Способ лечения психических и неврологических расстройств

Способ лечения психических и неврологических расстройств

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и касается использования клеток пуповинной крови для лечения психических и неврологических расстройств.

Уровень техники

Стволовые клетки пуповинной крови представляют собой уникальную клеточную популяцию, отличающуюся от клеток, получаемых из других источников, в том числе эмбриональных, фетальных и «взрослых» стволовых клеток. Уникальность клеток пуповинной крови заключается в том, что это единственный тип клеток постнатального происхождения, способный при трансплантации экспериментальным животным поддерживать кроветворение и формировать полноценную иммунную систему человека, благодаря образованию В- и Т-лимфоцитов и дендритных клеток, формированию первичных и вторичных лимфоидных органов и продукции функциональных иммунных ответов [Traggai Е, Chicha L, Mazzuchelli L, et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science 2004; 304: 14-107].

Гемопоэтические стволовые клетки (CD34+) и эндотелиальные клетки-предшественники (CD 133+) являются наиболее представленными клеточными популяциями, найденными в пуповинной крови. Высокое содержание гемопоэтических клеток-предшественников позволяет эффективно использовать трансплантацию клеток пуповинной крови в качестве альтернативы трансплантации костного мозга при острых и хронических лейкозах, лимфомах, анемии Фанкони и других гематологических заболеваниях [Barker J. Umbilical cord blood (UCB) transplantation: An alternative to the use of unrelated volunteer donors? Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007: 55-61].

Помимо гемопоэтических, в пуповинной крови содержатся и другие типы стволовых клеток, включая эмбрионально-подобные клетки, эпителиальные клетки-предшественники, мезенхимальные стволовые клетки и неограниченные соматические стволовые клетки [Harris David Т., Rogers I. Umbilical Cord Blood: A Unique Source of Pluripotent Stem Cells for Regenerative Medicine, Current Stem Cell Research & Therapy, 2007, 2, 301-309].

Плюрипотентные свойства стволовых клеток пуповинной крови продемонстрированы в целом ряде исследований in vitro и in vivo. В условиях культивирования стволовые клетки пуповинной крови способны дифференцироваться в остеобласты, хондробласты, адипоциты и нервные клетки, а также в эндотелиальные и мышечные клетки, гепатоциты и инсулин-продуцирующие клетки [Kogler, G., Sensken, S., & Wernet, P. (2006) Comparative generation and characterization of pluripotent unrestricted somatic stem cells with mesenchymal stem cells from human cord blood. Experimental Hematology, 34(11), 1589-95 и Tondreau T, Meuleman N, Delforge A, et al. Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized blood and cord blood: proliferation, expression and plasticity. Stem Cells, 2005; 23: 1105-1112].

Стволовые клетки пуповинной крови обладают способностью к хоумингу и при трансплантации экспериментальным животным могут улучшать течение ряда заболеваний, включая диабет, сердечно-сосудистые, и неврологические, и офтальмологические заболевания, болезни опорно-двигательного аппарата и т.д.

Диабет 1 типа встречается в среднем у одного из 300 новорожденных и обнаруживается более чем у 8 млн взрослого населения России. Диабет 1 типа обусловлен иммунной деструкцией бета-клеток в панкреатических островках, ответственных за продукцию инсулина. Результатом является неконтролируемый уровень глюкозы в крови. Осложнения при диабете включают кардиомиопатию, поражения коронарных артерий и периферических сосудов, неврологические расстройства и т.д. При попытках лечения диабета 1 типа были разработаны хирургические методы по трансплантации поджелудочной железы или отдельных островков, имевшие ограниченный успех вследствие иммунного отторжения, отсутствия совместимых доноров и многочисленных осложнений. В этой связи, особые надежды были возложены на использование клеточных технологий, основанных на применении стволовых клеток из различных источников и направленных на восстановление функции инсулин-продуцирующей ткани поджелудочной железы. В исследовании, проведенном Haller и соавт., было констатировано значительное улучшение в конролируемом уровне глюкозы и более продолжительная продукция инсулина по сравнению с другими детьми со сходным прогнозом в ответ на использование клеток пуповинной крови [Haller MJ, Cooper SC, Brusco T, et al. Autologous cord blood transfusion associated with prolonged honeymoon in a child with type 1 diabetes. Diabetes 2005; 53 (Suppl 1): Poster А485]. Протоколы клинических исследований были разработаны на основе данных, полученных на модели диабета 1 типа, согласно которым у опытных животных наблюдался пониженный уровень глюкозы и инсулина в крови и увеличенный период жизни по сравнению с контрольными животными [Ende N, Chen R, Reddi AS. Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulinitis in type 1 diabetic mice. Biochem Biophys Res Commun 2004; 325: 665-669 и Ende N, Chen R, Mack R. NOD/LtJ type I diabetes in mice and the effect of stem cells (Berashis) derived from human umbilical cord blood. J. Med 2002; 33: 181-187].

Хотя механизмы действия стволовых клеток пуповинной крови в лечении диабета неизвестны, предполагают, что при инфузии in vivo стволовые клетки дифференцируются в секретирующие инсулин клетки панкреатических островков [Haller MJ, Cooper SC, Brusco T, et al. Autologous cord blood transfusion associated with prolonged honeymoon in a child with type 1 diabetes. Diabetes 2005; 53 (Suppl 1): Poster A485], что было подтверждено в исследованиях in vitro [Sun В, Roh K-H, Lee S-R, Lee Y-S, Kang K-S. Induction of human umbilical cord blood-derived stem cells with embryonic stem cell phenotypes into insulin producing islet-like structures. Biochem Biophys Res Commun 2007, 354: 919-923].

Использование мононуклеарных клеток пуповинной крови в лечении хронического гепатита или цирроза печени описано в патенте RU 2 295 351. Недостатком способа является обязательное HLA-типирование и, более того, для достижения клинического эффекта стволовые клетки пуповинной крови донора должны отличаться от клеток реципиента не менее чем по четырем антигенам из набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR.

Что касается возможности использования стволовых клеток пуповинной крови в репарации костной и хрящевой ткани, то, в отличие от стволовых клеток костного мозга, их потенциальная роль в ортопедии не исследована. Наиболее распространенными ортопедическими нарушениями являются повреждения суставов, включая повреждения хрящей, связок и/или сухожилий, а также переломы. Стволовые клетки пуповинной крови способны к дифференцировке в костные клетки in vitro при индукции ударной волной [Wang FS, Yang KD, Wang СJ, et al. Shockwave stimulates oxygen radical-mediated osteogenesis of the mesenchymal cells from human umbilical cord blood. J Bone Mineral Res 2004; 19: 973-979]. Возможность использования клеток пуповинной крови при переломах была продемонстрирована на моделях животных с переломами бедра. Также была показана способность этих клеток дифференцироваться в клетки хрящевой ткани [Szivek JA, Wiley D, Сох L, Harris D, Margolis DS, Grana WA. Stem cells grown in dynamic culture on micropatterned surfaces can be used to engineer cartilage-like tissue. Abstract, Orthopaedic Research Society meeting, San Diego, CA, 2006].

Способность стволовых клеток пуповинной крови давать начало эпителиальной ткани открывает возможность их клинического применения в регенеративной медицине при заболеваниях глаз (роговица), кожи (заживление ран) и других органов (например, легкие и пищеварительный тракт). Внешний слой глаза состоит из центральной роговицы, лимбуса и склеры. Эпителий роговицы способен к быстрой регенерации и может быть использован как собственный источник стволовых клеток при регенерации. Дефицит эпителиальных клеток роговицы является важной причиной потери зрения, происходящей от химического или термического поражения, синдрома Стивенса-Джонсона, рубцовых изменений, аниридии, хронической розацеи, кератоконъюнктивита. При нарушении эпителия роговицы четкое изображение не может быть сфокусировано на сетчатке глаза. Аутологичная трансплантация эпителиальных стволовых клеток роговицы была успешна у пациентов с односторонним заболеванием. Однако получение клеток из функционального здорового глаза создает риск потери зрения для здорового глаза. Дополнительно, в билатеральных условиях аутологичная трансплантация недоступна, а аллотрансплантация стволовых клеток роговичного эпителия требует иммуносупрессивной терапии с возможными системными побочными эффектами, в результате чего средняя продолжительность выживания такого аллотрансплантата не превышает 2 лет. Повреждения роговицы тяжелой степени, требующие вмешательства, не являются исключением, составляя до 37% всех случаев потери зрения [Germain L, Auger FA, Grandbois E, et al. Reconstructed human cornea produced in vitro by tissue engineering. Pathobiology 1999, 67: 140-147 и Germain L, Carrier P, Auger FA, Salesse C, Guerin S L. Can we produce a human corneal equivalent by tissue engineering? Prog Retinal Eye Res 2000; 19(5): 497-527].

Исследователи группы Николса [Harris DT, He X, Camacho D, Gonzalez V, Nichols JC. The Potential of Cord Blood Stem Cells for Use in Tissue Engineering of the Eye, Stem Cells & Regenerative Medicine, Jan 23-25, 2006, San Francisco, Abstract и Nichols JC, He X, Harris DT. Differentiation of Cord Blood Stem Cells Into Corneal Epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci 2005; 46: E-Abstract 4772] использовали СD34-положительные стволовые клетки пуповинной крови как источник ткани для реконструкции поверхности глаза. Гистологические и иммуногистохимические исследования эпителия, образованного из клеток пуповинной крови, выявили, что слой дифференцированных клеток был морфологически неотличим от эпителия роговицы. Новообразованные клетки были также способны экспрессировать специфический маркер эпителия роговицы - цитокератин k3. При трансплантации стволовых клеток кроликам была восстановлена роговица с образованием оптически ясной поверхности. Способность стволовых клеток пуповинной крови дифференцироваться в эпителиальные клетки роговицы предполагает возможность их использования для ускорения заживления ран различной этиологии, например диабетических язв. Согласно этой гипотезе, в 2004 г. было показано, что аллогенные стволовые клетки пуповинной крови способны инициировать восстановление раневых повреждений кожи [Valbonesi М, Giannini G, Migliori F, Dalla Costa R, Dejana AM. Cord blood (CB) stem cells for wound repair. Preliminary report of 2 cases. Transfus Apher Sci 2004; 30(2): 153-156]. Клетки-предшественники были смешаны с аутологичным фибриновым матриксом и в концентрации 3x10⁴ введены в область, прилежащую к повреждениям. Спустя 3-7 месяцев после инъекции наблюдалось значительное заживление повреждений кожи у обоих пациентов.

Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин смертности и нетрудоспособности населения. Клетки сердечной ткани имеют ограниченную способность к регенерации, и использование стволовых клеток могло бы быть эффективной заменой традиоционных методов терапии.

На моделях животных получены данные, свидетельствующие о миграции стволовых клеток к поврежденной ткани миокарда, увеличении плотности капилляров в участке повреждения и улучшении функции сердца [Botta R, Gao Е, Stassi G, et al. Heart infarct in NOD-SCID mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34+cells ad low dose D34+KDR+cells. FASEB J 2004; 18: 1392-1394; Henning RJ, Abu-Ali H, Balis JU, et al. Human umbilical cord blood mononuclear cells for treatment of acute myocardial infarction. Cell Transplant 2004; 13: 729-739; Chen HK, Hung HF, Shyu KG, et al. Combined cord blood cells and gene therapy enhances angiogenesis and improves cardiac performance in mouse after acute myocardial infarction. Eur J Clin Invest 2005; 35: 677-686; Hirata Y, Sata M, Motomura N, et al. Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun 2005; 327: 609-614; Kim BO, Tian H, Prasongsukarn K, et al. Cell transplantation improves ventricular function after a myocardial infarction: a preclinical study of human unrestricted somatic stem cells in a porcine model. Circulation 2006; 112 (9 suppl): 196-204 и Leor J, Guetta E, Feinberg MS, et al. Human umbilical cord blood-derived CD133+cells enhance function and repair of the infracted myocardium. Stem Cells 2006; 24(3): 772-780].

Gaballa с соавторами [Furfaro MEK, Gaballa MA. Do adult stem cells ameliorate the damaged myocardium? Is human cord blood a potential source of stem cells? Curr Vascular Pharm 2007; 5: 27-44] на модели инфаркта миокарда у крыс показали, что СD34-положительные клетки пуповинной крови индуцируют формирование кровеносных сосудов, уменьшают размеры инфаркта, восстанавливают функцию сердца. Полагают, что эти эффекты обусловлены высвобождением ангиогенных факторов и факторов роста (например, VEGF, EGF, ангиопоэтин-1, 2 и др.), индуцируемых гипоксией.

Способность плюрипотентных клеток пуповинной крови формировать кровеносные сосуды и восстанавливать миокард показана в исследованиях по восстановлению сердечной функции после инфаркта миокарда с использованием CD34+, СD133+CD45-клеток на различных моделях у животных [Botta R, Gao Е, Stassi G, et al. Heart infarct in NOD-SCID mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34+ cells ad low dose CD34+KDR+ cells. FASEB J 2004; 18: 1392-1394; Kim BO, Tian H, Prasongsukarn K, et al. Cell transplantation improves ventricular function after a myocardial infarction: a preclinical study of human unrestricted somatic stem cells in a porcine model. Circulation 2006; 112 (9 suppl): 196-204; Leor J, Guetta E, Feinberg MS, et al. Human umbilical cord blood derived CD133+ cells enhance function and repair of the infracted myocardium. Stem Cells 2006; 24(3): 772-780 и Bonnano G, Mariotti A, Procoli A, et al. Human cord blood CD133+ cells imunoselected by a clinical-grade apparatus differentiate in vitro into endothelial-and cardiomyocyte-like cells. Transfusion 2007; 47: 280-289].

Цереброваскулярные заболевания находятся на одном из первых мест по причине смертности, не включая индивидуумов, выживших после инсульта, но с последствиями, проявляющимися в течение оставшегося периода жизни.

Церебральная ишемия является наиболее превалирующей причиной инсультов. В относительно молодом возрасте вследствие пластичности мозга достаточно большая часть мозга может быть удалена (в случае опухолей или гемисферектомии при серьезных повреждениях) без неврологических повреждений или с незначительным периодом восстановления. Эти данные предполагают, что чем моложе нервные клетки, которые могли бы быть продуцированы путем дифференциации из стволовых клеток, тем больше возможность регенерации поврежденного мозга.

В течение всей жизни человека постоянно существует риск неврологических заболеваний и травм. Так, высока частота встречаемости церебрального паралича у новорожденных. От повреждений спинного мозга страдают как дети, так и взрослые. Риск эмболических и геморрагических инсультов увеличивается среди индивидуумов, достигших 40 лет. И, наконец, после 40 лет и в пожилом возрасте высока частота нейродегенеративных заболеваний, как, например, болезнь Паркинсона [Harris, D. Т., Badowski, М., Ahmad, N., & Gaballa, М. (2008). The potential of cord blood stem cells for use in regenerative medicine. Expert Opinion on iological Therapy, 7(9), 1311-1322 и Harris, D.Т., & Rogers, I. (2007). Umbilical cord blood: a unique source of pluripotent stem cells for regenerative medicine. Current Stem Cell Research & Therapy, 2, 301-309]. Традиционные методы терапии, применяемые относительно неврологических заболеваний и травм, неэффективны, что ложится бременем на общество. Использование стволовых клеток в случае неврологических заболеваний или травм открыло бы возможности замещения или регенерации поврежденных тканей спинного или головного мозга. Тем не менее, успех зависит от выбора источника стволовых клеток и соответствующего их применения.

В отличие от многих других патологических состояний, которые были оценены на возможность терапии стволовыми клетками пуповинной крови, восстановление неврологических повреждений имеет намного более сложную этиологию.

Однако на моделях животных с неврологическими повреждениями, обусловленными травмами мозга, инфузия стволовых клеток пуповинной крови приводила к улучшению состояния [Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32: 2682-2688; Willing AE, Lixian J, Milliken M, et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J Neurosci Res 2003; 73(3): 296-307; Borlongan CV, Hadman M, Sanberg CD, Sanberg PR. Central Nervous System Entry of Peripherally Injected Umbilical Cord Blood Cells Is Not Required for Neuroprotection in Stroke. Stroke 2004; 35: 2385-2389; Newman MB, Willing AE, Manressa JJ, Sanberg CD, Sanberg PR. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair. Exp Neurol 2006, 199(1): 201-208; Vendrame M, Cassady J, Newcomb J, et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume. Stroke 2004; 35: 2390-2395; Xiao J, Nan Z, Motooka Y, Low WC. Transplantation of a novel cell line population of umbilical cord blood stem cells ameliorates neurological deficits associated with ischemic brain injury. Stem Cells Dev 2005; 14: 722-733; Newcomb JD, Ajrno CT, Sanberg CD, et al. Timing of Cord Blood Treatment After Experimental Stroke Determines Therapeutic Efficacy. Cell Transplant 2006; 15: 213-223; Nan Z, Grande A, Sanberg CD, Sanberg PR, Low WC. Infusion of Human Umbilical Cord Blood Ameliorates Neurologic Deficits in Rats with Hemorrhagic Brain Injury. Ann NY Acad Sci 2005, 1049(1): 84 - 96; Bliss T, Guzman R, Daadi M, Steinberg GK. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke 2007; 38: 817-826; Saporta S, Kim JJ, Willing AE, et al. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12:271-278; Kuh SU, Cho YE, Yoon DH, et al. Functional recovery after human umbilical cord blood cells transplantation with brain derivedneurotropic factor into the spinal cord injured rats. Acta Neurochir (Wein) 2005; 14: 985-992; Kang KS, Kim SW, Oh YH, et al. Thirty-seven-year old spinal cord-injured female patient, transplanted of multipotent stem cells from human UC blood with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: A case study. Cytotherapy 2005; 7: 368-373; Lu D, Sanberg PR, Mahmood A, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury. Cell Transplant 2002; 11:275-281; Meier C, Middleanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Ped Res 2006; 59: 244-249; Ende N, Chen R. Parkinson's Disease Mice and Human Umbilical Cord Blood. J Med 2002; 33: 173-80; Gaebuzova-Davis S, Willing AE, Zigova T, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 255-270].

Jang et al. [Jang YK, Park JJ, Lee MC, et al. Retinoic acid-mediated induction of neurons and glial cells from human umbilical cord-derived hematopoietic stem cells. J Neurosci Res 2004; 75: 573-584] продемонстрировали, что CD 133+ стволовые клетки пуповинной крови при воздействии ретиноевой кислоты дифференцируются в нервные (астроциты и олигодендроциты) и глиальные клетки с нейромаркерами, включая тубулин, нейроспецифическую энолазу, NeuN, ассоциированный с микротубулином белок-2 (МАР2) и кислый глиальный фибриллярный белок (GFAP), являющийся астроцитоспецифичным маркером.

Более того, негемопоэтические стволовые клетки, найденные в пуповинной крови, способны дифференцироваться в астроциты и олигодендроциты [Buzanska L, Jurga М, Stachowiak ЕК, Stachowiak МК, Domanska-Janik К. Neural stem-like cell line derived from a nonhematopoietic population of human umbilical cord blood. Stem Cells Develop 2006; 15: 391-406]. Таким образом, потомки негемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови также могли бы быть полезны для использования в лечении повреждений мозга и неврологических расстройств.

На модели повреждений спинного мозга у крыс инфузия стволовых клеток пуповинной крови приводила к значительным улучшением на 5-й день после инфузии по сравнению с контрольными животными. Стволовые клетки выявлялись в областях повреждений нервной ткани, но не обнаруживались в неповрежденных областях спинного мозга [Saporta S, Kim JJ, Willing AE, et al. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12:271-278]. Эти данные дополняют результаты исследований о способности клеток пуповинной крови, трансплантированных в спинной мозг животных с травмами, дифференцироваться в нервные клетки различного типа, улучшая регенерацию аксонов и моторную функцию [Kang KS, Kim SW, Oh YH, et al. Thirty-seven-year old spinal cord-injured female patient, transplanted of multipotent stem cells from human UC blood with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: A case study. Cytotherapy 2005; 7: 368-373].

В 2001 г. на наиболее распространенной модели инсульта (медиальная закупорка сонной артерии) было продемонстрировано, что инфузия крысам клеток пуповинной крови может улучшить различные физические и поведенческие дефицитные состояния, связанные с болезнью [Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32: 2682-2688].

Исследования демонстрируют, что прямая инъекция стволовых клеток в мозг не требуется [Willing AE, Lixian J, Milliken M, et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J Neurosci Res 2003; 73(3): 296-307] и, фактически, положительные эффекты можно наблюдать, даже если стволовые клетки не достигают органа-мишени (вероятно, через высвобождение факторов роста и репарации, запускаемое путем аноксии) [Borlongan CV, Hadman М, Sanberg CD, Sanberg PR. Central Nervous System Entry of Peripherally Injected Umbilical Cord Blood Cells Is Not Required for Neuroprotection in Stroke. Stroke 2004; 35: 2385-2389 и Newman MB, Willing AE, Manressa JJ, Sanberg CD, Sanberg PR. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair. Exp Neurol 2006; 199(1): 201-208].

Является значительным, что в отличие от использования фармацевтических препаратов, для которых требуется применение в первые несколько часов после инсульта, терапия стволовыми клетками пуповинной крови эффективна до 48 часов после тромботического инцидента [Newcomb JD, Ajmo CT, Sanberg CD, et al. Timing of Cord Blood Treatment After Experimental Stroke Determines Therapeutic Efficacy. Cell Transplant 2006; 15: 213-223]. Преимущества терапии клетками пуповинной крови также показаны на модели геморрагического инсульта [Nan Z, Grande A, Sanberg CD, Sanberg PR, Low WC. Infusion of Human Umbilical Cord Blood Ameliorates Neurologic Deficits in Rats with Hemorrhagic Brain Injury. Ann NY Acad Sci 2005; 1049(1): 84-96].

Способ лечения инсульта на основе трансплантации стволовых клеток костного мозга описан в патенте RU 2 283 121. Существенным недостатком способа является нейрохирургическое вмешательство: интрацеребральное стереотаксическое введение стволовых клеток под нейронавигационным контролем в область поражения функционально важных структур (в зависимости от клинических проявлений). При выявлении дефицита перфузии вещества головного мозга эта операция дополняется наложением экстраиптракраниального микроанастамоза.

Хотя костный мозг является источником гемопоэтических, мезенхимальных и эндотелиальных стволовых клеток, большинство стволовых клеток костного мозга получают от взрослых доноров, что ограничивает их пластичность. Клетки пуповинной крови, полученные при рождении, являются уникальным источником плюрипотентных стволовых клеток [Atala et al. Umbilical Cord Blood Current Stem Cell Research & Therapy, 2007, Vol.2, No. 4 307]. Более того, клетки пуповинной крови не подвергаются индуцированным окружающей средой эпигенетическим воздействиям.

Использование мононуклеарных клеток пуповинной крови в лечении ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, ишемии мозга, вызванной атеросклерозом или острым нарушением мозгового кровообращения, описано в патенте RU 2 284 190. Недостатком способа является обязательное HLA-типирование, и, более того, для достижения клинического эффекта при ишемических состояниях стволовые клетки пуповинной крови донора должны отличаться от клеток реципиента не менее чем по четырем антигенам из набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR.

Помимо инсультов, на моделях животных показана возможность использования стволовых клеток пуповинной крови в лечении других форм неврологических повреждений. Среди них [Lu et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury. Cell Transplant 2002; 11:275-281] на модели крыс было показано, что внутривенное введение мононуклеарных клеток пуповины могло бы быть полезно для лечения травматических повреждений мозга. Причем, было продемонстрировано, что клетки пуповинной крови достигают мозга, селективно мигрируют к поврежденной области мозга, экспрессируют нейромаркеры и уменьшают неврологическое повреждение.

Сходно, трансплантация стволовых клеток пуповинной крови также могла облегчить симптомы церебрального паралича у новорожденных на модели крыс [Meier С, Middleanis J, Wasielewski В, et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Ped Res 2006; 59: 244-249].

Регенеративная терапия с использованием стволовых клеток пуповинной крови, фокусируясь на функциональном восстановлении поврежденных тканей, особенно актуальна при заболеваниях центральной нервной системы, в частности дегенеративных заболеваниях.

Болезнь Альцгеймера является наиболее частой причиной развития слабоумия в пожилом и старческом возрасте. Главную роль в патогенезе первичного нейродегенеративного альцгеймеровского процесса отводят нарушению превращений белка-предшественника β-амилоида (Аβ), сопровождающегося накоплением нерастворимого Аβ в мозговой паренхиме в виде агрегированных скоплений - амилоидных бляшек. Агрегаты Аβ в свою очередь являются потенциальными активаторами микроглии и астроцитов, которые отвечают на церебральный амилоидоз активацией хронического воспалительного процесса [Benzing W.C., Wujek J.R., Ward Е.К., Shaffer D., Ashe K.H. et al. Evidence for glialmediated inflammation in aged APP(SW) transgenic mice. Neurobiol Aging, 1999, 20, p.581-589].

Хотя ранее считалось, что активация микроглии и астроцитов представляет собой только эпифеномен и не участвует в патогенезе болезни Альцгеймера, недавние исследования установили, что вызванный Аβ воспалительный каскад является одним из важных патогенетических механизмов нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа. Доказано, что терапевтические стратегии, направленные на разные компоненты этого воспалительного каскада, в том числе нестероидные противовоспалительные средства, иммунизация и модулирование микроглиальной активации, редуцируют альцгеймероподобную β-амилоидную патологию, когнитивный дефицит и поведенческие нарушения на модели болезни Альцгеймера у трансгенных мышей, а в некоторых случаях уменьшают и патологию у пациентов с болезнью Альцгеймера [Bard F., Cannon С, Barbour R., Burke R.L., Games D. et al. Peripherally administered antibodies against amyloid-beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease. Nature Med., 2000, 6, p.916-919; Lim G.P., Chu Т., Yang F., Beech W., Frautschy S.A. et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J. Neurosci, 2001, 21, p.8370-8377; Nicoll J.A., Wilkinson D., Holmes C, Steart P., Markham H. et al. Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid- beta peptide: a case report. Nature Med., 2003, 9, p.448-452; Scheme D., Barbour R., Dunn W., Gordon G., Grajeda H. et al. Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature, 1999, 400, p.173-177; Szekely C.A., Thorne J.E., Zandi P.P., Ek M., Messias E. Nonsteroidal antiinflammatory drugs for the prevention of Alzheimer's disease: a systematic review. Neuroepidemiology, 2004, 23, p.159-169; Veld B.A., Ruitenberg A., Hofman A., Launer L.J., van Duijn CM. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and the risk of Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med., 2001, 345, p.1515-1521].

Как было показано на моделях животных, клетки пуповинной крови человека усиливают противовоспалительный ответ Т-хелперов 2 типа, причем этот ответ сопровождался уменьшением объема инфаркта в ткани мозга [Vendrame М., Cassady J., Newcomb J., Butler Т., Pennypacker K.R. et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose-dependently rescues behavioral deficits and reduces infract volume. Stroke, 2004, 35, p.2390-2395]. Позднее этот терапевтический эффект был подтвержден и на других моделях нейровоспалительных процессов [El-Badri N.S., Hakki А., Saporta S., Liang X., Madhusodanan S. et al. Cord for glial-mediated inflammation in aged APP(SW) transgenic mice. Neurobiol blood mesenchymal stem cells: Potential use in neurological disorders. Stem Cells Dev., 2006, 15, p.497-506; Garbuzova-Davis S., Gografe S.J., Sanberg CD., Willing A.E., Saporta S. et al., Maternal transplantation of human umbilical cord blood cells provides prenatal therapy in Sanfilippo type В mouse model. FASEB J., 2006, 20, p.485-487; Henning R.J., Burgos J.D., Ondrovic L., Sanberg P., Balis J. et al. Human umbilical cord blood progenitor cells are attracted to infracted myocardium and significantly reduce myocardial infarction size. Cell Transplant., 2006, 15, p.647-658].

В экспериментах на животных на модели болезни Альцгеймера этот эффект ассоциировался с увеличением продолжительности жизни трансгенных мышей [Nikolic W.V., Hou Н., Town Т., Zhu Y., Giunta В. Peripherally administered human umbilical cord blood cells reduce parenchymal and vascular β-amyloid deposits in Alzheimer mice. Stem Cells Dev., 2008, 17, p.1-17], сообщили о заметной редукции уровня Аβ и численности амилоидных бляшек у трансгенных мышей после серии в/в введений концентрата стволовых клеток пуповинной крови.

Болезнь Паркинсона, частота которой в пожилом возрасте также является высокой, является нейродегенеративным заболеванием с "точечным" локусом - поражением клеток черной субстанции, ведущим к их гибели. И хотя история изучения данной патологии длится уже почти два столетия, этиология и генез этого процесса достоверно не известны. Гипотезы о экзотоксической роли некоторых веществ (например, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрогидроперидин, превращающийся под действием МАО В в токсическое для нейронов черной субстанции соединение N-метил-4-фенилпиридин) или генетическом факторе (связь с сегментом 4q21-q23, наследуемая по аутосомно-доминантному типу) являются все же предположениями [Cleeter MWJ et al.: Irreversible inhibition of mitochondrial complex I by 1-methyl-4-phenylpyridinium: Evidence for free radical involvement. J Neurochem 58:786, 1992; Polymeropoulos MH et al.: Mapping of a gene for Parkinson's disease to chromosome 4q21-q23. Science 274: 1197, 1996].

Образующийся вследствие гибели вышеуказанных клеток дефицит дофаминосинтезирующей функции ведет к сбою работы медиаторной цепочки экстрапирамидной системы, который приводит к торможению моторной коры, что приводит к клиническим симптомам болезни Паркинсона. Актуальность исследования данной проблемы диктуется также и эпидемиологическими данными (распространенность болезни Паркинсона среди населения в целом составляет 1-2 на 1000, а среди лиц старше 65 лет данным недугом страдает уже каждый сотый).

Используемые в настоящее время методы медикаментозной коррекции (препараты, содержащие L-ДОРА; агонисты Д2/Д3 дофаминовых рецепторов; ингибиторы МАО и др.) не являются эффективными, поскольку ведут к прогрессированию процесса и представляют симптоматический подход с массой ограничений (Aminoff MJ: Treatment of Parkinson's disease. West J Med 161: 303, 1994). Более того, применение данной терапии имеет ограничения по времени. Таким образом, восстановление нормальной естественной продукции дофамина реанимированными (или новыми выросшими) клетками черной субстанции является ключевой проблемой в лечении болезни Паркинсона. Учитывая дегенеративный характер патологического процесса при болезни Паркинсона, осуществление клеточной интервенции с целью восстановления опустошенного участка нервной ткани является наиболее привлекательным.

Для бокового амиотрофического склероза, болезни Паркинсона на моделях животных инфузия стволовых клеток пуповинной крови приводила к заметному улучшению поведения по сравнению с контрольными животными [Ende N, Chen R. Parkinson's Disease Mice and Human Umbilical Cord Blood. J Med 2002; 33: 173-80; Garbuzova-Davis S, Willing AE, Zigova T, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 255-270].

Были предприняты попытки использовать эмбриональные стволовые клетки и взрослые стволовые клетки костного мозга при ишемических инсультах и паркинсонизме в клинических исследованиях. Так, были предложены способы лечения ишемического инсульта и паркинсонизма с использованием предварительно размноженных в культуре нейрональных стволовых клеток, полученных из ткани переднего мозга или перивентрикулярной области головного мозга абортированных эмбрионов человека (патенты RU 2258521 и RU 2259836). Однако возможность использования эмбриональных стволовых клеток и стволовых клеток костного мозга в терапии ограничена ввиду существенных недостатков.

Использование фетальных стволовых клеток связано с этическими проблемами, трудностями культивирования клеток и сопряжено с высоким риском контаминации материала бактериальной и/или вирусной микрофлорой. При введении фетальных стволовых клеток путем инфузии без долговременных и дорогостоящих этапов культивирования и дифференциации in vitro возможна злокачественная трансформация эмбриональных клеток, наиболее общей угрозой является образование тератомы. Нежелательной является и длительная иммуносупрессия, которая необходима при использовании эмбриональных клеток из-за угрозы иммунного отторжения. Существенным недостатком способов лечения ишемических инсультов и паркинсонизма, описанных в патентах RU 2258521 и RU 2259836, является и эндолюмбальный способ трансплантации.

Известен способ лечения бокового амиотрофического склероза путем введения в кровь ядросодержащих клеток пуповинной крови в количестве не менее 5×10⁹ (WO 2004/071283). При осуществлении способа, описанного в WO 2004/071283, не требуется предварительного подавления иммунного ответа или HLA-типирования донора и реципиента, однако для его осуществления необходимы чрезвычайно большие количества клеток. Количество ядросодержащих клеток в одной порции пуповинной крови не превышает 2,8×10⁹. Этого количества недостаточно для осуществления способа. Таким образом, требуется не только одномоментное введение в организм аллогенных клеток, но и клеток от нескольких разных доноров. При этом резко возрастает риск аллергических, в том числе анафилактических реакций, а также риск развития других иммунопатологических состояний, включая иммунодепрессию.

Кроме того, одновременная иммунизация клетками различных доноров приводит к невозможности повторного применения способа у того же больного. Применение способа в 5 случаях из 10 привела к токсическим и аллергическим реакциям с развитием у всех больных иммуносупрессии в течение 7-30 дней после введения. Попытка повторного применения способа приводила к токсико-аллергическим реакциям у большинства пациентов.

Проблема лечения рассеянного склероза, хронического демиелинизирующего заболевания центральной нервной системы (ЦНС), остается одной из самых актуальных в современной неврологии, что объясняется высокой распространенностью заболевания среди лиц молодого трудоспособного возраста и неизбежным развитием на определенной стадии стойкой инвалидизации.

Выявление различных типов демиелинизации, от преобладания воспалительных реакций до олигодендроглиопатии и аномальной ремиелинизации, а также доказательства аксонального повреждения не только в активных очагах, но и во внешне неизмененном белом веществе сблизили рассеянный склероз с нейродегенеративными заболеваниями [Lucchinetti С.et al. Brain Pathol., 1996, V.6, P.25922; Trapp B.D. et al. Neuroscience, 1999, V.5, p.48].

Иммунопатологические механизмы развития обострений при рассеянном склерозе [Завалишин И.А., Захарова М.Н. Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания. /Под ред. Гусева Е.И. и др. М., 2004, С.60; Рассеянный склероз. Избранные вопросы теории и практики. /Под ред. Завалишина И.А., Головкина В.И. М., 2000; Hohlfeld R. Brain, 1997, V.120, P.865] включают активацию энергичных, неактивных Т-клеток типа CD4+ вне ЦНС; проникновение их через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ); образование тримолекулярного комплекса, включающего соответствующий рецептор активированной Т-клетки и аутоантиген, связанный с молекулами II класса главного комплекса гистосовместимости на антигенпрезентирующих клетках (в качестве последних выступают макрофаги и клетки глии). Проникшие в нервную систему аутореактивные Т-клетки и вторично активированные макрофаги и микроглия секретируют провоспалительные цитокины (интерферон-гамма, фактор некроза опухолей-альфа, лимфотоксин и др.), которые в свою очередь в еще большей степени индуцируют и поддерживают воспалительные реакции и усиливают нарушения проницаемости ГЭБ. Несмотря на то что клиническое течение рассеянного склероза на начальных этапах обычно характеризуется чередованием обострений и ремиссий, иммуновоспалительный процесс в целом характеризуется постоянным течением.

В результате каскада иммунологических и биохимических нарушений развивается повреждение миелина и олигодендроцитов. На более поздних этапах патологического процесса активируются неспецифические механизмы: фагоцитоз поврежденных структур и пролиферация глиальных элементов. Однако помимо развития воспалительных реакций, демиелинизирующего процесса и глиальных нарушений, основная роль в развитии рассеянного склероза отводится вовлечению в процесс аксонов. Именно аксональное повреждение при рассеянном склерозе считают ответственным за развитие необратимого неврологического дефицита и трансформацию ремиттирующего течения с лабильностью симптомов во вторично-прогрессирующее [Trapp B.D. et al. Neuroscience, 1999, V.5, P.48].

Рассматривается несколько наиболее вероятных причин деструкции аксонов при рассеянном склерозе. Механизмом прямой иммунологической атаки аксонов при рассеянном склерозе считают экспрессию на них молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости, что делает их уязвимыми к цитотоксическому влиянию Т-лимфоцитов типа CD8+ [Neumann Н. et al. Science, 1995, V.269, P.549]. Развитие аксональной дегенерации, обусловленной воспалительными реакциями, может быть связано с различными факторами [Rieckmann P., Maurer М. Curr. Opin. Neurol., 2002, V.15, p.361], в том числе увеличением внеклеточного давления при воспалительном отеке; повреждением в результате воздействия глутамата (продуцируемого активированными макрофагами и микроглией) на олиго-дендроглиальные АМРА-рецепторы; выделением провоспалительных цитокинов.

Однако дегенеративные изменения аксонов возможны и при хроническом демиелинизирующем процессе за счет нарушения миелин-аксональных взаимодействий и трофического влияния олигодендроглиоцитов, в частности модулирующего воздействия миелин-ассоциированного гликопротеина и протеолипидного протеина. Механизмы их трофического влияния на аксон различны, однако при дефиците обоих упомянутых белков аксональная патология развивается в нодальной области с поражением аксонального цитоскелета [Trapp B.D. et al. Neuroscience, 1999, v.5, p.48].

Другим важным аспектом аксонально-глиальных взаимодействий является воздействие трофических факторов. Так, в группе больных рассеянным склерозом с ранним началом и тяжелым течением болезни были выявлены мутации, приводящие к отсутствию цилиарного нейротрофического фактора [Ciess R. et al. Arch. Neurol., 2002, v.59, p.407]. Аналогичное влияние на течение заболевания описано и у пациентов с аллелем е4 аполипопротеина Е, у которых отмечены раннее начало, более высокая частота обострений и более быстрое прогрессирование болезни [Fazekas F. et al. Neurology, 2001, v.57, p.853]. Эти данные свидетельствуют о том, что, независимо от иммуноопосредованного повреждения миелина и аксонов, генетически детерминированная структурная и молекулярная целостность аксонально-глиальных взаимодействий имеет важное значение при демиелинизирующем процессе.

Развитие неврологического дефицита при рассеянном склерозе рассматривают с точки зрения двух патогенетических механизмов: обратимой острой воспалительной демиелинизации, доминирующей при обострении заболевания при ремиттирующем течении рассеянного склероза, и необратимой аксональной дегенерации, преобладающей при вторично-прогрессирующем тече