Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком

Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Один аспект настоящего изобретения относится к способу получения белков в двухцепочечной форме путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах Е. coli. Другой аспект настоящего изобретения относится к белкам или полипептидам в двухцепочечной и биологически активной форме, которые могут быть получены вышеупомянутым способом.

Важное преимущество по сравнению с соответствующими рекомбинантными белками/полипептидами, которые не проявляют признаки согласно изобретению, состоит в том, что нет необходимости подвергать их обработке специфичной протеазой для направленного расщепления полипептидной цепи, поэтому способ их получения значительно упрощается. Дополнительные аспекты настоящего изобретения составляют нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептиды/белки согласно настоящему изобретению; векторы, которые содержат такие нуклеиновые кислоты или последовательности нуклеиновых кислот; клетки-хозяева, которые, в свою очередь, содержат вышеупомянутые векторы; и, наконец, фармацевтические композиции, которые содержат двухцепочечные и биологически активные белки/полипептиды.

Клостридиальные нейротоксины являются сильными ингибиторами кальций-зависимой секреции нейротрансмиттеров в нейрональных клетках. После перорального приема ботулинических токсинов (BoNT), например, через испорченную пищу, возникнет клиническая картина, называемая ботулизмом, которая характеризуется параличом различных мышц. Паралич дыхательных мышц может в конечном итоге привести к смерти зараженного человека. В связи с этим передача сигнала от нерва к мышце прерывается при концевой двигательной пластинке, поскольку двигательные нейроны более не могут секретировать ацетилхолин. Ботулинические нейротоксины развивают свое ингибирующее действие посредством протеолитического расщепления белков, участвующих в процессах секреции, так называемых белков SNARE. В данном контексте нейротоксины различных серотипов обладают различной специфичностью в отношении белков SNARE и сайтов расщепления в соответствующих аминокислотных последовательностях. BoNT(A) и BoNT(Е) расщепляют SNARE белок SNAP-25, тогда как BoNT(C) распознает как SNAP-25, так и синтаксин-1 в качестве субстрата. Также токсины серотипов В, D, F и G, а также столбнячный токсин (TeNT) расщепляют VAMP-2 (синапробревин-2) (Schiavo et al., 1997).

Клостридиальные нейротоксины являются сильнейшими известными ядами. Например, введенная внутривенно летальная доза, при которой половина всех мышей группы дозировки погибает от ботулизма, составляет всего лишь 5 пг. То, что токсины большинства серотипов являются токсичными также при пероральном введении, является результатом комплексных белков, в которые они заключены и которые, таким образом, защищают их от разрушения пищеварительными ферментами, поскольку они проходят через желудочно-кишечный тракт. Им также приписывают функцию в резорбции токсинов через эпителий тонкого кишечника (Fujinaga, 1997).

В течение последних десятилетий ботулинические токсины серотипов А и В нашли терапевтические применения. Например, возможно путем направленной инъекции только минимальных доз расслабить индивидуальные мышцы при их хроническом спазме. Особым преимуществом является длительная эффективность, например, BoNT(A) и BoNT(B) в течение периода от более трех до шести месяцев. Первыми показаниями были, среди прочего, дистония, такая как кривошея, блефароспазм и страбизм; были добавлены дополнительные показания, такие как гипергидроз или косметические терапии для разглаживания морщин. Рынок ботулинического токсина в качестве терапевтического агента быстро растет, не только в связи с разработкой дополнительных показаний, но и в связи с более интенсивным использованием уже существующих применений. В этой связи предпринимаются попытки улучшить свойства нейротоксинов в отношении продолжительности действия, эффективности и антигенного потенциала. Испытания показали, что комплексные белки, которые содержатся в имеющихся в продаже препаратах (ВОТОХ, доступном от Allergen, и Dysport, доступном от Ipsen-Beaufort, как препаратах BoNT(A), а также в Myobloc/Neurobloc, доступном от Elan, как препарате BoNT(B)), не обладают положительными эффектами на продолжительность действия и эффективность, но в связи с более высоким количеством белка по сравнению с препаратом чистого нейротоксина с такой же активностью могут инициировать запуск иммунологических реакций у пациента, так что дальнейшие инъекции становятся неэффективными.

Поскольку комплексные белки не требуются в препарате активного ингредиента и даже обладают недостатками, и некоторые модификации для улучшения свойств могут быть достигнуты только с помощью генно-инженерной технологии, существует огромная потребность в получении нейротоксинов путем рекомбинантной экспрессии, например путем экспрессии в Escherichia coli (нейротоксины, образованные таким путем, свободны от вышеупомянутых комплексных белков). Новые показания следует разрабатывать, кроме того, в том направлении, что ботулиническим токсинам следует придавать различную клеточную специфичность. В этой связи путь посредством рекомбинантного токсина или производного токсина также является предпочтительным.

Ботулинические токсины, а также столбнячный токсин имеют высокие степени гомологии в отношении их аминокислотной последовательности и являются подобными, в частности, в отношении их доменной структуры. Они состоят из домена, связывающего рецептор (H_C), домена транслокации (H_N) и каталитической субъединицы (L), которая осуществляет в нервной клетке расщепление соответствующего SNARE белка. Н_С ответственен за специфичное связывание нейротоксинов с концевыми двигательными пластинками, тогда как домен транслокации обеспечивает прохождение L из эндосом в цитоплазму нейронов. H_N (N-конец) и Н_С (С-конец) образуют тяжелую цепь 100 кДа, тогда как L представляет собой легкую цепь и образует каталитическую субъединицу 50 кДа. Обе полипептидные цепи соединены друг с другом дисульфидным мостиком. Между участвующими цистеиновыми остатками линкерная область или область петли (также называемая синонимом линкерная последовательность или последовательность петли, или, проще, линкером или петлей), длина которой между ботулиническим и токсинами индивидуальных серотипов очень варьирует. В последний момент высвобождения токсинов из клостридии в ходе клеточного лизиса петля расщепляется клостридиальной эндопептидазой, которая до сих пор не охарактеризована, где отношение расщепленных и нерасщепленных типов варьирует между серотипами. Для активности нейротоксинов расщепление петли до двухцепочечного токсина является существенным (Schiavo et al., 1997). Например, в случае ботулинического нейротоксина А декапептид вырезается из петли, то есть в последовательности петли VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL, которая имеет на N-конце, а также на С-конце цистеиновый остаток в качестве ближайшего соседнего остатка, не только одна пептидная связь расщепляется, но происходит два события протеолитического расщепления. В этой связи молекулярная масса биологически активного ботулинического нейротоксина А в природе ниже, чем исходного токсина, транслируемого клостридией. Поскольку клостридиальная протеаза отсутствует в других организмах-хозяевах, таких как Escherichia coli, рекомбинантные ботулинические токсины и их фрагменты или производные экспрессируются в них в виде одноцепочечных пептидов. Это, вероятно, также верно для любых других белков, которые осуществляют свою нормальную биологическую/биохимическую активность в виде двухцепочечного белка. Как правило, такие белки получают посредством технологии рекомбинантных ДНК в виде одноцепочечных белков, их биологическая/биохимическая активность, которую они проявляют в природе в виде двухцепочечных белков, следовательно, едва ли присутствует или вовсе отсутствует.

Ранее с целью создания активного белка, в частности активного ботулинического токсина было необходимо введение последовательности распознавания для специфичной к последовательности протеазы, такой как тромбин, фактор Ха АА или гененаза, так чтобы после очистки можно было осуществить расщепление и, следовательно, активацию путем добавления эндопротеазы. Применение такой эндопротеазы имеет два существенных недостатка: с одной стороны, не всегда можно исключить, что в аминокислотной последовательности присутствуют другие дополнительные сайты расщепления кроме одного сайта расщепления, который был добавлен с помощью методов генной инженерии. Даже когда в этих вторичных сайтах расщепления вырезание происходит значительно менее эффективно, после обработки протеазой в результате может образоваться смесь различных вариантов расщепления токсина, которые можно разделить только с трудом. С другой стороны, в случае фармацевтических препаратов по причинам фармацевтического законодательства (нормативных указаний) значительным недостатком является дополнительное добавление белка или возможность контакта препарата с дополнительным белком, поскольку должно быть гарантировано полное удаление этого белка и его возможно имеющихся примесей при дальнейшей обработке; это, как правило, требует значительных затрат.

Активация путем протеолитического расщепления до двухцепочечного полипептида с дисульфидным мостиком требуется также в случае других бактериальных токсинов, например псевдомонадного экзотоксина или дифтерийного токсина с целью осуществления ферментативным доменом токсического действия (например, путем АДФ-рибозилирования фактора элонгации и, таким образом, ингибирования синтеза белка). Эти токсины используют для получения так называемых иммунотоксинов, которые применяют, в частности, в терапии опухолей. Для данной цели клеточный связывающий домен токсина заменяют белковым доменом, который обладает высокой аффинностью связывания с опухолеспецифичным поверхностным белком (антигеном дифференциации или антигеном, ассоциированным с опухолью). Хотя в классических иммунотоксинах эти белковые домены состоят из моноклонального антитела или его фрагмента, специфичность к некоторым опухолевым клеткам можно также придавать с помощью цитокинов, ростовых факторов, а также мутированных и отобранных белков семейства аффилинов, белков с анкириновыми повторами или антикалинов, называя лишь немногие примеры. При рекомбинантной экспрессии таких слитых белков получают одноцепочечные полипептиды. Хотя, например, рицин не имеет сайта процессинга для протеаз, за исключением протеаз Ricinus communis, и такой сайт должен быть вставлен, фрагменты дифтерийного токсина и фрагменты псевдомонадного экзотоксина в качестве компонентов иммунотоксинов могут расщепляться после интернализации в эндосомном компартменте протеазой клетки-мишени. Это происходит в области петли между цистеиновыми остатками, которые образуют дисульфидный мостик. Однако только минимальная часть, а не все интернализованные молекулы иммунотоксина претерпевают процессинг таким путем (Ogata et al., 1990).

С целью получения рекомбинантных белков, в частности, полипептидов меньшего размера, в достаточных количествах и в растворимой форме во многих случаях необходимо экспрессировать их в виде слитого белка или гибридного белка, например, с глутатион-S-трансферазой или белком, связывающим мальтозу, в Escherichia coli. Кроме того, в продаже имеются различные системы экспрессии, с помощью которых желаемый полипептид экспрессируется посредством N-концевой или С-концевой метки для аффинной очистки, например метки His, метки Strep или метки FLAG. Во многих ситуациях в экспрессионной плазмиде имеется последовательность распознавания протеазы между множественными сайтами клонирования, где встроена последовательность ДНК, кодирующая желаемый белок, и кодирующая последовательность для партнера слияния или для аффинной метки. Эта последовательность предназначена для обеспечения того, чтобы после экспрессии и очистки слитого белка можно было отделить желаемый белок от дополнительных пептидных областей путем добавления подходящей специфичной к последовательности эндопротеазы (например, тромбина, фактора Ха или гененазы). Если эти два партнера слияния были связаны друг с другом ковалентной связью посредством дисульфидного мостика вместо пептидной связи, возможно было бы отделение одного от другого после очистки посредством простого восстановления тиолсодержащими веществами, такими как β-меркаптоэтанол, дитиотрейтол (ДТТ) или восстановленный глутатион. Например, желаемый белок можно было бы элюировать из аффинной матрицы, например, агарозы Ni-NTA или сефарозы StrepTactin вышеупомянутыми восстанавливающими агентами, тогда как аффинная метка остается связанной с матрицей. Следующую стадию очистки для отделения аффинной метки или добавленной эндопептидазы можно было бы, таким образом, устранить.

Следовательно, было бы желательно разработать способ рекомбинантной экспрессии белков/полипептидов в целом, в частности нейротоксинов, а также фрагментов и производных указанных нейротоксинов, а также слитых белков или гибридных белков, в частности иммунотоксинов, которые уже присутствуют после лизиса клеток-хозяев, в их биологически активной двухцепочечной структуре, где эти две цепи связаны дисульфидными мостиками. Такой способ получения таких белков и полипептидов предложен в данном изобретении.

Неожиданно автор изобретения обнаружил, что как фрагмент LH_N BoNT(А), так и полноразмерный нейротоксин А, оба полученные путем рекомбинантной экспрессии в виде одной цепи, но проявляющие свою нормальную биологическую/биохимическую активность в двухцепочечной форме с дисульфидными мостиками, получают путем рекомбинантной экспрессии в двухцепочечной форме, когда фрагмент LH_N или полноразмерный токсин, предпочтительно на уровне нуклеиновой кислоты, подвергают по меньшей мере одной определенной модификации. Последующие тесты, проведенные автором изобретения, показали, что это остается верным также для любых других белков/полипептидов ввиду того, что их получают в соответствии с общепринятыми рекомбинантными методами в виде одной цепи, но они проявляют свою биологическую активность в двухцепочечной форме с дисульфидными мостиками.

Вышеупомянутая "по меньшей мере одна модификация" в случае BoNT(A) или в случае фрагмента LH_N BoNT(A) относится к вставке пентапептидной последовательности, называемой PRS (сайт распознавания протеазы). В общем случае белка/полипептида пентапептидная последовательность, которая присутствует в этом белке/полипептиде, который нужно модифицировать (предпочтительно на уровне нуклеиновой кислоты), может быть модифицирована таким путем (например, путем по меньшей мере одной замены аминокислотного остатка, либо путем вставки только нескольких аминокислотных остатков PRS, либо путем делеции аминокислотных остатков), чтобы она совпадала с пентапептидной последовательностью PRS, встроенной в уже присутствующую последовательность. Таким же путем может быть вставлена гекса/гепта/окта- (и т.д.) пептидная последовательность с необходимостью или без необходимости делеции либо одного, либо двух, либо трех, либо нескольких аминокислотных остатков. В соответствии с изобретением единственным преимуществом является то, что конечный экспрессированный полипептид имеет PRS (пентапептид) последовательность в его области петли, где область петли согласно изобретению определяют как аминокислотную последовательность, которая находится между двумя цистеиновыми остатками, участвующими в дисульфидном мостике. Когда эта последовательность PRS присутствует в области петли, следствием этого является то, что после расщепления одноцепочечного полипептида, соседнего с полипептидной последовательностью PRS (на аминокислотном уровне), последовательности, которые присутствуют в природе в двух различных цепях, также распределяются на две различные цепи. В случае ботулинического нейротоксина А (BoNT(А)) эта последовательность PRS предпочтительно встроена в петлю путем делеции пентапептида Asp₄₄₃-Asp₄₄₇ BoNT(A) (см. Фиг.3-1). В других белках/полипептидах (например, в случае BoNT(B), BoNT(C1), BoNT(D), BoNT(E), в случае рицина, в случае РЕ40 псевдомонадных экзотоксинов или в случае дифтерийного токсина (DT)) вместо этого предпочтительно встраивать модифицированную петлю BoNT(A) в последовательность петли (см. Фиг.3-2 - 3-5), где аминокислотные остатки природной последовательности петли могут быть либо делетированы, либо не делетированы. Модифицированная последовательность петли на Фиг.3-2 - 3-5 представляет собой последовательности без двух концевых остатков Cys, где центральная аминокислота последовательности PRS может представлять собой не только R, Y, Н или Q, но также любую другую встречающуюся в природе аминокислоту. В случае вышеупомянутых других белков/полипептидов особенно предпочтительно встраивать только часть модифицированной петли BoNT(A), в частности последовательность GIITSKTKSLVPXGSKALNDL (X = встречающаяся в природе аминокислота), где аминокислотные остатки природной последовательности петли могут быть либо делетированы, либо не делетированы). Модифицированные последовательности петли на Фиг.3-2 - 3-5 представляют собой последовательности без двух концевых остатков Cys.

Для фрагмента LH_N BoNT(A) или для полноразмерного рекомбинантного токсина это означает, таким образом, что модификация последовательности представляет собой изменение в области петли между L и H_N, и это изменение обеспечивает присутствие последовательности PRS. Согласно изобретению последовательность PRS, и не только для BoNT(А), представляет собой пентапептидную последовательность Val-Pro-Xaa-Gly-Ser. Xaa означает любую встречающуюся в природе аминокислоту. Независимо от того, представляет ли собой Xaa Arg или любую другую встречающуюся в природе аминокислоту, на пентапептидную последовательность Val-Pro-Xaa-Gly-Ser в любом случае ссылаются как на пентапептидную последовательность. Когда, однако, один из четырех других аминокислотных остатков последовательности PRS заменен, что действительно возможно в контексте настоящего изобретения, в частности, соответствующими гидрофильными/гидрофобными или полярными униполярными остатками, эту последовательность будут называть в данном контексте и в дальнейшем как вариант PRS-пентапептидной последовательности. Варианты присутствуют, например, когда Val заменен Leu, Ile, Ala, Phe, Pro или Gly. Кроме того, варианты присутствуют, когда (также или только) пролин во втором положении PRS, смотря с N-конца, заменен Leu, Ile, Ala, Phe, Val или Gly. Также глицин в четвертом положении PRS может быть, например, заменен Leu, Ile, Ala, Pro, Phe или Val; это приводит к другим вариантам. И когда серин в пятом положении PRS заменен, например, Tyr, Trp, Thr, возможно также Cys или Met, присутствует еще один тип варианта. Согласно изобретению те последовательности, которые содержат по меньшей мере в одном из положений 1, 2, 4 и 5 последовательности PRS аминокислотный остаток, который является отличным от Val-1, Pro-2, Gly-4 и/или Ser-5, называют вариантами пентапептидной последовательности.

Когда фрагмент LH_N BoNT(A) (или полноразмерный токсин) или любой другой белок/полипептид, обычно получаемый путем рекомбинантной экспрессии в виде одноцепочечного белка/полипептида, но обладает биологической/биохимической активностью (только) в двухцепочечной форме, содержит пентапептидную последовательность Val-Pro-Xaa-Gly-Ser (где Хаа представляет собой любую из 20 встречающихся в природе аминокислот и где четыре другие аминокислоты могут быть заменены в соответствии со значением, данным в предыдущем абзаце), он будет присутствовать в лизате клеток-хозяев Е. coli (например, Е. coli К12, в частности клетки-хозяева Е. coli К12 штаммов M15[pREP4], XL1-BLUE или UT5600) в двухцепочечной форме, где в случае BoNT(A) легкая цепь связана ковалентной связью с H_N или полноразмерной тяжелой цепью дисульфидным мостиком (фиг.7). Расщепление полипептидной цепи осуществляется либо непосредственно после лизиса клеток, либо по существу завершается после нескольких часов инкубации клеточного лизата. Автопротеолиз за счет активности протеазных доменов токсина или фрагмента токсина можно исключить, поскольку мутанты, неактивные по протеазе, которые модифицированы соответственно в области петли, также присутствуют в двухцепочечной структуре после экспрессии и разрушения клеток-хозяев Е. coli. Очевидно, протеаза штамма-хозяина Е. coli ответственна за расщепление пентапептидной последовательности PRS.

Следующая предпочтительная модификация в соответствии с абзацем, начинающимся "Неожиданно автор изобретения…" четырьмя абзацами выше, состоит в том, что на N-конце последовательности PRS на расстоянии от 1 до 20 аминокислотных остатков (аминокислота в направлении N-конца, которая расположена непосредственно рядом с остатком валина пентапептидной последовательности PRS, в случае Фиг.3-2 - Фиг.3-5 остаток лейцина, имеет расстояние 1 аминокислотный остаток от последовательности PRS), в частности, на расстоянии от 3 до 15 аминокислотных остатков, особенно на расстоянии от 3 до 10 аминокислотных остатков, особенно предпочтительно на расстоянии от 3 до 8 аминокислотных остатков и даже более предпочтительно на расстоянии 3 аминокислотных остатков присутствует основный аминокислотный остаток, предпочтительно остаток лизина или остаток аргинина, где на С-конце протеаза клетки-хозяина Е. coli расщепляет последовательность петли. После расщепления, таким образом, образуется полипептид, который, например, имеет два аминокислотных остатка (где определенное выше расстояние составляет 3 аминокислотных остатка) - концевые от остатка валина последовательности PRS. В настоящем случае "модификация" не обязательно означает модификацию в истинном смысле, то есть вставку или замену аминокислотного остатка, так чтобы в результате на N-конце последовательности PRS на определенном выше расстоянии от 1 до 20 аминокислотных остатков был расположен основный аминокислотный остаток (например, остаток лизина). Важно только, чтобы основный аминокислотный остаток (такой как остаток лизина или остаток аргинина) присутствовал на N-конце последовательности PRS на вышеупомянутом расстоянии.

Другая модификация, также необязательная, но предпочтительная, в соответствии с абзацем "Неожиданно автор изобретения…" пятью абзацами выше, состоит в том, что последовательность петли, в которой протеаза клеток-хозяев E. coli расщепляет, имеет длину по меньшей мере девять аминокислотных остатков. Предпочтительные длины последовательностей петли составляют по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 18, по меньшей мере 20 и по меньшей мере 23 аминокислотных остатка. Особенно предпочтительные длины последовательности петли составляют от 15 до 22, в частности от 18 до 22 аминокислотных остатков.

Способ по изобретению представляет собой в самом общем виде способ получения белков/полипептидов в двухцепочечной форме, где две цепи связаны дисульфидным мостиком, путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах Е. coli, где (1) белок/полипептид проявляет свою биологическую активность в виде двухцепочечного белка/полипептида с дисульфидным мостиком; (2) С-концевой аминокислотный остаток первой цепи представляет собой остаток Arg или остаток Lys; (3) вторая цепь белка/полипептида имеет N-конец из цистеинового остатка в качестве N-концевого от 1 до 20 аминокислотных остатков и пентапептидной последовательности VPXGS, обозначенной как PRS, где Х представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, где V представляет собой Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro или Gly, где Р представляет собой Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val или Gly, где G представляет собой Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe или Val, и где S представляет собой Ser, Tyr, Trp или Thr; и (4) этот способ включает следующие стадии: (а) модификацию белка/полипептида на уровне нуклеиновой кислоты, так чтобы белок/полипептид в его модифицированной форме имел в пределах его области петли вышеупомянутую пентапептидную последовательность (VPXGS); (б) введение конструкции, модифицированной на уровне нуклеиновой кислоты, в клетки Е. coli; (в) культивирование и последующий лизис клеток-хозяев; и (г) выделение двухцепочечных белков/полипептидов.

Согласно изобретению первая цепь белка/полипептида предпочтительно представляет собой цепь, которая кодируется N-концом соответствующей ДНК, тогда как вторая цепь белка/полипептида соответственно представляет собой цепь, которая кодируется С-концом соответствующей ДНК. Поскольку экспрессия 5'-ДНК-3' приводит к N-полипептид-С, в вышеупомянутом предпочтительном случае изобретения это означает, что экспрессия может быть представлена следующим образом: 5' ДНК-3' экспрессируется до N-первая полипептидная цепь-С-петля-N-вторая полипептидная цепь-С. Согласно изобретению петля расщепляется уже in situ, так что в конечном итоге полипептид/белок N-первая полипептидная цепь-С-N-вторая полипептидная цепь-С согласно изобретению образуется в двухцепочечной структуре.

Выражение "вторая цепь белка/полипептида имеет N-конец из цистеинового остатка в качестве N-концевого от 1 до 20 аминокислотных остатков и пентапептидной последовательности VPXGS, обозначенной как PRS" означает, что N-конец не образован, например, остатком валина пентапептидной последовательности VPXGS, но другим (любым) аминокислотным остатком. Между последним и остатком валина PRS могут быть дополнительно расположены от 1 до 19 аминокислотных остатков, но N-концевой аминокислотный остаток может быть связан непосредственно, например, с остатком валина, посредством пептидной связи, то есть может представлять собой ближайший остаток, соседний с остатком валина PRS.

Белки/полипептиды по изобретению, которые могут быть выделены в их (биологически) активной двухцепочечной структуре, представляют собой белки, в которых С-конец первой цепи имеет основный аминокислотный остаток, в частности остаток Arg или остаток Lys, и в которых вторая цепь обеспечена N-концом с 1-20 аминокислотными остатками и с пентапептидной последовательностью VPXGS, называемой PRS, где X, V, Р, G и S определены, как указано выше.

Согласно настоящему изобретению в случае иммунотоксинов, которые основаны на рекомбинантном рицине, например, обработка специфичной к последовательности протеазой, такой как тромбин или фактор Ха, для активации является излишней. Например, в случае иммунотоксинов на основе дифтерийного токсина или псевдомонадного токсина следовало ожидать значительного повышения эффективности, и оно действительно также получено, поскольку обработка протеазой клетки-мишени в качестве ограничивающей скорость стадии для перемещения ферментативного домена токсинов в цитоплазму больше не требуется. Такие иммунотоксины, которые уже присутствуют в виде двухцепочечного полипептида с дисульфидным мостиком, могут применяться в малых дозах и все же обеспечивать такое же цитотоксическое действие. Это снижает, с одной стороны, стоимость терапии и, с другой стороны, уменьшает риск образования антител, которые делали бы иммунотоксины неэффективными при последующих применениях. Способ получения двухцепочечных с дисульфидным мостиком и, следовательно, активированных иммунотоксинов предложен настоящим изобретением.

Способом, предложенным в данном изобретении, также возможно получение слитых белков или гибридных белков, то есть белков с пептидной меткой для аффинной очистки, в двухцепочечной форме, две полипептидные цепи которых ковалентно связаны дисульфидным мостиком, и после аффинной хроматографии или других методов очистки могут быть отделены простым восстановлением тиолсодержащими веществами, такими как β-меркаптоэтанол, ДТТ или восстановленный глутатион.

Рекомбинантная экспрессия клостридиальных нейротоксинов и их фрагментов (например, фрагмента LH_N или производного клостридиального нейротоксина, например, с модифицированной клеточной специфичностью) в экспрессионных штаммах Е. coli, таких как M15[pREP4] или BL21(DE3), дает одноцепочечные полипептиды. В результате обработки этих полипептидов трипсином расщепление имеет место в области последовательности петли в области перехода протеазного домена в домен транслокации. Поскольку трипсин не является протеазой, специфичной к последовательности, вероятно расщепление, обычно нежелательное, в дополнительных областях полипептида. Например, BoNT(А) дополнительно расщепляется трипсином между H_N и Н_С, так что получаются двухцепочечный фрагмент LH_N и фрагмент Н_С. С целью обеспечения избирательного расщепления в области петли, желательного в большинстве случаев, необходимо присутствие, возможно после вставки, последовательности распознавания для специфичных эндопротеаз.

Расщепление рекомбинантных слитых белков/гибридных белков посредством специфичных к последовательности эндопротеаз, таких как тромбин, фактор Ха, гененаза и т.д., находится в пределах области общеизвестного спектра методов. Возможно отделение после очистки партнера слияния, который придает улучшенную растворимость рекомбинантному белку/полипептиду и/или улучшенную экспрессию, либо служит в качестве пептидной метки для аффинной очистки. Для этой цели раствор белка инкубируют с растворимой эндопротеазой в растворимой форме или в иммобилизованной форме на матрице.

Эту методику можно использовать также для экспрессии вышеупомянутых рекомбинантных белков/полипептидов, которые проявляют свою нормальную биологическую/биохимическую активность в виде двухцепочечного белка/полипептида, но посредством технологии рекомбинантных ДНК получаются в виде неактивных одноцепочечных белков/полипептидов (например, экспрессия клостридиальных нейротоксинов, фрагментов клостридиальных нейротоксинов, таких как фрагменты LH_N, или производных клостридиальных нейротоксинов, например, с модифицированной клеточной специфичностью). Последовательность распознавания для эндопротеазы клонируют в полипептид, предпочтительно на уровне нуклеиновых кислот, например, в области петли между L и H_N, и, кроме того, клонируют на N-конце или на С-конце дополнительную последовательность распознавания для той же или дополнительной эндопротеазы, фланкированную пептидной меткой для аффинной очистки. Затем одноцепочечный экспрессированный белок/полипептид активируют путем обработки соответствующей эндопротеазой или эндопротеазами одновременно или последовательно посредством расщепления в области петли между L и H_N и пептидную метку удаляют.

Помимо затрат на использование таких эндопротеаз и необходимости, таким образом, в дополнительных стадиях обработки, их применение в фармацевтических препаратах (например, применение рекомбинантных ботулинических токсинов или их производных) в высокой степени проблематично по причинам фармацевтического законодательства (нормативов). С одной стороны, чистота используемой эндопротеазы должна быть экспериментально подтверждена и, с другой стороны, полное удаление и, в частности, свобода препарата от вирусов в ходе протокола дальнейшей очистки должны быть точно документированы; это в целом требует огромных затрат на анализы. Поскольку в будущем ботулинические токсины, например, с улучшенными свойствами или модифицированной клеточной специфичностью также следует изготавливать путем рекомбинантной экспрессии, существует огромная необходимость в способе экспрессии, который обеспечивает получение вышеупомянутых рекомбинантных белков/полипептидов, которые проявляют свою нормальную биологическую/биохимическую активность в виде двухцепочечных белков/полипептидов, но получены посредством технологии рекомбинантных ДНК в форме неактивных одноцепочечных белков/полипептидов, в частности, обеспечивает получение ботулинических токсинов или их производных в виде двухцепочечных с дисульфидным мостиком, а следовательно, биологически активных полипептидов/белков, без необходимости использования эндопротеаз.

В изобретении, которое будет более подробно объяснено далее, предложен в самом широком смысле способ, при котором белки, такие как клостридиальные нейротоксины, а также их фрагменты и производные могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах Е. coli и могут быть выделены в их двухцепочечной с дисульфидным мостиком, а следовательно, биологически активной форме, без их активации, требующей добавления эндопротеазы.

В первом предпочтительном воплощении изобретения аминокислотная последовательность области петли BoNT(A) между остатками цистина 430 и 454 (см. Фиг.3-1 - 3-5) модифицирована таким образом, что экспрессированный токсин или его фрагменты/производные в лизате клеток-хозяев E. coli уже присутствуют в виде двухцепочечного полипептида. Эти две цепи ковалентно связаны друг с другом с участием остатка цистина 430 и 454 посредством дисульфидного мостика. В особенно предпочтительном воплощении изобретения, как объяснено на Фиг.3, пентапептид Asp₄₄₃-Asn₄₄₇ (DKGYN) может быть заменен Val-Pro-Arg-Gly-Ser (VPRGS). В дополнительных предпочтительных воплощениях изобретения пентапептид Asp₄₄₃-Asn₄₄₇ (DKGYN) может быть также заменен Val-Pro-Tyr-Gly-Ser (VPYGS), Val-Pro-His-Gly-Sr (VPHGS) или Val-Pro-Gln-Gly-Ser (VPQGS). В данном контексте также остается верным то, что не только центральный аминокислотный остаток может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, но также то, что четыре других аминокислотных остатка могут быть также заменены, как подробно объяснено выше (при замене по меньшей мере одного из этих остатков вариант последовательности PRS присутствует в значении изобретения). Кроме того, в отношении как данного воплощения, так и всех других предпочтительных воплощений, которые будут объяснены в дальнейшем, остается верным, что в дополнение предпочтительно, когда последовательность петли имеет на N-конце к PRS на расстоянии от 1 до 28 аминокислот основный аминокислотный остаток, в частности остаток лизина или аргинина.

Специалисту в данной области техники очевидно, что дополнительные замены индивидуального или нескольких аминокислотных остатков либо вставка или делеция дополнительных аминокислотных остатков в области охарактеризованных выше петель BoNT(А) также приводит к результату, что экспрессированный токсин согласно изобретению или образованные от него фрагменты/производные в лизате присутствуют в виде двухцепочечных полипептидов. Эти возможные варианты также охватываются настоящим изобретением.

Специалисту в данной области техники также легко очевидно, что пентапептид Asp₄₄₃-Asn₄₄₇ (DKGYN), присутствующий в BoNT(A) дикого типа, может быть замещен гексапептидом, гептапептидом, октапептидом и т.д. настолько, чтобы в экспрессированном и транслированном в одноцепочечном виде полипептиде/белке в области петли присутствовала PRS-пентапептидная последовательность или один из ее возможных вариантов. Как объяснено выше, предпочтительно, когда на N-конце этого пентапептида присутствует основный аминокислотный остаток (предпочтительно лизин).

Кроме того, специалисту в данной области техники очевидно, что предпочтительное воплощение пентапептида (Val-Pro-Arg-Gly-Ser) PRS представляет собой участок возможной последовательности распознавания для протеазы тромбина, которая играет важную роль в каскаде свертывания крови и обладает высокой специфичностью к последовательности. Следует особенно отметить, что, во-первых, ни в ботулиническом нейротоксине типа А, ни в других полипептидах не требуется расщепление тромбином с целью получения желаемой двухцепочечной формы с дисульфидным мостиком и что, во-вторых, последовательность распознавания тромбина сама по себе, то есть в ее иммобилизованной форме, благоприятна для расщепления протеазной активностью лизата Е. coli, но не обязательна. Воплощения пентапептидных последовательностей PRS, которые встроены или сконструированы в соответствующих полипептидах (лучше: в их петлях), которые не содержат остаток аргинина, при С-конце которых тромбин может расщеплять (вместо этого присутствует другая встречающаяся в природе аминокислота), также приводят к расщеплению в петле, как объяснено выше. Это расщепление осуществляется предпочтительно при остатке лизина петли, который находится на N-конце пентапептида, как объяснено выше (см. также пример 2; Фиг.3).

Поскольку другие серотипы ботулин