Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента c1q комплемента человека

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента c1q комплемента человека

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Известен способ определения функциональной активности компонента C1q, который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G или М человека [1]. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C1q определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C1q, конъюгированных с ферментом.

Недостатками этого способа являются трудность получения иммунохимически чистых препаратов иммуноглобулина G или М человека и плохое сохранение активирующей способности при хранении.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента C1q классического пути системы комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора классического пути комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесение в лунки микропанели анализируемой пробы, содержащей компонент C1q комплемента человека и проведение инкубации, в ходе которой C1q связывается на сорбированном активаторе в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого компонента C1q, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента C1q человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности компонента C1q по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту C1q комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности компонента C1q, обладающих хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования трудно выделяемого и плохо сохраняющего свою активирующую способность препарата иммуноглобулинов.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата компонента C1q. Растворяют аптечный препарат деринат в фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Содержимое лунок выливают, трижды отмывают планшет ЗФР-Т (фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20), затем осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносят по 100 мкл анализируемой пробы, содержащей C1q в ЗФР-Т. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C1q человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера с ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 5-10 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата C1q рассчитывают по стандартной кривой (см. чертеж).

Пример 2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C1q комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту C1q комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента C1q.

Из приведенных на чертеже результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента C1q с коэффициентом корреляции R²=0,996, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента C1q описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н., Гузова В.А., Лысакова С.В. Способ определения функциональной активности субкомпонента C1q комплемента человека. 2000. Патент РФ 2144676. // Бюл. №2. 20.01.2000.

1. Способ определения функциональной активности компонента C1q комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора классического пути комплемента, внесение в лунки микропанели анализируемой пробы, содержащей компонент C1q комплемента человека с неизвестной активностью, инкубацию, выливание содержимого лунок, внесение конъюгата фермента с антителами против компонента C1q человека, а затем после инкубации и удаления инкубационного раствора внесение субстрата этого фермента, проведение расчета активности компонента C1q по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора классического пути комплемента используют деринат.

2. Набор для определения функциональной активности компонента C1q комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту C1q комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента C1q.