Способ лечения посттравматической энцефалопатии

Способ лечения посттравматической энцефалопатии

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и касается использования стволовых клеток пуповинной крови для лечения неврологических патологических состояний, в частности, посттравматической энцефалопатии.

Уровень техники

Стволовые клетки пуповинной крови представляют собой уникальную клеточную популяцию, отличающуюся от клеток, получаемых из других источников, в том числе эмбриональных, фетальных и «взрослых» стволовых клеток. Уникальность клеток пуповинной крови заключается в том, что это единственный тип клеток постнатального происхождения, способный при трансплантации экспериментальным животным поддерживать кроветворение и формировать полноценную иммунную систему человека, благодаря образованию В- и Т-лимфоцитов и дендритных клеток, формированию первичных и вторичных лимфоидных органов и продукции функциональных иммунных ответов [Traggai E, Chicha L, Mazzuchelli L, et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science 2004; 304: 14-107].

Гемопоэтические стволовые клетки (CD34+) и эндотелиальные клетки-предшественники (CD133+) являются наиболее представленными клеточными популяциями, найденными в пуповинной крови. Высокое содержание гемопоэтических клеток-предшественников позволяет эффективно использовать трансплантацию клеток пуповинной крови в качестве альтернативы трансплантации костного мозга при острых и хронических лейкозах, лимфомах, анемии Фанкони и других гематологических заболеваниях [Barker J. Umbilical cord blood (UCB) transplantation: An alternative to the use of unrelated volunteer donors? Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007: 55-61].

Помимо гемопоэтических в пуповинной крови содержатся и другие типы стволовых клеток, включая эмбрионально-подобные клетки, эпителиальные клетки-предшественники, мезенхимальные стволовые клетки и неограниченные соматические стволовые клетки [Harris David Т., Rogers I. Umbilical Cord Blood: A Unique Source of Pluripotent Stem Cells for Regenerative Medicine, Current Stem Cell Research & Therapy, 2007, 2, 301-309].

Плюрипотентные свойства стволовых клеток пуповинной крови продемонстрированы в целом ряде исследований in vitro и in vivo. В условиях культивирования стволовые клетки пуповинной крови способны дифференцироваться в остеобласты, хондробласты, адипоциты и нервные клетки, а также в эндотелиальные и мышечные клетки, гепатоциты и инсулин-продуцирующие клетки [Kogler, G., Sensken, S., & Wernet, P. (2006) Comparative generation and characterization of pluripotent unrestricted somatic stem cells with mesenchymal stem cells from human cord blood. Experimental Hematology, 34(11), 1589-95 и Tondreau Т, Meuleman N, Delforge A, et al. Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized blood and cord blood: proliferation, expression and plasticity. Stem Cells, 2005; 23: 1105-1112].

Стволовые клетки пуповинной крови обладают способностью к хоумингу и при трансплантации экспериментальным животным могут улучшать течение ряда заболеваний, включая диабет, сердечно-сосудистые и неврологические и офтальмологические заболевания, болезни опорно-двигательного аппарата и т.д.

Диабет 1 типа встречается в среднем у одного из 300 новорожденных и обнаруживается более чем у 8 млн взрослого населения России. Диабет 1 типа обусловлен иммунной деструкцией бета-клеток в панкреатических островках, ответственных за продукцию инсулина. Результатом является неконтролируемый уровень глюкозы в крови. Осложнения при диабете включают кардиомиопатию, поражения коронарных артерий и периферических сосудов, неврологические расстройства и т.д. При попытках лечения диабета 1 типа были разработаны хирургические методы по трансплантации поджелудочной железы или отдельных островков, имевшие ограниченный успех вследствие иммунного отторжения, отсутствия совместимых доноров и многочисленных осложнений. В этой связи особые надежды были возложены на использование клеточных технологий, основанных на применении стволовых клеток из различных источников и направленных на восстановление функции инсулин-продуцирущей ткани поджелудочной железы. В исследовании, проведенном Haller и соавт., были констатированы значительное улучшение в конролируемом уровне глюкозы и более продолжительная продукция инсулина по сравнению с другими детьми со сходным прогнозом в ответ на использование клеток пуповинной крови [Haller MJ, Cooper SC, Brusco T, et al. Autologous cord blood transfusion associated with prolonged honeymoon in a child with type 1 diabetes. Diabetes 2005; 53 (Suppl 1): Poster A485]. Протоколы клинических исследований были разработаны на основе данных, полученных на модели диабета 1 типа, согласно которым у опытных животных наблюдался пониженный уровень глюкозы и инсулина в крови и увеличенный период жизни по сравнению с контрольными животными [Ende N, Chen R, Reddi AS. Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulinitis in type 1 diabetic mice. Biochem Biophys Res Commun 2004; 325: 665-669 и Ende N, Chen R, Mack R. NOD/Ltf type I diabetes in mice and the effect of stem cells (Berashis) derived from human umbilical cord blood. J. Med 2002; 33: 181-187].

Хотя механизмы действия стволовых клеток пуповинной крови в лечении диабета неизвестны, предполагают, что при инфузии in vivo стволовые клетки дифференцируются в секретирующие инсулин клетки панкреатических островков [Haller MJ, Cooper SC, Brusco T, et al. Autologous cord blood transfusion associated with prolonged honeymoon in a child with type 1 diabetes. Diabetes 2005; 53 (Suppl 1): Poster A485], что было подтверждено в исследованиях in vitro [Sun В, Roh K-H, Lee S-R, Lee Y-S, Kang K-S. Induction of human umbilical cord blood-derived stem cells with embryonic stem cell phenotypes into insulin producing islet-like structures. Biochem Biophys Res Commun 2007, 354: 919-923].

Использование мононуклеарных клеток пуповинной крови в лечении хронического гепатита или цирроза печени описано в патенте RU 2295351.

Недостатком способа является обязательное HLA-типирование и, более того, для достижения клинического эффекта стволовые клетки пуповинной крови донора должны отличаться от клеток реципиента не менее чем по четырем антигенам из набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR.

Что касается возможности использования стволовых клеток пуповинной крови в репарации костной и хрящевой ткани, то, в отличие от стволовых клеток костного мозга, их потенциальная роль в ортопедии не исследована. Наиболее распространенными ортопедическими нарушениями являются повреждения суставов, включая повреждения хрящей, связок и/или сухожилий, а также переломы. Стволовые клетки пуповинной крови способны к дифференцировке в костные клетки in vitro при индукции ударной волной [Wang FS, Yang KD, Wang CJ, et al. Shockwave stimulates oxygen radical-mediated osteogenesis of the mesenchymal cells from human umbilical cord blood. J Bone Mineral Res 2004; 19: 973-979]. Возможность использования клеток пуповинной крови при переломах была продемонстрирована на моделях животных с переломами бедра. Также была показана способность этих клеток дифференцироваться в клетки хрящевой ткани [Szivek JA, Wiley D, Сох L, Harris D, Margolis DS, Grana WA. Stem cells grown in dynamic culture on micropatterned surfaces can be used to engineer cartilage-like tissue. Abstract, Orthopaedic Research Society meeting, San Diego, CA, 2006].

Способность стволовых клеток пуповинной крови давать начало эпителиальной ткани открывает возможность их клинического применения в регенеративной медицине при заболеваниях глаз (роговица), кожи (заживление ран) и других органов (например, легкие и пищеварительный тракт). Внешний слой глаза состоит из центральной роговицы, лимбуса и склеры. Эпителий роговицы способен к быстрой регенерации и может быть использован как собственный источник стволовых клеток при регенерации. Дефицит эпителиальных клеток роговицы является важной причиной потери зрения, происходящей от химического или термического поражения, синдрома Стивенса-Джонсона, рубцовых изменений, аниридии, хронической розацеи, кератоконъюнктивита. При нарушении эпителия роговицы четкое изображение не может быть сфокусировано на сетчатке глаза. Аутологичная трансплантация эпителиальных стволовых клеток роговицы была успешна у пациентов с односторонним заболеванием. Однако получение клеток из функционального здорового глаза создает риск потери зрения для здорового глаза. Дополнительно, в билатеральных условиях аутологичная трансплантация недоступна, а аллотрансплантация стволовых клеток роговичного эпителия требует иммуносупрессивной терапии с возможными системными побочными эффектами, в результате чего средняя продолжительность выживания такого аллотрансплантата не превышает 2 лет. Повреждения роговицы тяжелой степени, требующие вмешательства, не являются исключением, составляя до 37% всех случаев потери зрения [Germain L, Auger FA, Grandbois E, et al. Reconstructed human cornea produced in vitro by tissue engineering. Pathobiology 1999, 67: 140-147 и Germain L, Carrier P, Auger FA, Salesse C, Guerin S L. Can we produce a human corneal equivalent by tissue engineering? Prog Retinal Eye Res 2000; 19(5): 497-527].

Исследователи группы Николса [Harris DT, Не X, Camacho D, Gonzalez V, Nicols JC, The Potential of Cord Blood Stem Cells for Use in Tissue Engineering of the Eye, Stem Cells & Regenerative Medicine, Jan 23-25, 2006, San Francisco, Abstract и Nichols JC, He X, Harris DT. Differentiation of Cord Blood Stem Cells Into Corneal Epithelium. Invest Ophmalmol Vis Sci 2005; 46: E-Abstract 4772] использовали СD34-положительные стволовые клетки пуповинной крови как источник ткани для реконструкции поверхности глаза. Гистологические и иммуногистохимические исследования эпителия, образованного из клеток пуповинной крови, выявили, что слой дифференцированных клеток был морфологически не отличим от эпителия роговицы. Новообразованные клетки были также способны экспрессировать специфический маркер эпителия роговицы - цитокератин k3. При трансплантации стволовых клеток кроликам была восстановлена роговица с образованием оптически ясной поверхности. Способность стволовых клеток пуповинной крови дифференцироваться в эпителиальные клетки роговицы предполагает возможность их использования для ускорения заживления ран различной этиологии, например, диабетических язв. Согласно этой гипотезе, в 2004 г. было показано, что аллогенные стволовые клетки пуповинной крови способны инициировать восстановление раневых повреждений кожи [Valbonesi M, Giannini G, Migliori F, Dalla Costa R, Dejana AM. Cord blood (CB) stem cells for wound repair. Preliminary report of 2 cases. Transfus Apher Sci 2004; 30(2): 153-156]. Клетки-предшественники были смешаны с аутологичным фибриновым матриксом и в концентрации 3×10⁴ введены в область, прилежащую к повреждениям. Спустя 3-7 месяцев после инъекции наблюдалось значительное заживление повреждений кожи у обоих пациентов.

Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин смертности и нетрудоспособности населения. Клетки сердечной ткани имеют ограниченную способность к регенерации, и использование стволовых клеток могло бы быть эффективной заменой традиционных методов терапии.

На моделях животных получены данные, свидетельствующие о миграции стволовых клеток к поврежденной ткани миокарда, увеличении плотности капилляров в участке повреждения и улучшении функции сердца [Botta R, Gao E, Stassi G, et al. Heart infarct in NOD-SCID mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34+ cells ad low dose D34+KDR+ cells. FASEB J 2004; 18: 1392-1394; Henning RJ, Abu-Ali H, Balis JU, et al. Human umbilical cord blood mononuclear cells for treatment of acute myocardial infarction. Cell Transplant 2004; 13: 729-739; Chen HK, Hung HF, Shyu KG, et al. Combined cord blood cells and gene therapy enhances angiogenesis and improves cardiac performance in mouse after acute myocardial infarction. Eur J Clin Invest 2005; 35: 677-686; Hirata Y, Sata M, Motomura N, et al. Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun 2005; 327: 609-614; Kim ВО, Tian H, Prasongsukarn K, et al. Cell transplantation improves ventricular function after a myocardial infarction: a preclinical study of human unrestricted somatic stem cells in a porcine model. Circulation 2006; 112 (9 suppl): 196-204 и Leor J, Guetta E, Feinberg MS, et al. Human umbilical cord blood-derived CD133+ cells enhance function and repair of the infracted myocardium. Stem Cells 2006; 24(3): 772-780].

Gaballa с соавторами [Furfaro MEK, Gaballa MA. Do adult stem cells ameliorate the damaged myocardium? Is human cord blood a potential source of stem cells? Curr Vascular Pharm 2007; 5: 27-44] на модели инфаркта миокарда у крыс показали, что СВ34-положительные клетки пуповинной крови индуцируют формирование кровеносных сосудов, уменьшают размеры инфаркта, восстанавливают функцию сердца. Полагают, что эти эффекты обусловлены высвобождением ангиогенных факторов и факторов роста (например, VEGF, EGF, ангиопоэтин-1,2 и др.), индуцируемых гипоксией.

Способность плюрипотентных клеток пуповинной крови формировать кровеносные сосуды и восстанавливать миокард показана в исследованиях по восстановлению сердечной функции после инфаркта миокарда с использованием CD34+, CD133+/CD45-клеток на различных моделях у животных [Botta R, Gao E, Stassi G, et al. Heart infarct in NOD-SCID mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34+ cells ad low dose CD34+KDR+ cells. FASEB J 2004; 18: 1392-1394; Kim ВО, Tian H, Prasongsukarn K, et al. Cell transplantation improves ventricular function after a myocardial infarction: a preclinical study of human unrestricted somatic stem cells in a porcine model. Circulation 2006; 112 (9 suppl): 196-204; Leor J, Guetta E, Feinberg MS, et al. Human umbilical cord blood derived CD133+ cells enhance function and repair of the infracted myocardium. Stem Cells 2006; 24(3): 772-780 и Bonnano G, Mariotti A, Procoli A, et al. Human cord blood CD133+ cells imunoselected by a clinical-grade apparatus differentiate in vitro into endothelial- and cardiomyocyte-like cells. Transfusion 2007; 47: 280-289].

Цереброваскулярные заболевания находятся на одном из первых мест по причине смертности, не включая индивидуумов, выживших после инсульта, но с последствиями, проявляющимися в течение оставшегося периода жизни.

Церебральная ишемия является наиболее превалирующей причиной инсультов. В относительно молодом возрасте вследствие пластичности мозга достаточно большая часть мозга может быть удалена (в случае опухолей или гемисферектомии при серьезных повреждениях) без неврологических повреждений или с незначительным периодом восстановления. Эти данные предполагают, что чем моложе нервные клетки, которые могли бы быть продуцированы путем дифференциации из стволовых клеток, тем больше возможность регенерации поврежденного мозга.

В течение всей жизни человека постоянно существует риск неврологических заболеваний и травм. Так, высока частота встречаемости церебрального паралича у новорожденных. От повреждений спинного мозга страдают как дети, так и взрослые. Риск эмболических и геморрагических инсультов увеличивается среди индивидуумов, достигших 40 лет. И, наконец, после 40 лет и в пожилом возрасте высока частота нейродегенеративных заболеваний, как, например, болезнь Паркинсона [Harris, D.Т., Badowski, M., Ahmad, N., & Gaballa, M. (2008). The potential of cord blood stem cells for use in regenerative medicine. Expert Opinion on iological Therapy, 7(9), 1311-1322 и Harris, D.Т., & Rogers, I. (2007). Umbilical cord blood: a unique source of pluripotent stem cells for regenerative medicine. Current Stem Cell Research & Therapy, 2, 301-309]. Традиционные методы терапии, применяемые относительно неврологических заболеваний и травм, неэффективны, что ложится бременем на общество. Использование стволовых клеток в случае неврологических заболеваний или травм открыло бы возможности замещения или регенерации поврежденных тканей спинного или головного мозга. Тем не менее успех зависит от выбора источника стволовых клеток и соответствующего их применения.

В отличие от многих других патологических состояний, которые были оценены на возможность терапии стволовыми клетками пуповинной крови, восстановление неврологических повреждений имеет намного более сложную этиологию.

Однако на моделях животных для инсульта, бокового амиотрофического склероза, болезни Паркинсона, церебрального паралича и повреждений спинного мозга инфузия стволовых клеток пуповинной крови приводила к заметному улучшению поведения по сравнению с контрольными животными. Тот же эффект наблюдался у животных с неврологическими повреждениями, обусловленными травмами мозга [Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32:2682-2688; Willing AE, Lixian J, Milliken M, et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J Neurosci Res 2003; 73(3): 296-307; Borlongan CV, Hadman M, Sanberg CD, Sanberg PR. Central Nervous System Entry of Peripherally Injected Umbilical Cord Blood Cells Is Not Required for Neuroprotection in Stroke. Stroke 2004; 35: 2385-2389; Newman MB, Willing AE, Manressa JJ, Sanberg CD, Sanberg PR. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair. Exp Neurol 2006, 199(1): 201-208; Vendrame M, Cassady J, Newcomb J, et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume. Stroke 2004; 35: 2390-2395; Xiao J, Nan Z, Motooka Y, Low WC. Transplantation of a novel cell line population of umbilical cord blood stem cells ameliorates neurological deficits associated with ischemic brain injury. Stem Cells Dev 2005; 14: 722-733; Newcomb JD, Ajrno CT, Sanberg CD, et al. Timing of Cord Blood Treatment After Experimental Stroke Determines Therapeutic Efficacy. Cell Transplant 2006; 15: 213-223; Nan Z, Grande A, Sanberg CD, Sanberg PR, Low WC. Infusion of Human Umbilical Cord Blood Ameliorates Neurologic Deficits in Rats with Hemorrhagic Brain Injury. Ann NY Acad Sci 2005,1049(1): 84-96; Bliss T, Guzman R, Daadi M, Steinberg GK. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke 2007; 38: 817-826; Saporta S, Kim JJ, Willing AE, et al. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 271-278; Kuh SU, Cho YE, Yoon DH, et al. Functional recovery after human umbilical cord blood cells transplantation with brain derivedneurotropic factor into the spinal cord injured rats. Acta Neurochir (Wein) 2005; 14: 985-992; Kang KS, Kim SW, Oh YH, et al. Thirty-seven-year old spinal cord-injured female patient, transplanted of multipotent stem cells from human UC blood with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: A case study. Cytotherapy 2005; 7: 368-373; Lu D, Sanberg PR, Mahmood A, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury Cell Transplant 2002; 11: 275-281; Meier C. Middleanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Ped Res 2006; 59: 244-249; Ende N, Chen R. Parkinson's Disease Mice and Human Umbilical Cord Blood. J Med 2002; 33: 173-80; Gaebuzova-Davis S, Willing AE, Zigova T, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 255-270].

Jang et al. [Jang YK, Park JJ, Lee MC, et al. Retinoic acid-mediated induction of neurons and glial cells from human umbilical cord-derived hematopoietic stem cells. J Neurosci Res 2004; 75: 573-584] продемонстрировали, что CD133+ стволовые клетки пуповинной крови при воздействии ретиноевой кислоты дифференцируются в нервные (астроциты и олигодендроциты) и глиальные клетки с нейромаркерами, включая тубулин, нейроспецифическую энолазу, NeuN, ассоциированный с микротубулином белок-2 (МАР2) и кислый глиальный фибриллярный белок (GFAP), являющийся астроцитоспецифичным маркером.

Более того, негемопоэтические стволовые клетки, найденные в пуповинной крови, способны дифференцироваться в астроциты и олигодендроциты [Buzanska L, Jurga M, Stachowiak EK, Stachowiak MK, Domanska-Janik К. Neural stem-like cell line derived from a nonhematopoietic population of human umbilical cord blood. Stem Cells Develop 2006; 15: 391-406]. Таким образом, потомки негемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови также могли бы быть полезны для использования в лечении повреждений мозга и неврологических расстройств.

На модели повреждений спинного мозга у крыс инфузия стволовых клеток пуповинной крови приводила к значительным улучшением на 5-й день после инфузии по сравнению с контрольными животными. Стволовые клетки выявлялись в областях повреждений нервной ткани, но не обнаруживались в неповрежденных областях спинного мозга [Saporta S, Kim JJ, Willing AE, et al. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 271-278]. Эти данные дополняют результаты исследований о способности клеток пуповинной крови, трансплантированных в спинной мозг животных с травмами, дифференцироваться в нервные клетки различного типа, улучшая регенерацию аксонов и моторную функцию [Kang KS, Kim SW, Oh YH, et al. Thirty-seven-year old spinal cord-injured female patient, transplanted of multipotent stem cells from human UC blood with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: A case study. Cytotherapy 2005; 7: 368-373].

В 2001 г. на наиболее распространенной модели инсульта (медиальная закупорка сонной артерии) было продемонстрировано, что инфузия крысам клеток пуповинной крови может улучшить различные физические и поведенческие дефицитные состояния, связанные с болезнью [Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32: 2682-2688].

Исследования демонстрируют, что прямая инъекция стволовых клеток в мозг не требуется [Willing AE, Lixian J, Milliken M, et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J Neurosci Res 2003; 73(3): 296-307], и фактически, положительные эффекты можно наблюдать, даже если стволовые клетки не достигают органа-мишени (вероятно, через высвобождение факторов роста и репарации, запускаемое путем аноксии) [Borlongan CV, Hadman M, Sanberg CD, Sanberg PR. Central Nervous System Entry of Peripherally Injected Umbilical Cord Blood Cells Is Not Required for Neuroprotection in Stroke. Stroke 2004; 35: 2385-2389 и Newman MB, Willing AE, Manressa JJ, Sanberg CD, Sanberg PR. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair. Exp Neurol 2006; 199(1): 201-208].

Является значительным, что в отличие от использования фармацевтических препаратов, для которых требуется применение в первые несколько часов после инсульта, терапия стволовыми клетками пуповинной крови эффективна до 48 часов после тромботического инцидента [Newcomb JD, Ajrno CT, Sanberg CD, et al. Timing of Cord Blood Treatment After Experimental Stroke Determines Therapeutic Efficacy. Cell Transplant 2006; 15: 213-223]. Преимущества терапии клетками пуповинной крови также показаны на модели геморрагического инсульта [Nan Z, Grande A, Sanberg CD, Sanberg PR, Low WC. Infusion of Human Umbilical Cord Blood Ameliorates Neurologic Deficits in Rats with Hemorrhagic Brain Injury. Ann NY Acad Sci 2005; 1049(1): 84-96].

Были предприняты попытки использовать эмбриональные стволовые клетки и взрослые стволовые клетки костного мозга при ишемических инсультах и паркинсонизме в клинических исследованиях. Так, были предложены способы лечения ишемического инсульта и паркинсонизма с использованием предварительно размноженных в культуре нейрональных стволовых клеток, полученных из ткани переднего мозга или перивентрикулярной области головного мозга абортированных эмбрионов человека (патенты RU 2258521 и RU 2259836). Однако возможность использования эмбриональных стволовых клеток и стволовых клеток костного мозга в терапии ограничена ввиду существенных недостатков.

Использование фетальных стволовых клеток связано с этическими проблемами, трудностями культивирования клеток и сопряжено с высоким риском контаминации материала бактериальной и/или вирусной микрофлорой. При введении фетальных стволовых клеток путем инфузии без долговременных и дорогостоящих этапов культивирования и дифференциации in vitro возможна злокачественная трансформация эмбриональных клеток, наиболее общей угрозой является образование тератомы. Нежелательной является и длительная иммуносупрессия, которая необходима при использовании эмбриональных клеток из-за угрозы иммунного отторжения. Существенным недостатком способов лечения ишемических инсультов и паркинсонизма, описанных в патентах RU 2258521 и RU 2259836, является и эндолюмбальный способ трансплантации.

Кроме того, пациенты, страдающие от инфаркта миокарда или инсульта, нуждаются в лечении уже в течение нескольких дней, если не часов, а получение необходимых культур фетальных клеток требует длительного времени.

Способ лечения инсульта на основе трансплантации стволовых клеток костного мозга описан в патенте RU 2283121. Существенным недостатком способа является нейрохирургическое вмешательство: интрацеребральное стереотаксическое введение стволовых клеток под нейронавигационным контролем в область поражения функционально важных структур (в зависимости от клинических проявлений). При выявлении дефицита перфузии вещества головного мозга эта операция дополняется наложением экстра-иптракраниального микроанастомоза.

Хотя костный мозг является источником гемопоэтических, мезенхимальных и эндотелиальных стволовых клеток, большинство стволовых клеток костного мозга получают от взрослых доноров, что ограничивает их пластичность. Клетки пуповинной крови, полученные при рождении, являются уникальным источником плюрипотентных стволовых клеток [Atala et al. Umbilical Cord Blood Current Stem Cell Research & Therapy, 2007, Vol.2, No. 4307]. Более того, клетки пуповинной крови не подвергаются индуцированным окружающей средой эпигенетическим воздействиям.

Использование мононуклеарных клеток пуповинной крови в лечении ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, ишемии мозга, вызванной атеросклерозом или острым нарушением мозгового кровообращения, описано в патенте RU 2284190. Недостатком способа является обязательное HLA-типирование и, более того, для достижения клинического эффекта при ишемических состояниях стволовые клетки пуповинной крови донора должны отличаться от клеток реципиента не менее чем по четырем антигенам из набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR.

Помимо инсультов на моделях животных показана возможность использования стволовых клеток пуповинной крови в лечении других форм неврологических повреждений. Среди них [Lu et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury. Cell Transplant 2002; 11: 275-281], на модели крыс было показано, что внутривенное введение мононуклеарных клеток пуповины могло бы быть полезно для лечения травматических повреждений мозга. Причем было продемонстрировано, что клетки пуповинной крови достигают мозга, селективно мигрируют к поврежденной области мозга, экспрессируют нейромаркеры и уменьшают неврологическое повреждение.

Сходно, трансплантация стволовых клеток пуповинной крови также могла облегчить симптомы церебрального паралича у новорожденных на модели крыс [Meier С, Middleanis J, Wasielewski В, et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Ped Res 2006; 59: 244-249].

Регенеративная терапия с использованием стволовых клеток пуповинной крови, фокусируясь на функциональном восстановлении поврежденных тканей, особенно актуальна при травматических повреждениях мозга. С одной стороны, частота черепно-мозговых травм является достаточно высокой (черепно-мозговая травма регистрируется у 4 человек из 1000 населения), с другой стороны, у больных, перенесших черепно-мозговую травму средней степени тяжести, нередко, даже спустя длительное время, сохраняются признаки посттравматического психоорганического синдрома, астенизация, головные боли, вегето-сосудистая дисфункция, нарушения статики, координации и другая неврологическая симптоматика (Лихтерман Л.Б., Фраерман А.П., Хитрин Л.Х., 1979 г. Фазность клинического течения черепно-мозговой травмы, Горький, 1979, с.168-178; Е.Н.Клигуненко, Л.А.Дзяк, В.И.Гришин, О.А.Зозуля, 2004 г.; Дмитриева А.С., Клименко Т.В., 1998 г.)

В основе всех проблем психического и неврологического дефицита при посттравматических заболеваниях головного мозга лежит нарушение работы нейронов головного мозга. Динамичности и пластичности нервной системы не хватает для полного самовосстановления. К сожалению, в клинике в настоящее время еще нет эффективных методов для решения этой задачи. В свете сказанного использование стволовых клеток с целью усиления регенерации нервной ткани, стимуляции биологической активности поврежденных нейронов может оказаться весьма плодотворным.

Однако клинических исследований эффективности терапии стволовыми клетками пуповинной крови последствий черепно-мозговых травм не проведено. При этом следует отметить, что экспериментальная модель черепно-мозговой травмы у животных может значительно отличаться от реальной клинической ситуации, которая приводит к более выраженным повреждениям головного мозга.

Так как стволовые клетки пуповинной крови являются по происхождению аллогенными, при проведении клинических исследований важно определить, произойдет ли иммунное отторжение или возникнут другие проблемы, опосредованные иммунитетом, которые могли бы подвергнуть опасности раннее улучшение.

Известен способ лечения бокового амиотрофического склероза и множественного склероза путем введения в кровь ядросодержащих клеток пуповинной крови в количестве не менее 5×10⁹ (WO 2004/071283).

При осуществлении способа, описанного в WO 2004/071283, не требуется предварительного подавления иммунного ответа или HLA-типирования донора и реципиента, однако для его осуществления необходимы чрезвычайно большие количества клеток. Количество ядросодержащих клеток в одной порции пуповинной крови не превышает 2,8×10⁹. Этого количества недостаточно для осуществления способа. Таким образом, требуется не только одномоментное введение в организм аллогенных клеток, но и клеток от нескольких разных доноров. При этом резко возрастает риск аллергических, в том числе анафилактических реакций, а также риск развития других иммунопатологических состояний, включая иммунодепрессию.

Кроме того, одновременная иммунизация клетками различных доноров приводит к невозможности повторного применения способа у того же больного. Применение способа в 5 случаях из 10 привела к токсическим и аллергическим реакциям с развитием у всех больных иммуносупрессии в течение 7-30 дней после введения. Попытка повторного применения способа приводила к токсико-аллергической реакции у большинства пациентов.

Раскрытие изобретения

Авторами настоящего изобретения впервые предложен способ лечения посттравматической энцефалопатии путем внутривенной инфузии ядросодержащих клеток пуповинной крови человека без риска возникновения иммунопатологических состояний, не требующий HLA-типирования, и без ограничений повторного применения способа в случае клинических показаний.

Настоящее изобретение обеспечивает способ лечения посттравматической энцефалопатии, предусматривающий введение пациенту ядросодержащих клеток пуповинной крови в терапевтически эффективном количестве, которое, в зависимости от веса пациента и клинической картины, составляет от 1×10⁸ до 5×10⁸ и, предпочтительно, от около 2,2×10⁸ до около 2,8×10⁸ ядросодержащих клеток на одно введение. Таким образом, эффективное количество ядросодержащих клеток в соответствии с предложенным способом, по крайней мере, на порядок меньше, чем требуемое количество ядросодержащих клеток пуповинной крови согласно способу лечения бокового амиотрофического склероза и множественного склероза, раскрытого в публикации WO 2004/071283.

Более того, неожиданным открытием авторов настоящего изобретения оказалось, что заявленный способ высокоэффективен при однократном введении пациентам клеток пуповинной крови. В специфическом варианте воплощения способа предусматривается повторное введение препарата, что, например, значительно превышает эффективность способа лечения ишемии мозга, вызванной атеросклерозом или острым нарушением мозгового кровообращения, описанного в патенте RU 2284190, согласно которому предусматривается повторное введение пациентам мононуклеарных клеток пуповинной крови до 10 раз.

В одном из аспектов изобретения способ применяется для лечения пациентов, перенесших черепно-мозговую травму средней степени тяжести, последствия которой могут включать посттравматический психоорганический синдром, астенизацию, головные боли, вегето-сосудистую дисфункцию, нарушения статики, координации и другую неврологическую симптоматику.

Другой аспект изобретения касается использования ядросодержащих клеток пуповинной крови при травмах мозга тяжелой степени, последствиями которых, в частности, являются психические расстройства, эпилептические припадки, грубые двигательные и речевые нарушения.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что ядросодержащие клетки пуповинной крови могут быть введены пациентам с посттравматической энцефалопатией без риска возникновения иммунного отторжения и приводить к значительному улучшению симптомов последствий черепно-мозговых травм.

Предложенный способ лечения посттравматической энцефалопатии предусматривает введение пациенту путем внутривенной инфузии ядросодержащих клеток пуповинной крови. Количество вводимых клеток составляет от 1×10⁸ до 5×10⁸ и, предпочтительно, от около 2,2×10⁸ до около 2,8×10⁸ ядросодержащих клеток на одно введение.

В одном из вариантов изобретения осуществляют одноразовое введение препарата пациенту.

В другом варианте осуществления изобретения введение ядросодержащих клеток пуповинной крови осуществляют повторно с интервалом 1-4 недель в количестве от 1×10⁸ до 5×10⁸ и, предпочтительно, от около 2,2×10⁸ до около 2,8×10⁸ ядросодержащих клеток на одно введение.

Для получения препарата клеток пуповинной крови для использования согласно способу образцы пуповинной крови подвергают седиментации или градиентному центрифугированию, отбирая ядросодержащие клетки с последующим ресуспендированием в охлажденной плазме с добавлением диметилсульфоксида. Полученный материал распределяют в криопробирки, подвергают программному замораживанию, после чего переносят в карантинный сосуд Дюара в пары жидкого азота. По истечении карантинного срока хранения при условии отрицательных результатов тестирования на гемотрансмиссивные инфекции и посева в аэробных/анаэробных условиях образцы переносят на постоянное хранение в сосуд Дюара с жидким азотом.

Используемая технология получения концентрата стволовых клеток пуповинной крови является стабильно воспроизводимой и высокоэффективной, позволяющей обеспечить высокую жизнеспособность клеток как сразу после выделения, так и после замораживания и последующего оттаивания.

Препарат представляет собой стерильную суспензию отмытых от криопротектора живых ядросодержащих клеток пуповинной крови человека в количестве не менее 100 млн в 100 мл физиологического раствора с добавлением реополиглюкина и человеческого сывороточного альбумина и предназначен для внутривенной инфузии через систему для переливания крови и кровезаменяющих растворов (капельницу), а также струйным способом.

В одном специфическом варианте осуществления способа используют ядросодержащие клетки пуповинной крови, отмытые от криопротектора.

В другом специфическом варианте осуществления способа используют ядросодержащие клетки пуповинной крови без отмывки от криопротектора.

Посттравматическая энцефалопатия в основном является последствием черепно-мозговых травм средней и тяжелой степени.

При черепно-мозговой травме легкой степени тяжести прогноз, как правило, благоприятный при соблюдении одних только режимных требований и лечебных рекомендаций. Практически полное выздоровление наступает через 2-3 недели после получения травмы, и в дальнейшем такие больные не нуждаются в наблюдении и лечении. При сотрясениях головного мозга, приводящих к черепно-мозговой травме легкой степени тяжести, данные магнитно-резонансной томографии (МРТ) не выявляют какой-либо паренхиматозной очаговой патологии. Компьютерная томография у больных не обнаруживает травматических отклонений в состоянии вещества мозга и ликворосодержащих внутричерепных пространств, но может быть выявлена зона пониженной плотности в веществе мозга, соответствующая отеку мозга (Корниенко В.Н., Васин Н.Я., Кузьменко В.А. Компьютерная томография в диагностике черепно-мозговой травмы. М.: "Медицина", 1987; Корниенко В.Н., Лихтерман Л.Б., Кузьменко В.А., Туркин A.M. Компьютерная томография. В книге: Черепно-мозговая травма. Клиническое руководство, Москва: "Антидор", 1998, Т.1, с.472-495). Отек может быть локальным, долевым или полушарным и проявляется умеренным объемным эффектом в виде сужения ликворных пространств. Эти изменения, обнаруживаемые в первые часы после травмы, обычно достигают максимума на 3-и сутки и исчезают через 2 недели. Таким образом, морфологические изменения в этом случае носят обратимый характер, и за восстановлением морфологии следует полное клиническое выздоровление.

У больных, перенесших черепно-мозговую травму средней степени тяжести, нередко, даже спустя длительное время, сохраняются признаки посттравматического психоорганического синдрома, астенизация, головные боли, вегето-сосудистая дисфункция, нарушения статики, координации и другая неврологическая симптоматика (Актуальные вопросы нейротравматологии, под ред. А.Н.Коновалова, М.). Эти расстройства значительно ухудшают качество жизни, затрудняют социально-трудовую адаптацию, заставляют пациентов повторно обращаться к врачу. Но, как правило, врачебные рекомендации ограничиваются общеукрепляющей терапией, которая дает лишь временный эффект.

При ушибах головного мозга, приводящих к черепно-мозговой травме средней степени тяжести, всегда имеется участок анатомической деструкции мозга (контузионный очаг). Нарушение целостности мозговой ткани может распространяться и только на кору, и на кору и подкорковые структуры и сопровождается различной степенью выраженности кровоизлияниями в размозженные участки ткани мозга (Зотов Ю.В., Щедренок В.В. Хирургия травматических внутричерепных гематом и очагов размозжений головного мозга. Л. 1984; Зотов Ю.В., Касумов Р.Д., Исмаил Тауфик. Очаги размозжения головного мозга. С.-Петербург, 1996, с.252). Картина компьютерной томографии при ушибе головного мозга средней степени тяжести в большинстве наблюдений представлена очаговыми изменениями в виде мелких кровоизлияний в зоне ушиба, умеренным геморрагическим пропитыванием ткани мозга без грубой ее деструкции. Через 3-4 месяца зона поражения замещается глиальным или глиомезодермальным рубцом (Лихтерман Л.Б., Фраерман А.П., Хитрин Л.Х. Фазность клинического течения черепно-мозговой травмы. Горький, 1979, с.168-178).

В одном из вариантов осуществления предложенный способ терапии клетками пуповинной крови направлен на лечение поражений головного мозга, причиной которых являются ушибы головного мозга средней степени тяжести. Клиническая картина острого периода ушиба головного мозга средней степени тяжести (первые 4-5 недель) характеризуется выключением сознания после травмы продолжительностью не более двух часов. Возможны преходящие расстройства жизненно важных функций: брадикардия или тахикардия, повышение АД, тахипноэ, субфебрилитет. Часто выявляются оболочеч