лечения желудочно-кишечных заболеваний и, конкретнее, к введению бактерий штамма Bacillus amyloliquefaciens для лечения связанной с антибиотиками диареи (AAD) и заболеваний, связанных с Clostridium difficile (CDAD).

Термин «связанная с антибиотиками диарея» относится к доброкачественной, самостоятельно преходящей диарее после применения противомикробных средств. Обычно патогены не идентифицируются, и диарея вызывается изменениями состава и функции кишечной флоры. Большинство пациентов реагирует на поддерживающие меры и прекращение приема антибиотиков.

Продолжительное применение множественных антибиотиков, в частности средств широкого спектра с низким кишечным всасыванием или высокой желчной экскрецией, вызывает изменение состава и функции кишечной флоры и поэтому приводит к более частому возникновению AAD.^1,2 На степень изменения будет влиять способность нормальной флоры противодействовать колонизации и типу используемого антибиотика. Поэтому уменьшение анаэробной флоры ободочной кишки препятствует метаболизму углеводородов и желчных кислот. Может возникнуть осмотическая или секреторная диарея. Избыточный рост оппортунистических патогенов происходит в результате микробиологических и метаболических изменений.

C. difficile, анаэробная грамотрицательная палочка, вызывает от 15% до 20% всех случаев AAD. В частности, этот микроорганизм можно выделить в большом количестве случаев AAD с симптомами колита и во всех случаях с псевдомембранами. C. difficile широко присутствует в окружающей среде, может выживать в течение значительного времени и передается фекально-оральным путем восприимчивым индивидуумам. Ее считают частью нормальной флоры маленьких детей, и она может быть выделена примерно у 5% здоровых взрослых и до одной трети госпитализированных пациентов без патологических симптомов или госпитализированных пациентов, имеющих колонии бактерий.

Клинические проявления AAD могут варьироваться от легкой диареи до скоротечного колита.³ Представляется, что на тяжесть колита, вызванного C. difficile, влияет огромное множество факторов, включая возраст, сопутствующие заболевания, иммунный ответ организма хозяина и применение антиперистальтических средств. Представляет интерес то, что, как оказывается, бактериальный генотип и продукция токсина⁴ играют минимальные роли. Кардинальным симптомом этого заболевания является диарея, которая обычно развивается во время лечения, но она может появиться даже через 8 недель после прекращения введения антибиотиков. В большинстве случаев AAD у пациентов возникает жидкий стул, минимальные признаки колита и отсутствие симптомов, свидетельствующих о генерализации заболевания. Диарея быстро реагирует на поддерживающие меры и отмену противомикробного средства.

Clostridium difficile впервые была описана в 1935 г.⁵, но ее не ассоциировали со связанной с антибиотиками диареей до конца 1970-х годов. Clostridium difficile представляет собой спорообразующую, грамположительную Bacillus, которая продуцирует, по меньшей мере, 2 экзотоксина: токсин А, в первую очередь энтеротоксин, и токсин В, цитотоксин. Организм вызывает у людей желудочно-кишечные инфекции, которые по тяжести варьируются в диапазоне от бессимптомной колонизации до тяжелой диареи, псевдомембранозного колита (РМС), токсического мегаколона, перфорации ободочной кишки и смерти^6,7,8. Первая стадия в развитии колонизации C. difficile разрушение нормальной флоры ободочной кишки, обычно вызванное антибиотиками, или, в необычных случаях, противоопухолевыми или иммуносуппрессивными лекарственными средствами^9,10. Колонизация происходит фекально-оральным путем, попавшие внутрь споры C. difficile выживают, проходя через барьер желудочной кислоты и развиваются в толстой кишке^11,12. Симптомы CDAD могут начинаться в первый день лечения антибиотиками или до нескольких недель после прекращения лечения антибиотиками¹³. Недавно было показано, что следующие 2 фактора увеличивают вероятность симптоматического заболевания у пациентов, которые приобретают колонизацию C. difficile в больнице: тяжесть других заболеваний и сниженные уровни сывороточного IgG антитела к токсину А¹⁴. Эти результаты свидетельствуют о том, что ранее существующее антитело против токсина А может облегчить тяжесть заболевания и что иммунизация может быть эффективной в предотвращении и борьбе с больничной CDAD.

Для ясности, пациенты определяются как имеющие заболевание, связанное с C. difficile (CDAD), если у них проявляется симптоматичесКОЕ заболевание, вызванное C. difficile. Выявление присутствия токсина C. difficile в фекалиях пациентов с диареей было самым общепринятым способом диагностики.

Clostridium difficile является причиной приблизительно 25% всех случаев связанной с антибиотиками диареи¹⁵. Большинство случаев заболеваний, связанных с C. difficile, возникают в стационарах или учреждениях длительного ухода (частота 25-60 на 100000

занятых койко-дней), вызывая более чем 300000 случаев в год в США, и, по оценкам, аналогичные частоты во многих европейских странах. Это может удлинить госпитализацию на 2 недели при дополнительных затратах от 6000 до 10000 долларов США на каждый случай заболевания^{16,17,18,19,20,21}.

Диарея может пройти спонтанно у пациентов с CDAD после отмены вызвавшего его антибиотика, а у некоторых пациентов с легким заболеванием специфичесКОЕ лечение может не потребоваться^22,23. Однако стандартной практикой является лечение почти всех пациентов с симптомами заболевания антибиотиками ванкомицином или метронидазолом. Хотя метронидазол в настоящее время не утвержден FDA (Федеральной Администрацией США по пищевым продуктам и лекарственным средствам) для лечения CDAD, он широко применяется в качестве лечения первой линии ввиду более высокой стоимости ванкомицина и озабоченности возникновением бактерий, устойчивых к ванкомицину. Ввиду того, что метронидазол эффективно разрушает нормальную кишечную флору, он также предрасполагает пациентов к колонизации устойчивыми к метронидазолу энтерококками²⁴. Обычно адекватно лечение пероральным введением метронидазола (250 мг 4 раза в день или 500 мг 3 раза в день) в течение 10-14 дней. Пероральное введение ванкомицина гидрохлорида (125 мг 4 раза в день) в течение 10-14 дней показано тем пациентам, которые не переносят пероральный метронидазол, пациентам, у которых лечение метронидазолом не имеет эффекта, беременным пациенткам и, возможно, тяжело больным. Первый рецидив колита, вызванного Clostridium difficile, можно лечить еще одним курсом от 10 до 14 дней перорального метронидазола или ванкомицина.

Лечение CDAD ванкомицином или метронидазолом создает порочный круг за счет изменения нормальной, защитной флоры кишечника. В последующем, у 20% получавших лечение пациентов с первоначальным эпизодом происходит рецидив CDAD, обычно в пределах двух недель после прекращения лечения^25,26,27,28. Еще одной выгодой исключения антибиотиков из схемы лечения CDAD является уменьшение «давления» необходимости их подбора с учетом устойчивости бактерий. Было ясно показано, что ванкомицин и метронидазол выбирают для устойчивых грамположительных кокков, таких как VRE (резистентные к ванкомицину энтерококки). Ретроспективные эпидемиологические исследования связали кишечную колонизацию VRE с применением антибиотиков широкого спектра, таких как цефалоспорины, фторхинолоны и метронидазол²⁹. Кишечная колонизация VRE обеспечивает резервуар для этого патогена внутри стационара. Многие штаммы VRE являются множественно устойчивыми, оставляя немного возможностей для лечения угрожающих жизни системных инфекций. Пациенты с колонизацией С. difficile, вероятно, ввиду предшествующего воздействия на них антибиотиков, представляются особенно восприимчивыми к колонизации и инфекции VRE^30,31. Умение справиться с колонизацией VRE представляет собой решающий компонент практики борьбы с больничной инфекцией. Поэтому очень желательны лечебные стратегии, которые снижают риск колонизации VRE и в общей популяции пациентов, и пациентов с колонизацией С. difficile. Возможное возникновение С. difficile, резистентных к ванкомицину и метронидазолу, представляет дополнительный риск применения антибиотиков для лечения этого заболевания. В настоящее время возникновение резистентных к антибиотикам С. difficile является спорадическим, но, по сообщениям, оно было отмечено в клинических изолятах, составляющих до 12%³².

КратКОЕ описание сущности изобретения

Изобретение относится к профилактике кишечного заболевания, такого как связанная с антибиотиками диарея, приобретенная диарея, вызванная Clostridium difficile, воспалительное кишечное заболевание и желудочно-кишечное заболевание, введением эффективного количества бактерий Bacillus, которые продуцируют липопептиды. Бактерии Bacillus можно вводить в виде пробиотика и можно комбинировать с другими пробиотиками, такими как инулин.

С использованием биохимических способов, и в частности API 50 CBH/L, предпочтительная Bacillus была предположительно идентифицирована в виде Bacillus subtilis. При использовании 16S рРНК предпочтительная Bacillus была предположительно идентифицирована в виде Bacillus subtilis. При использовании gyrA предпочтительная Bacillus была предположительно идентифицирована в виде Bacillus amyloliquefaciens. Перед анализом gyrA предпочтительная Bacillus, депонированная в АТСС (Американской коллекции типовых культур), была идентифицирована как Bacillus subtilis.

Изобретение также относится к изолированному штамму бактерий, имеющих последовательность 16S рРНК SEQ ID NO:1, к изолированному бактериальному штамму, имеющему гомологию 90%, гомологию 80%, гомологию 70%, гомологию 60%

и гомологию 50% с SEQ ID NO:1.

Изобретение также относится к изолированному штамму бактерий, имеющему частичную последовательность gyrA SEQ ID NO:2, к изолированному бактериальному штамму, имеющему гомологию 90%, гомологию 80%, гомологию 70%, гомологию 60%

и гомологию 50% с SEQ ID NO:2.

Изобретение также относится к изолированному штамму бактерий, имеющему частичную последовательность gyrA SEQ ID NO:3, к изолированному бактериальному штамму, имеющему гомологию 90%, гомологию 80%, гомологию 70%, гомологию 60%

и гомологию 50% с SEQ ID NO:3.

Изобретение, кроме того, относится к бактериям Bacillus штамма, идентифицированного как штамм АТСС РТА-6737.

Предпочтительную Bacillus PB6 можно использовать для нескольких неудовлетворенных медицинских потребностей ввиду ее многосторонних и необычных характеристик.

КратКОЕ описание чертежей

Фиг.1 представляет собой фотографию антагонистического воздействия Bacillus PB6 (1) против C. perfringens ATCC13124 (2) и C. difficile ATCC9689 (3).

Фиг.2 представляет собой фотографию антагонистического воздействия Bacillus PB6 на Clostridium difficile NAP1/027.

Фиг.3 представляет собой фотографию антагонистического воздействия Bacillus PB6 на Campylobacter jejuni ATC55918.

Фиг.4 представляет собой чертеж химической структуры сурфактина.

Фиг.5 представляет собой график выживания в % хомячков с CDAD при различных способах лечения.

Фиг.6 представляет собой последовательность гена (положение нуклеотида 27-1492) 16S рРНК из 1466 пар оснований РВ6 Bacillus.

Фиг.7 представляет собой частичную последовательность (положение нуклеотида 43-1065) gyrA из 1023 пар оснований РВ6 Bacillus.

Фиг.8 представляет собой консенсусную последовательность из 801 пары оснований, полученную в результате частичного секвенирования gyrA РВ6 Bacillus.

Фиг.9 представляет собой гель выявления продукта PCR (полимеразной цепной реакции) (1650 пар оснований), кодирующего гемолизин BL; полоса 1, лестницы масс GeneRuler^TM (3000, 2000, 1500, 1200 пар оснований); полоса 2, Bacillus PB6; Полоса 3, Escherishia coli ATCC 25922; Полоса 4, B. Cereus ATCC 49064; Полоса 5, B. cereus ATCC 11778. Ни в одной из полос, за исключением полос 4 и 5, не была выявлена амплифицированная зона, соответствующая продукту PCR из 1650 пар оснований.

Фиг.10 представляет собой гель выявления продукта PCR (1437 пар оснований), кодирующего не гемолитический энтеротоксин (Nhe). Полоса 1, лестницы масс GeneRuler^TM (3000, 2000, 1500, 1200 пар оснований); полоса 2, Bacillus PB6; Полоса 3, Escherishia coli ATCC 25922; Полоса 4, B. Cereus ATCC 49064; Полоса 5, B. cereus ATCC 11778. Ни в одной из полос не была выявлена амплифицированная зона, соответствующая продукту PCR из 1437 пар оснований.

Фиг.11 представляет собой гель выявления продукта PCR (1400 пар оснований), кодирующего энтеротоксин К (EntK). Полоса 1, Bacillus PB6; Полоса 3, Escherishia coli ATCC 25922; Полоса 4, B. Cereus ATCC 49064; Полоса 5, B. cereus ATCC 11778; полоса 6, лестницы масс GeneRuler^TM (3000, 2000, 1500, 1200 пар оснований); ни в одной из полос не была выявлена амплифицированная зона, соответствующая продукту PCR из 1400 пар оснований.

Фиг.12 представляет собой фотографию, показывающую отсутствие антагонистического эффекта Bacillus cereus (1) против C. perfringens ATCC13124 (2) и C. difficile ATCC9689 (3).

Фиг.13 представляет собой фотографию, показывающую антагонистический эффект Bacillus PB6 против Campylobacter jejuni ATCC 33291.

Фиг.14 представляет собой фотографию, показывающую отсутствие антагонистического эффекта Bacillus cereus (1) против Campylobacter jejuni ATCC 33291.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

РВ6 представляет собой патентованный бактериальный штамм, который был выделен в природе и не был генетически модифицирован. С использованием методики риботипирования, эта бактерия была идентифицирована как являющаяся штаммом Bacillus subtilis. Исследование гибридизации ДНК:ДНК указывают на то, что штамм Bacillus PB6 может вероятнее представлять собой Bacillus amyloliquefaciens, которая будет дополнительно описана ниже.

Используемый в настоящем описании термин «профилактика» означает медицинскую или публичную медицинскую процедуру, целью которой является скорее предотвращение, а не лечение или излечение заболевания. Используемый в настоящем описании термин «синергичесКОЕ соединение» означает соединение, которое усиливает профилактический эффект или эффективность лечения бактерии Bacillus, введенной для профилактики или лечения заболевания или состояния здоровья. Используемый в настоящем описании липопептиды представляют собой молекулы, которые содержат и липиды, и белки, и включают поверхностно-активные молекулы, содержащие несколько аминокислот и одну или более жирных кислот. Сурфактины, итурины, микосубтилины, байлломицины, бациллопептины, фенгицины и плипастатины являются примерами липопептидов.

Пример 1

Эффективность Bacillus PB6 против C. difficile AAD и CDAD

Антагонистические свойства Bacillus PB6 испытывали против C. perfringens ATCC13124 и C. difficile ATCC9689.

Bacillus PB6 обладала антагонистическим эффектом против C.perfringens ATCC13124 и C. difficile ATCC9689. Прозрачную зону наблюдали в промежуточных отрезках штриховых линий на чашке для обоих видов. Пример тестируемой чашки изображен на фиг.1.

Bacillus PB6 также обладала антагонистическим эффектом против C. difficile NAP1/027. Этот штамм C. difficile связан с несколькими очень опасными вспышками и проявляет устойчивость к антибиотикам. Пример тестируемой чашки изображен на фиг.2.

Для определения противомикробного эффекта вторичных метаболитов Bacillus PB6 бактерию ферментировали и продукт ферментации экстрагировали простым диэтиловым эфиром. Органический слой отделяли, концентрировали в вакууме и повторно растворяли в DMSO (диметилсульфоксиде) для скрининга.

Минимальная ингибирующая концентрация (MIC) экстракта составляла 2,5-5 мкг/мл против C. perfringens и 5-10 мкг/мл против C. difficile (таблица 1).

Таблица 1Результаты скрининга неочищенным экстрактом Bacillus PB6 против C. perfringens, C. difficile и C. jejuni
	MIC (мкг/мл)
	C.perfringens ATCC13124	C. difficile ATCC9689	C. jejuni ATCC33291
Неочищенный экстракт	2,5-5	5-10	25-100

Было также доказано, что Bacillus PB6 ингибирует рост Campylobacter jejuni in vitro. Пример тестируемой чашки показан на фиг.3. MIC эфирного экстракта продукта ферментации Bacillus PB6 против C. jejuni составила 25-100 мкг/мл.

Campylobacter jejuni и Helicobacter pylori очень тесно связаны, и поэтому вероятно, что Bacillus PB6 также активна против Helicobacter pylori. Кроме того, в литературе можно обнаружить, что бактерии Bacillus (например, Bacillus subtilis) обладают активностью против Helicobacter pylori.³³

Дальнейшее исследование неочищенного экстракта показало, что молекула, ответственная за активность против Clostridium, представляла собой циклический липопептид сурфактин (фиг.4).

Когда активность чистого сурфактина (или очищенного из ферментации авторов, или закупленного у компании Sigma) определяли против Clostridium, была обнаружена более высокая MIC. Оказалось, что MIC против C. perfringens составила 10-25 мкг/мл. Примечательно, что чистое активное соединение менее активно, чем неочищенный экстракт ферментации. Это, вероятно, вызвано кофактором (факторами), присутствующим в экстракте, который усиливает активность сурфактина. Это было показано экспериментами, где MIC сурфактина сравнивали с MIC сурфактина в комбинации с неактивным соединением. Это неактивное соединение было выделено из того же экстракта, из которого заявители выделили сурфактин. MIC этой комбинации составляла от 1 до 10 мкг/мл.

Эксперименты показали, что, когда фильтраты Bacillus PB6 обрабатывали пепсином и трипсином, активность против вида Clostridium значительно снижалась. Поскольку пепсин и трипсин представляют собой ферменты, продуцируемые в слизистой выстилке желудка и поджелудочной железе, ясно, что пероральное введение сурфактина приведет к значительной потере активности. Другие эксперименты, где сурфактин инкубировали при 37°С в течение 30, 60 и 90 минут с 0,1 N HCl, показали, что кислотные условия (как в желудке) ведут к потере активности (таблица 2). Поэтому введение Bacillus PB6 (в конечном счете, в виде спор) более эффективно для получения эффективных концентраций сурфактина или других липопептидов в кишечнике.

Таблица 2Результаты влияния кислотных условий на антибактериальную активность сурфактина против Clostridium perfringens
	MIC (мкг/мл) (C. perfringens)
	Без HCl	30' HCl	60' HCl	90' HCl
Сурфактин	1-10	10-25	25-50	25-50

Кроме продукции противомикробных вторичных метаболитов, споры Bacillus PB6 способны прорастать в кишечнике и, таким образом, могут подавлять патогены конкурентным исключением.

Bacillus, конкретнее Bacillus subtilis, остается одной из самых сильнодействующих и благоприятных из всех укрепляющих здоровье и стимулирующих иммунитет бактерий. В соответствии с несколькими клиническими исследованиями, документированными в отчетах о медицинских исследованиях, компоненты клеточной стенки переваренной Bacillus способны активировать почти все системы иммунной защиты человека, включая активацию, по меньшей мере, трех специфических антител (IgM, IgG и IgA), которые высоко эффективны против многих из вредных вирусов, грибов и бактериальных патогенов, которые регулярно пытаются внедриться и инфицировать человеческую систему. Было также показано, что Bacillus subtilis стимулирует В и Т-лимфоциты и макрофаги. Также было предоставлено доказательство того, что споры Bacillus subtilis могут оказывать иммуномодулирующий эффект in vivo. И была описана увеличенная реакция бляшкообразующих клеток на Т-зависимые антигены после воздействия спор, а также усиление различных функций фагоцитов.^{34,35,36,37,38,39,40,41}

В одном исследовании (таблица 3) повышенную степень фагоцитоза наблюдали у бройлерных цыплят, которым скармливали корм с различными уровнями B. amyloliquefaciens PB6, по сравнению с антибиотиком и отрицательными контролями.

На основании этого, можно сделать вывод, что Bacillus amyloliquefaciens также обладает иммуностимулирующими свойствами.

Таблица 3Влияние Bacillus PB6 на иммунный ответ у самцов бройлерных цыплят
Лечение	Фагоцитоз
Отрицательный контроль	6,59
Положительный контроль (100 мг/кг цинка бацитрацина)	6,23
РВ6 (107 CFU/T)	11,82
РВ6 (108 CFU/T)	8,85
CFU = колониеобразующие единицы

Фильтраты из Bacillus PB6 оценивали на присутствие гемолитических, негемолитичесеких энтеротоксинов и энтеротоксина К с использованием имеющихся в продаже иммунологических анализов (TECRA и Oxoid). Те же фильтраты, кроме того, подвергали тестам цитотоксичности на линиях клеток Vero и HEp-2. Наконец, способы на основе PCR использовали для подтверждения присутствия генов с возможной энтеротоксигенной способностью у Bacillus PB6. Не наблюдалась перекрестная иммунная реактивность между энтеротоксинами Hb1 или Nhe и антителами в этих двух имеющихся в продаже иммунных анализах. Не наблюдалась также цитотоксичность при анализах клеток Vero и HEp-2. Штамм Bacillus PB6 не продуцирует гемолитические, негемолитические энтеротоксины и энтеротоксин К в тех же условиях, которые обеспечивали возможность выявления известного токсигенного штамма B. cereus.

Также испытывали токсичность Bacillus PB6 in vivo. Для этого изготавливали высушенный распылением продукт, содержащий 10¹⁰ КОЕ/г Bacillus PB6.

Исследование токсичности подвергнутых распылительной сушке B. amyloliquefaciens у крыс Wistar

Первое исследование было структурировано и проведено для определения острой пероральной токсичности продукта Bacillus PB6 (10¹⁰ КОЕ/г) у крыс Wistar. Всего 5 самцам и 5 самкам животных вводили пероральную дозу 5000 мг/кг (в виде суспензии в дважды дистиллированной воде и с использованием объема дозы 10 мл/кг). Контрольная группа состояла из 5 самцов и 5 самок животных, которым вводили дважды дистиллированную воду в дозе 10 мл/кг. У животных, получавших 5000 мг/кг, смертность не наблюдалась. 50% животных, получавших продукт Bacillus PB6, были более активны, по сравнению с контрольной группой. Ни у одного из животных, получавших лечение Bacillus PB6, не было диареи. После некропсии ни в одном органе в обеих группах не наблюдались патологические изменения. Таким образом, было обнаружено, что максимальная не летальная доза (LD₀) и LD₅₀ перорально введенного продукта Bacillus PB6 больше чем 5000 мг/кг.

Вывод: Было обнаружено, что максимальная не летальная доза (LD₀) и LD₅₀ сухого продукта B. PB6 (10¹⁰ КОЕ/г) у крыс Wistar при введении пероральным путем, составляет больше чем 5000 мг/кг.

Токсичность B. PB6 у крыс Wistar при введении повторных доз в течение 28 дней

Это исследование было структурировано и проведено для определения токсичности B. PB6 (10¹⁰ КОЕ/г) у крыс Wistar при введении повторных доз в течение (28 дней). В каждой группе 6 самцам и 6 самкам животных вводили пероральные дозы 250, 500 или 1000 мг/кг в течение 28 дней. Группа контроля носителя также состояла из 6 самцов и 6 самок животных, которым вводили дважды дистиллированную воду в дозе 10 мг/кг в течение 28 дней. Эти группы умерщвляли на 29-й день.

Исследование также состояло из двух обратимых групп для контроля носителя и высокой дозы, каждая из которых включала 6 самцов и 6 самок животных. Группе высокой дозы лекарственное средство вводили до 28-го дня, не проводили лечение с 29-го по 42-й день и умерщвляли на 43-й день. Группе контроля носителя вводили дистиллированную воду в дозе 10 мг/кг до 28-го дня, не проводили лечение с 29-го по 42-й день и умерщвляли на 43-й день.

Вывод: В 28-дневных испытаниях токсичности у крыс было обнаружено, что уровень не наблюдавшихся побочных явлений (NOAEL) для B. PB6 (10¹⁰ КОЕ/г) был больше чем 1000 мг/кг.

Исследование местного раздражающего действия (кожного и глазного) B. PB6 у новозеландских белых кроликов

Всего 3 новозеландских белых кролика (обоих полов) - В этом исследовании использовали одних и тех же кроликов для раздражения кожи и глаз. 1 г B. PB6 (10¹⁰ КОЕ/г) накладывали в виде пасты на кожу для ее раздражения, и 100 мкл 10% суспензии B. PB6 вводили в левый глаз для раздражения глаза.

Тестируемый объект пасту PB6 наносили на кожу в дорзолатеральной области после удаления волос у 3 кроликов. Суспензию 10% PB6 вводили в глаз 3 кроликов. Тестируемый объект удаляли с кожи животного через 4 часа после нанесения. После введения тестируемого объекта в левый глаз веки глаза удерживали сомкнутыми в течение 2-3 секунд.

Кроликов наблюдали и проводили балльную оценку раздражения кожи через 1, 24, 48 и 72 часа после удаления тестируемого объекта PB6. Балльную оценку раздражения глаз проводили в те же точки времени после введения суспензии PB6.

Выводы:

Кожа: Раздражение не наблюдалось при нанесении пасты 1 г PB6 (10¹⁰ КОЕ/г).

Глаз: Раздражение не наблюдалось при введении 100 мкл 10% суспензии PB6 (10¹⁰ КОЕ/г).

Анализ микроядра эритроцитов B. amyloliquefaciens PB6 у мышей

Это исследование было структурировано и проведено для выявления повреждения хромосом или митотического аппарата швейцарских белых мышей, вызванного испытуемым веществом. Всего 5 самцам и 5 самкам животных вводили пероральную дозу 2500 и 5000 мг/кг, контрольная группа носителя состояла из 5 самцов и 5 самок мышей, которым перорально вводили дважды дистиллированную воду в дозе 10 мг/кг. Группе положительного контроля (5 самцов + 5 самок) перорально вводили циклофосфамид в дозе 40 мг/кг.

Животных умерщвляли избытком СО₂ в соответствующие точки времени (контрольная группа, 2500 мг/кг РВ6 циклофосфамида через 24 часа и 5000 мг/кг РВ6 и через 24 и через 48 часов), и удаляли обе бедренные кости, и делали мазки костного мозга на предметных стеклах, окрашивали красителями Giemsa и May-Greunwald, рассматривали под микроскопом для выявления частоты микроядер подсчетом 2000 незрелых эритроцитов.

Для каждого животного определяли также процентную долю незрелых эритроцитов среди всех эритроцитов (незрелых + зрелых) подсчетом, по меньшей мере, 200 эритроцитов.

Вывод: PB6 (10¹⁰ КОЕ/г) в дозе 2500 и 5000 мг/кг не вызывала значимого появления у мышей полихроматических эритроцитов с микроядрами.

Определение эффективности in vivo перорально введенной Bacillus PB6 при лечении сирийских золотистых хомячков с CDAD

Структура исследования

42 самца сирийских золотистых хомячков получили из национального центра разведения лабораторных животных National Centre for Laboratory Animal Sciences, NIN (Hyderabad, India). В начале периода лечения возраст животных составлял 12-14 недель. При поступлении в лабораторию тестирования, под наблюдением ветеринара проводили полное обследование животных для подтверждения их хорошего состояния. Животные адаптировались в условиям исследования в течение периода, по меньшей мере, 7 дней. Массу тела регистрировали перед включением животных в группы исследования в начале испытания. Животных содержали отдельно в поликарбонатных клетках (290×22×140 мм, длина × ширина × высота). В помещении для содержания животных и в помещении, где проводилось тестирование, были установлены следующие параметры: температура: 22±4°С, относительная влажность: 50±20%, цикл света/темноты: 12 часов/12 часов (свет с 07.00 по 19.00) и вентиляция: приблизительно 7 циклов/час поступления фильтрованного, не рециркулирующего воздуха. Все животные имели свободный доступ к гранулированному корму для хомячков (NIN, Hyderabad) и без ограничения получали очищенную воду Aquaguard.

Животных включали в одну из 7 групп исследования (с A по G). У групп А-Е связанную с Clostridium difficile диарею вызывали пероральным введением 10000 CFU (колониеобразующих единиц) Clostridium difficile АТСС 9689 в 0-й день с последующей подкожной инъекцией в область тела непосредственно позади ушей 100 мг/кг клиндамицина в 1-й день. Группа А дополнительного лечения не получала.

Группу В лечили со 2-го по 6 день пероральным введением 50 мг/кг ванкомицина 1 раз/день. Группы C, D и E лечили РВ6 в дозе соответственно 1,5×10⁸, 1,5×10⁷ и 1,5×10⁶ CFU/кг, 3 раза/день перорально с интервалом между дозами 4 часа (первая доза в 9.30 утра) с 1-го по 6-й день. В группах F и G животным вводили РВ6 в дозе 1,5×10⁹ CFU/кг, 3 раза/день перорально с интервалом между дозами 4 часа (первая доза в 9.30 утра) с 1-го по 6-й день. 6-й день был последним днем лечения. Дважды в день до 15-го дня проводили наблюдение для выявления клинических признаков и смертности. Проводили балльную оценку признаков диареи как легкую, умеренную или тяжелую. Массу тела животных регистрировали в 0-й, 7 и 14 день. Для групп А-Е фекалии тестировали в 1, 2 и 7-й день на присутствие токсина А и В. Clostridium, используя Иммунокарты (Meridian life sciences). В 1-й день образцы фекалий брали перед введением клиндамицина. На 2-й и 7-й день образцы фекалий брали между второй и третьей дозой лечения.

Тестируемые препараты

Культуральную петлю Culti-loop (Oxoid, Basingstoke, England), содержащую Clostridium difficile АТСС 9689, высевали в соответствии с инструкциями изготовителя и бульон разводили солевым раствором для получения 10000CFU/мл. Клиндамицин гидрохлорид (Pharmacia, Puurs, Belgium) и ванкомицин (Neon Laboratories, Bombay, India) суспендировали в дважды дистиллированной воде соответственно до концентрации 10 и 50 мг/мл. Объемы дозы составляли соответственно 10 и 1 мл/кг массы тела для клиндамицина и ванкомицина. Сухой PB6 (Kemin Consumer Care, Des Moines, USA), ферментационный бульон Bacillus “PB6”, высушенный на мальто- и циклодекстриновом носителе, суспендировали в дважды дистиллированной воде до концентраций 1,5Е8, 1,5Е6 и 1,5Е5 CFU/мл. Объем дозы составил 10 мл/кг массы тела. Свежие препараты изготавливали перед каждым введением. Клиндамицин, ванкомицин и РВ6 вводили на основании последней полученной индивидуальной массы тела. Препараты энергично перемешивали перед каждым введением.

Результаты и обсуждение

Примерно через 6 часов после введения клиндамицина легкая диарея наблюдалась у 3 животных группы без лечения и у 1 животного из группы, подлежащей лечению ванкомицином. В группах C, D, E, где животные получали свою первую дозу РВ6 примерно через 1 час после введения клиндамицина, ни у одного животного в тот же день не проявлялись никакие признаки диареи. В группах лечения явления в виде количества животных с диареей и тяжести диареи в течение следующих 2 дней развивались по разному (таблица 4). Во всех группах, в которых была вызвана связанная с Clostridium difficile диарея, проявлялись признаки диареи. Интенсивность диареи была меньше в группе, получавшей лечение ванкомицином, и группе, получавшей высокую дозу РВ6. В группе, не получавшей лечение, а также в группах низкой и средней дозы РВ6 стул был очень водянистый, и вся абдоминальная область была мокрой.

Таблица 4Количество животных с диареей и их балльная оценка в дни от 1-го по 3-й в группах, у которых была вызвана CDAD
Лечение	День 1	День 2	День 3
количество	балльная оценка	количество	балльная оценка	количество	балльная оценка
Без лечения	3	+	6	+(1)	6	++(5)
				++(5)		+++(1)
Ванкомицин	1	+	2	++	2	+++
Высокая доза РВ6	0		3	+(2)	4	+(1)
				++(1)		++(3)
Средняя доза РВ6	0		5	+(4)	6	+(1)
				++(1)		++(2)
						+++(3)
Низкая доза РВ6	0		5	++	6	+(1)
						++(2)
						+++(3)
+: легкая++: умеренная+++: тяжелая

В конце 3-го дня все животные из групп, в которых была вызвана CDAD, были еще живы, но у нескольких из них проявлялись признаки тяжелой диареи. На 4-й день, через 3 дня после введения клиндамицина, погибли первые животные. В конце периода лечения, на 6-й день, все хомячки в группе без лечения погибли. Выживание было самым высоким в группах лечения ванкомицином и высокой дозой РВ6, где выжили 4 из 6 животных (фиг.5).

На 7-й день наблюдалось снижение средней массы тела во всех группах, в которых была вызвана CDAD. Наблюдалась отчетливая обратная связь между реакцией и дозой РВ6 относительно этого уменьшения массы (таблица 5). Животные, получавшие низкую дозу РВ6, в среднем потеряли в 3 раза больше массы тела, чем животные, которые получали высокую дозу. Потеря массы тела была минимальной в группе лечения ванкомицином. В двух группах, в которых не была вызвана CDAD, средняя масса тела в течение того же периода времени несколько увеличилась.

Таблица 5Средняя масса тела (г) и прибавка массы тела (%)
Лечение	Средняя масса тела (г)	Разность средней массы тела (%)
	День 0	День 7	День 0-7
Вызванная CDAD
Без лечения	219,0±5,1 (n=6)	∗	∗
Ванкомицин	218,0±4,6 (n=6)	215,8b±1,7 (n=4)	-1,7b±1,8
Высокая доза РВ6	218,8±4,0 (n=6)	206,5с±5,7 (n=4)	-5,0b±2,1
Средняя доза РВ6	217,8±3,2 (n=6)	189,0d±2,7 (n=3)	-12,9с±0,7
Низкая доза РВ6	217,2±4,5 (n=6)	176,5с±2,1 (n=2)	-17,9d±1,2
Не вызванная CDAD
Высокая доза РВ6	217,8±2,3 (n=6)	230,0a±7,6 (n=6)	-5,6a±3,1
Высокая доза РВ6	219,2±3,9 (n=6)	225,8a±4,8 (n=6)	3,1a±3,2
*нет данных, все животные погибли a,b,c,d,e величины в пределах одной колонки, не имеющие надстрочного обозначения, являются статистически значимо отличными (P<0,05, минимальное статистически значимое различие)

Присутствие клостридиевого токсина А и В в образцах фекалий животных, у которых была вызвана CDAD, контролировали на 1-й, 2-й и 7-й день. Как ожидалось, у групп, проявивших высокую смертность и высоКОЕ снижение средней массы тела, также имелась высокая процентная доля животных, имевших положительный результат на эти токсины снова при обратной связи между реакцией и дозой РВ6.

Таблица 6Количество животных с положительным результатом теста на присутствие токсинов А или В C. difficile в их фекалиях
Лечение	День 1	День 2	День 7
	Положительный результат	Тестированные	Положительный результат	Тестированные	Положительный результат	Тестированные
Без лечения	3	6	5	6	∗	∗
Ванкомицин	0	6	2	6	1	4
Высокая доза РВ6	0	6	3	6	2	4
Средняя доза РВ6	0	6	3	6	2	3
Низкая доза РВ6	0	6	5	6	2	2
∗нет данных, все животные погибли

Вывод

Это исследование было предназначено и проведено для оценки эффективности B.PB6 при лечении CDAD на модели CDAD, вызванной клиндамицином у хомячков, хорошо установленной и высоко чувствительной модели этой инфекции. У всех хомячков, которые не получали лечение после индукции CDAD, развилась тяжелая диарея, они потеряли массу тела и погибли в пределах пяти дней. Лечение РВ6 привело к связанной с дозой реакции. Диарея, снижение массы тела и смертность были минимальными при самой высокой дозе РВ6. При прекращении лечения самая высокая из доз РВ6 проявила такую же эффективность лечения как ванкомицин, помогая хомячкам выживать при CDAD, вызванной клиндамицином.

Оценка эффективных компонентов перорально вводимой Bacillus PB6

Новая диетологическая концепция пробиотиков (таких как инулин) приобретает популярность среди специалистов по питанию, врачей, производителей пищевых продуктов и потребителей. Наиболее широко принятым определением пробиотической пищи является: «Пробиотик представляет собой селективно ферментированный ингредиент, который обеспечивает возможность специфических изменений и состава, и активности желудочно-кишечной микрофлоры, что оказывает благоприятные воздействия на благополучие и здоровье организма». Для того, чтобы классифицироваться в качестве пробиотического ингредиента в пищевых продуктах, этот ингредиент должен 1) противодействовать перевариванию (гидролизу) алиментарными ферментами в желудке и тонкой кишке; 2) поступать в ободочную кишку химически интактным и в последующем подвергаться частичной или полной ферментации и 3) стимулировать активный рост и/или активность укрепляющих здоровье кишечных бактерий. Благоприятные воздействия на з