Способ подготовки биологической ткани органа трупа для хемилюминесцентного анализа

Способ подготовки биологической ткани органа трупа для хемилюминесцентного анализа

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к судебной медицине и биофизике.

В последнее время биофизические методы исследования в своих работах стали использовать многие специалисты. Наиболее информативными для целей и задач судебной медицины являются метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и хемилюминесценции (ХЛ).

Метод ХЛ позволяет оценить уровень свободнорадикального окисления (СРО) в различных органах и тканях (5). В литературе имеются данные об участии свободно-радикального окисления в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний (5). Методы ЭПР и ХЛ использовались для установления давности и прижизненности механических повреждений, давности наступления смерти, регистрации изменений в сердечно-сосудистой системе и т.д. (1, 2, 4, 6, 7, 8).

В настоящее время метод регистрации ХЛ применяют во всех сферах клинической медицинской деятельности - кардиология, офтальмология, дерматовенерология, геронтология, онкология и др.

С помощью метода ХЛ определяют антиокислительную активность (АОА) различных фармакологических препаратов, подбор иммуномодуляторов методом хемилюминесценции, что позволяет выбрать из наиболее эффективных препаратов именно тот иммуномодулятор, к которому наиболее чувствительны клетки крови пациента.

В клинической практике исследуемый материал - различные биологические жидкости, как-то: сыворотка крови, плазма, слеза, ликвор и т.д., т.е. анализируется жидкость, максимально освобожденная от форменных элементов и белка.

Для проведения хемилюминесцентных исследований в судебно-медицинской практике нужен абсолютно иной подход. Для решения практических задач судебной медицины можно использовать кровь, как наиболее информативный материал и фрагменты тканей органов. К сожалению, специфика исследуемого материала такова, что практически во всех экспертных случаях кровь либо гемолизирована, либо содержит большое количество сгустков.

Известно несколько способов приготовления гомогенатов тканей для хемилюминесцентного анализа. В 1978 г. В.В.Прутовых исследовал ХЛ тканей мышц крыс. Ткани помещали в охлажденный 0,25 М раствор сахарозы рН 7.4 и гомогенизировали их в стеклянном гомогенизаторе 1:10 при -4°С. В качестве среды инкубации служил раствор, состоящий из 5 мМ трисНСL, 5 мМ KH₂PO₄ и 115 мМ KCL при рН 7.4 (8). Однако в настоящее время известно, что измельчение тканей в стеклянном гомогенизаторе не позволяет получить уровень гомогенности, необходимый для проведения исследования ХЛ. Помимо этого, добавление раствора сахарозы не обосновано авторами и могло внести значительную ошибку в результаты исследования.

Мельников Ю.Л. (1970) исследовал гомогенаты тканей печени крыс. Кусочек печени подсушивали фильтровальной бумагой, далее измельчали ножницами. Полученную кашицу переносили в охлажденный стеклянный гомогенизатор и определенное число раз гомогенизировали вручную с помощью тефлонового пестика, предварительно добавив в кашицу определенное количество среды выделения следующего состава: 0,25 М сахарозы, 10^-2 М K₂HPO₄, 5×10^-5 М ЭДТА, рН 7.4. Гомогенаты разводили в растворе фосфатного буфера, содержащего 10^-2 М K₂HPO₄, 5×10^-5 М ЭДТА, 0,1 М KCl, рН 7.4 и переносили в кювету (6). Мельников Ю.Л., также как и Прутовых В.В., использовал в своей работе стеклянный гомогенизатор и добавлял в инкубационную среду раствор сахарозы, что также могло внести значительную ошибку в результаты исследования.

Кинле А.Ф. (1981) исследовал гомогенаты тканей печени, миокарда, скелетной мышцы от трупов умерших. Ткани изымались не позднее 24 часов после наступления смерти, тщательно освобождались от соединительной ткани, крови и тканевой жидкости на обеззоленных фильтрах, взвешивались на торсионных весах по 50 мг. Навески (50 мг) в фарфоровых чашках с кварцевым песком помещались в морозильную камеру для охлаждения, затем растирались до гомогенной массы с добавлением 5 мл фосфатного буфера, содержащего KH₂PO₄ и Na₂HPO₄ с рН 7.4. Гомогенаты центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Далее гомогенат разводили дистиллированной водой в соотношении 1:4 (3, наиболее близкий аналог).

Автор использовал данный метод приготовления тканей для биохимического исследования активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Взвешивание на торсионных весах априори допускает значительную погрешность в связи с малой массой навески - 50 мг. При переносе изначально малой навески в ступку возможна потеря исследуемого вещества. Охлаждение навесок в морозильной камере нецелесообразно, поскольку лучше приготовить гомогенат ex tempera, чтобы не прерывать биохимические процессы во фрагменте биоткани. Гомогенат лучше разводить буфером, использовавшимся в его приготовлении, чтобы не нарушать рН реакционной смеси. Влияние рН на параметры кинетики хемилюминесценции очень важно, в отличие от биохимического метода определения активности ЛДГ.

Технический результат заключается в повышении точности результатов ХЛ измерений, за счет:

- быстрого количественного определения и сопоставления антиокислительной активности (АОА) различных гомогенатов без пересчета на мг ткани, что позволяет устранить погрешности, связанные с нестандартизированными разведениями, а также с человеческим фактором.

- упрощения методики приготовления навески, позволяющей быстро получить достаточный объем гомогената, которого хватит для постановки реакции в нескольких разведениях в 2-х параллелях,

- использования разработанной методики разведения, позволяющей произвести измерение антиокислительной активности реакционной смеси в области прямолинейной зависимости, интенсивности хемилюминесценции от концентрации биологического вещества,

- использования разработанной процедуры хранения гомогенатов, позволяющей исключить ошибку в результатах измерения кинетики ХЛ,

- использования определенного буфера, позволяющего исключить попадание в реакционную смесь примесей и веществ, обладающих собственной антиокислительной активностью.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят гомогенаты из тканей печени, миокарда, скелетной мышцы и надпочечника (или образца любой другой ткани органа в соответствии с задачей эксперимента) на 0,05 М фосфатном буфере (рН 7.4), содержащим 3,4 г KH₂PO₄ (Калий фосфорнокислый двузамещенный), 0,0186 г ЭДТА-Na (натриевая соль этилендиаминтетраацетиловой кислоты), 50 мг КОН (едкий кали).

Используемый буфер является составной частью модельной системы гемоглобин-люминол-перекись водорода, тем самым устраняется возможное влияние на получаемые результаты посторонних включений. Добавление ЭДТА-Na способствует получению более стабильных результатов при ХЛ исследовании.

Фрагменты тканей органов тщательно освобождались от соединительной ткани, крови и тканевой жидкости на обеззоленных фильтрах, взвешивались на аналитических весах. Эмпирическим путем было доказано, что наиболее экономичной и достаточной для достижения цели - быстрого получения достаточного объема гомогената, которого хватит для постановки реакции в нескольких разведениях в 2-х параллелях - является навеска ткани массой 200 мг. Навеску ткани помещали в фарфоровую ступку с кварцевым песком и гомогенизировали с помощью лабораторного фарфорового пестика при комнатной температуре (25°С). В полученный гомогенат ткани добавляли 2 мл (объем напрямую зависит от массы навески, при таком разведении получается 10% раствор ткани) вышеуказанного буфера.

Следующий этап - центрифугирование гомогената в течение 10 мин при 2.9 тыс об/мин. Мы исследовали супернатанты ex tempera. Хранили отцентрифугированные гомогенаты в холодильнике при +4°С, максимальный срок хранения, используемый нами - 1 час при температуре +4°С, что отличает этот этап от известных процедур хранения гомогенатов (сутки). Нами было выявлено, что в течение 1 часа максимально сохраняется активность многих высокомолекулярных и низкомолекулярных компонентов биологической системы гомогената, а затем активность начинает снижаться, что может внести ошибку в результаты измерения кинетики ХЛ.

Приготовленные таким образом гомогенаты тканей стандартны, концентрация ткани в полученном растворе гомогената составляет 10% вне зависимости от типа ткани, и могут быть использованы для дальнейших исследований.

Было выявлено, что для развития свечения ХЛ на этапе измерения кинетики ХЛ требуются различные разведения гомогенатов, специфичные для определенных тканей. Эти разведения были получены эмпирическим путем и представлены в таблице. Приготовление гомогенатов с указанной кратностью позволяет получить классическую форму кинетической кривой и попасть в область прямолинейной зависимости АОА от концентрации антиоксиданта (4-16 мкмоль тролокса - синтетического аналога витамина Е, применяемого в качестве стандарта).

Разведение супернатантов гомогенатов тканей для исследования хемилюминесценции
№№	Ткань органа	Кратность разведения гомогената
1	Печень	80-160
2	Надпочечник	20-160
3	Миокард	20-40
4	Скелетная мышца	10-40

Таким образом, приготовление гомогенатов указанным способом позволит улучшить качество ХЛ измерений и будет способствовать более точной дифференциальной диагностике патологических состояний при биофизическом исследовании.

ПРИМЕР применения способа.

Для исследования доставлены фрагмент ткани печени, который был освобожден от соединительной ткани, крови и тканевой жидкости с помощью обеззоленного фильтра. Взвешиваем фрагмент ткани печени массой 200 мг, помещаем в фарфоровую ступку с кварцевым песком и гомогенизируем с помощью лабораторного фарфорового пестика при комнатной температуре (25°С). В полученный гомогенат ткани добавляем 2 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7.4), содержащего 3,4 г КН₂РО₄ (Калий фосфорнокислый двузамещенный), 0,0186 г ЭДТА-Na (натриевая соль этилендиаминтетраацетиловой кислоты), 50 мг КОН (едкий кали). Получаем 10% раствор ткани. Далее проводим центрифугирование гомогената в течение 10 мин при 2.9 тыс об/мин. Исследуем супернатант ex tempera. Для этого проводим разведение гомогената печени в 80 раз (50 мкл гомогената доводим до 4 мл 0.05 М фосфатным буфером). При таком разведении исследователь получает классическую форму кинетической кривой, которая подтверждает правильность протекания биофизических реакций в модельной системе и подлежит дальнейшему количественному анализу.

В результате исследования АОА гомогената печени составила 7.5 мкмоль тролокоса × 80 (разведение) = 600 мкмоль тролокса с учетом разведения. Таким образом, величина АОА пробы попала в область прямолинейной зависимости (от 4 до 16 мкмоль тролокса) интенсивности ХЛ от концентрации вносимого антиоксиданта. Следовательно, учитывая измерение ХЛ в данной системе при отсутствии дальнейших разведении пробы, которые могут внести погрешность в результаты исследования, повышается точность измерения ХЛ.

Благодаря разработанному методу пробоподготовки тканей органов трупов, осуществлена возможность быстрого сопоставления антиокислительной активности различных гомогенатов без пересчета на мг ткани. Также при применении разработанной нами методики происходит повышение эффективности измерения хемилюминесценции за счет правильного приготовления навески и соответственно 10% раствора ткани. Последующие разведения позволяют произвести измерение антиокислительной активности реакционной смеси в области прямолинейной зависимости интенсивности хемилюминесценции от концентрации биологического вещества.

Литература

1. Арутюнян Н.А. Экспертное установление прижизненности давности механической травмы по некоторым морфологическим, гистохимическим и биофизическим показателям печени: Автореф. дис. к.м.н. / 2-й МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова. - 1979. - 22 с.

2. Жаров В.В. Комплексная судебно-медицинская диагностика давности наступления смерти. Дисс. в виде науч. доклада д.м.н. - 1997. - 52 с.

3. Кинле А.Ф. (1981) Лактатдегидрогеназа и ее изоферменты в дифференциальной диагностике скоропостижной смерти от ишемической болезни сердца и острого отравления алкоголем: Дис. к.м.н. / 2-й МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова, Москва.

4. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В. и др. Антиоксидантная активность сыворотки крови. // Вестник Росс. Акад. мед. наук, 1999, №2, С.15-22.

5. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. // Кардиология, 2000, №7, с.48-61.

6. Мельников Ю.Л. Материалы для судебно-медицинского определения давности наступления смерти: Автореф. дис. д.м.н. / 1-й МОЛМИ им И.М.Сеченова. - 1970. - 37 с.

7. Пашинян Г.А., Назаров Г.Н. Биофизические методы исследования в судебной медицине. - Ижевск, 1999. - 178 с.

8. Прутовых В.В. Экспертное установление прижизненности и давности механической травмы по некоторым биофизическим и биохимическим показателям скелетных мышц: Автореф. дис. к.м.н. / 2-й МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова. - 1978. - 20 с.

1. Способ подготовки биологической ткани органа трупа для хемилюминесцентного анализа, включающий приготовление гомогената из ткани органа трупа, отличающийся тем, что для приготовления гомогената берут навеску ткани фрагмента органа массой 200 мг, которую помещают в фарфоровую ступку с кварцевым песком и гомогенизируют при комнатной температуре 25°С, в полученный гомогенат ткани добавляют 2 мл буфера: 0,05 М фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 3,4 г КН₂РO₄, 0,0186 г ЭДТА-Na, 50 мг КОН; затем центрифугируют гомогенат в течение 10 мин при 2,9 тыс об/мин, выполняют разведение гомогената для проведения хемилюминесцентного анализа.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гомогенат после центрифугирования хранят до проведения хемилюминесцентного анализа при температуре +4°С не более 1 ч.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что гомогенат из ткани печени перед проведением хемилюминесцентного анализа разводят в 80-160 раз, из ткани надпочечника в 20-160 раз, из ткани миокарда в 20-40 раз, из скелетной мышцы в 10-40 раз.