Стабильные препараты инсулинотропных пептидов

Стабильные препараты инсулинотропных пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области фармацевтических препаратов. А именно данное изобретение относится к фармацевтическим препаратам длительного хранения, включающим инсулинотропный пептид.

Предшествующий уровень техники

Терапевтические пептиды широко используются в медицинской практике. Фармацевтические композиции таких терапевтических пептидов должны иметь срок хранения несколько лет, чтобы быть пригодными для практического применения. Однако пептидные композиции по своей природе не стабильны из-за чувствительности к химической и физической деградации. Химическая деградация включает изменение ковалентных связей, такое как окисление, гидролиз, рацемизация или сшивание. Физическая деградация включает конформационные изменения относительно нативной структуры пептида, которые могут приводить к агрегации, осаждению или адсорбции на поверхностях.

Глюкагон используют в течение десятилетий в медицинской практике при диабете, и несколько глюкагоноподобных пептидов разрабатывают для разных терапевтических показаний. Ген препроглюкагона кодирует как глюкагон, так и глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) и глюкагоноподобный пептид 2 (GLP-2) (GLP от glucagon-like peptide). Аналоги и производные GLP-1, а также гомологичный пептид ящерицы, экзендин-4, разрабатывают для лечения гипергликемии при диабете 2 типа. GLP-2 является потенциально полезным при лечении желудочно-кишечных болезней. Однако все эти пептиды, включающие 29-39 аминокислот, обладают высокой степенью гомологии и имеют ряд общих свойств, а именно их склонность к агрегации и образованию нерастворимых волокон. Считается, что это свойство включает переход из преобладающей конформации альфа-спирали в конформацию бета-листа (Blundell T.L. (1983) The conformation of glucagon. In: Lefébvre P.J. (Ed) Glucagon I. Springer Verlag, pp 37-55, Senderoff R.I. et al., J. Pharm. Sci. 87 (1998) 183-189, WO 01/55213). Агрегация глюкагоноподобных пептидов главным образом наблюдается, когда растворы пептидов перемешивают или встряхивают, на границе раздела жидкой и газообразной фаз (воздух) и при контакте с гидрофобными поверхностями, такими как Тефлон®.

WO 01/77141 раскрывает термическую обработку Arg³⁴-GLP-1(7-37) при повышенных температурах в течение менее 30 секунд. WO 04/55213 раскрывает микрофильтрацию Arg³⁴-GLP-1(7-37) при рН 9,5. WO 01/55213 раскрывает обработку Val⁸-GLP-1(7-37) при рН 12,3 в течение 10 минут при комнатной температуре. WO 03/35099 раскрывает получение цинковых кристаллов GLP-1 при щелочном рН.

Таким образом, к фармацевтическим композициям глюкагоноподобных пептидов часто следует применять разные обработки и добавление эксципиентов для того, чтобы улучшить их стабильность. Срок хранения жидких парентеральных препаратов этих пептидов должен составлять по меньшей мере год, предпочтительно дольше. Период использования, когда продукт можно транспортировать и ежедневно встряхивать при температуре окружающей среды, предпочтительно должен составлять несколько недель. Таким образом, существует потребность в фармацевтических композициях глюкагоноподобных пептидов, обладающих улучшенной стабильностью.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1. Оба образца содержат препарат 1,2 мМ Лираглутида, 14 мг/мл пропиленгликоля, 40 мМ фенола, 10 мМ NaCl, рН 7,7. Полоксамер 188 добавляют до конечной концентрации 200 млн^-1 в одном образце.

Фиг.2. Все образцы содержат 1,67 мМ Лираглутида, 58 мМ фенола, 14 мг/мл пропиленгликоля, 8 мМ фосфата натрия, рН 7,7. Полоксамер 188 добавляют к двум образцам.

Фиг.3. Оба образца содержат 1,2 мМ Лираглутида, 40 мМ фенола, 14 мг/мл пропиленгликоля, 10 мМ NaCl, рН 7,7. Полисорбат 20 добавляют к одному образцу.

Фиг.4. Измерение зависимости NTU (нефелометрической единицы мутности) от времени в ходе теста на вращение композиций лираглутида без поверхностно-активного вещества (F1) и с поверхностно-активным веществом (F2 и F3).

Фиг.5. Измерение зависимости флуоресценции ТПТ (тиофлавина Т) от времени в ходе теста на вращение композиций лираглутида без поверхностно-активного вещества (F1) и с поверхностно-активным веществом (F2). Нижняя кривая соответствует следу F2.

Фиг.6. Период времени для образования волокон.

Фиг.7. Физическая стабильность лираглутида, полученного термической обработкой при 60°С.

Фиг.8. Чистота лираглутида после термической обработки при 60°С.

Фиг.9. Физическая стабильность лираглутида, полученного термической обработкой при 80°С.

Фиг.10. Чистота лираглутида после термической обработки при 80°С.

Фиг.11. Физическая стабильность лираглутида, полученного при термической обработки в течение 15 минут при 22, 40, 60 и 80°С.

Фиг.12. Физическая стабильность лираглутида, полученного термической обработкой при 50 и 80°С при рН 10.

Фиг.13. Чистота лираглутида после термической обработки при 50 и 80°С при рН 10.

Фиг.14. Физическая стабильность лираглутида, полученного термической обработкой при 60 и 80°С при рН 9 и 10.

Фиг.15. Данный чертеж показывает 5 разных препаратов. 4 разных препарата, содержащих разные количества Solutol HS-15 либо в фосфатном буфере, либо в трицин буфере. Один препарат (Станд. препарат) представляет собой лираглутид в фосфатном буфере без поверхностно-активного вещества.

Фиг.16. Данный чертеж показывает 5 разных препаратов. 4 разных препарата, содержащих разные количества Pluronic F-127 либо в фосфатном буфере, либо в трицин буфере. Один препарат (Станд. препарат) представляет собой лираглутид в фосфатном буфере без поверхностно-активного вещества.

Фиг.17. Физическая стабильность лираглутида после термической обработки при 50-70°С в течение 60-120 минут.

Фиг.18. Пенфилл®, термически обработанный при разных температурах и времени, который затем подвергали вращению.

Фиг.19. Стабильность препаратов, содержащих разные эксципиенты.

Фиг.20. Тест на вращение Пенфилла® препаратов, содержащих разные эксципиенты.

Далее следует подробное определение терминов, используемых в описании.

Используемый здесь термин «эффективное количество» означает дозировку, которой достаточно для того, чтобы лечение пациента было эффективным в сравнении с отсутствием лечения.

Используемый здесь термин «лекарство» означает фармацевтическую композицию, подходящую для введения пациенту фармацевтически активных соединений.

Используемый здесь термин «фармацевтическая композиция» означает продукт, включающий активное соединение или его соль вместе с фармацевтическими эксципиентами, такими как буфер, консервант и модификатор тоничности, указанная фармацевтическая композиция, являющаяся пригодной для лечения, предотвращения или уменьшения тяжести заболевания или расстройства при введении человеку указанной фармацевтической композиции. Таким образом, фармацевтическая композиция также известна из предшествующего уровня техники как фармацевтический препарат. Следует понимать, что рН фармацевтической композиции, которая должна быть восстановлена, представляет собой значение рН, которое измерено в восстановленной композиции, полученной восстановлением в предусмотренной жидкости для восстановления при комнатной температуре.

Используемый здесь термин «фармацевтическая композиция длительного хранения» означает фармацевтическую композицию, которая стабильна по меньшей мере в течение периода, требуемого контрольными органами применительно к терапевтическим белкам. Предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция длительного хранения была стабильна в течение по меньшей мере одного года при 5°С. Стабильность включает как химическую, так и физическую стабильность.

Используемый здесь термин «стабильный раствор» означает препарат соединения, который используется в качестве промежуточного при получении фармацевтических композиций длительного хранения, как описано выше.

Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый» означает подходящий для обычных фармацевтических применений, т.е. не вызывающий нежелательных явлений у пациентов и т.д.

Используемый здесь термин «буфер» относится к химическому соединению в фармацевтической композиции, которое уменьшает тенденцию рН композиции изменяться со временем, что иначе произошло бы вследствие химических реакций. Буферы включают химические реактивы, такие как фосфат натрия, TRIS, глицин и цитрат натрия.

Используемый здесь термин «консервант» относится к химическому соединению, которое добавляют к фармацевтической композиции, чтобы предотвратить или замедлить действие микробов (развитие и метаболизм). Примерами фармацевтически приемлемых консервантов являются фенол, м-крезол, и смесь фенола и м-крезола.

Используемый здесь термин «агент изотоничности» относится к химическому соединению в фармацевтической композиции, которое служит для изменения осмотического давления фармацевтической композиции так, чтобы осмотическое давление стало ближе к осмотическому давлению человеческой плазмы. Агенты изотоничности включают NaCl, глицерин, маннит и т.п.

Используемый здесь термин «стабилизатор» относится к химическим реактивам, добавляемым к содержащим пептид фармацевтическим композициям с тем, чтобы стабилизировать пептид, т.е. увеличить срок хранения и/или период использования таких композиций. Примерами стабилизаторов, применяемых в фармацевтических препаратах, являются L-глицин, L-гистидин, аргинин, полиэтиленгликоль и карбоксиметилцеллюлоза.

Используемый здесь термин «поверхностно-активное вещество» относится к любым молекулам или ионам, которые включают водорастворимую (гидрофильную) часть, голову, и жирорастворимую (липофильную) часть. Поверхностно-активные вещества предпочтительно накапливаются на границах раздела, при этом гидрофильная часть ориентирована по направлению к воде (гидрофильная фаза), а липофильная часть - по направлению к маслу или гидрофобной фазе (т.е. стекло, воздух, масло и т.п.). Концентрация, при которой поверхностно-активные вещества начинают образовывать мицеллы, известна как критическая концентрация мицеллообразования или ККМ. Кроме того, поверхностно-активные вещества уменьшают поверхностное натяжение жидкости. Поверхностно-активные вещества также известны как амфифильные соединения. Термин «детергент» является синонимом, обычно используемым для поверхностно-активных веществ.

Анионные поверхностно-активные вещества можно выбрать из группы: хенодезоксихолевая кислота, натриевая соль хенодезоксихолевой кислоты, холевая кислота, дегидрохолевая кислота, дезоксихолевая кислота, метиловый эфир дезоксихолевой кислоты, дигитонин, дигитоксигенин, N,N-диметилдодециламина N-оксид, докузат натрия, натриевая соль гликохенодезоксихолевой кислоты, гидрат гликохолевой кислоты, моногидрат гликодезоксихолевой кислоты, натриевая соль гликодезоксихолевой кислоты, динатриевая соль 3-сульфат гликолитохолевой кислоты, этиловый эфир гликолитохолевой кислоты, натриевая соль N-лауроилсаркозина, N-лауроилсаркозин, додецилсульфат лития, люголь, натриевая соль 1-октансульфоной кислоты, 1-бутансульфонат натрия, 1-декансульфонат натрия, 1-додекансульфонат натрия, 1-гептансульфонат натрия, 1-нонансульфонат натрия, моногидрат 1-пропансульфоната натрия, 2-бромэтансульфонат натрия, гидрат холата натрия, воловья или овечья желчь, гидрат холата натрия, холеат натрия, дезоксихолат натрия, додецилсульфат натрия, гексансульфонат натрия, октилсульфат натрия, пентансульфонат натрия, таурохолат натрия, натриевая соль таурохенодезоксихолевой кислоты, моногидрат натриевой соли тауродезоксихолевой кислоты, динатриевая соль 3-сульфат тауролитохолевой кислоты, натриевая соль тауроурсодезоксихолевой кислоты, Trizma® додецилсульфат, DSS (докузат натрия, регистрационный номер CAS [577-11-7], докузат кальция, регистрационный номер CAS [128-49-4], докузат калия, регистрационный номер CAS [7491-09-0]), SDS (додецилсульфат натрия или лаурилсульфат натрия), додецилфосфохолин (FOS-Choline-12), децилфосфохолин (FOS-Choline-10), нонилфосфохолин (FOS-Choline-9), дипальмитоилфосфатидная кислота, каприлат натрия и/или урсодезоксихолевая кислота.

Катионные поверхностно-активные вещества можно выбрать из группы: алкилтриметиламмоний бромид, бензалконий хлорид, бензилдиметилгексадециламмоний хлорид, бензилдиметилтетрадециламмоний хлорид, бензилтриметиламмоний тетрахлороиодат, диметилдиоктадециламмоний бромид, додецилэтилдиметиламмоний бромид, додецилтриметиламмоний бромид, этилгексадецилдиметиламмоний бромид, гексадецилтриметиламмоний бромид, полиоксиэтилен(10)-N-алкил-1,3-диаминопропан, тонзония бромид и/или триметил(тетрадецил)аммоний бромид.

Неионные поверхностно-активные вещества можно выбрать из группы: BigCHAP, бис(полиэтиленгликоль бис[имидазолил карбонил]), блоксополимеры как полиэтиленоксид/полипропиленоксид блоксополимеры, такие как полоксамеры, полоксамер 188, полоксамер 407, Brij® 35, Brij® 56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij® 58P, Кремофор® EL, монододециловый эфир декаэтиленгликоля, N-деканоил-N-метилглюкамин, н-додеканоил-N-метилглюкамид, алкилполиглюкозиды, этоксилированное касторовое масло, монодециловый эфир гептаэтиленгликоля, монододециловый эфир гептаэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир гептаэтиленгликоля, монододециловый эфир гексаэтиленгликоля, моногексадециловый эфир гексаэтиленгликоля, монооктадециловый эфир гексаэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир гексаэтиленгликоля, Igepal CA-630, метил-6-O-(N-гептилкарбамоил)-бета-O-глюкопиранозид, монододециловый эфир нонаэтиленгликоля, N-нонаноил-N-метилглюкамин, монодециловый эфир октаэтиленгликоля, монододециловый эфир октаэтиленгликоля, моногексадециловый эфир октаэтиленгликоля, монооктадециловый эфир октаэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир октаэтиленгликоля, октил-β-D-глюкопиранозид, монодециловый эфир пентаэтиленгликоля, монододециловый эфир пентаэтиленгликоля, моногексадециловый эфир пентаэтиленгликоля, моногексиловый эфир пентаэтиленгликоля, монооктадециловый эфир пентаэтиленгликоля, монооктиловый эфир пентаэтиленгликоля, диглицидиловый эфир полиэтиленгликоля, эфир W-1 полиэтиленгликоля, тридециловый эфир полиоксиэтилена 10, полиоксиэтилен 100 стеарат, изогексадециловый эфир полиоксиэтилена 20, олеиловый эфир полиоксиэтилена 20, полиоксиэтилен 40 стеарат, полиоксиэтилен 50 стеарат, полиоксиэтилен 8 стеарат, полиоксиэтилен бис(имидазолил карбонил), полиоксиэтилен 25 пропиленгликоль стеарат, сапонин из коры килайи, Спан® 20, Спан® 40, Спан® 60, Спан® 65, Спан® 80, Спан® 85, Тергитол 15-S-12, Тергитол 15-S-30, Тергитол 15-S-5, Тергитол 15-S-7, Тергитол 15-S-9, Тергитол NP-10, Тергитол NP-4, Тергитол NP-40, Тергитол NP-7, Тергитол NP-9, тетрадецил-β-D-мальтозид, монодециловый эфир тетраэтиленгликоля, монододециловый эфир тетраэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир тетраэтиленгликоля, монодециловый эфир триэтиленгликоля, монододециловый эфир триэтиленгликоля, моногексадециловый эфир триэтиленгликоля, монооктиловый эфир триэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир триэтиленгликоля, Тритон CF-21, Тритон CF-32, Тритон DF-12, Тритон DF-16, Тритон GR-5M, Тритон QS-15, Тритон QS-44, Тритон Х-100, Тритон Х-102, Тритон Х-15, Тритон Х-151, Тритон Х-200, Тритон Х-207, Тритон® Х-100, Тритон® Х-114, раствор Тритона® Х-165, раствор Тритона® Х-305, Тритон® Х-405, Тритон® Х-45, Тритон® Х-705-70, Твин® 20, Твин® 40, Твин® 60, Твин® 6, Твин® 65, Твин® 80, Твин® 81, Твин® 85, тилоксапол, сфингофосфолипиды (сфингомиелин) и сфингогликолипиды (церамиды, ганглиозиды), фосфолипиды и/или н-ундецил-β-D-глюкопиранозид.

Цвиттер-ионные поверхностно-активные вещества можно выбрать из группы: CHAPS, CHAPSO, внутренняя соль 3-(децилдиметиламмонио)-пропансульфоната, внутренняя соль 3-(додецилдиметиламмонио)-пропансульфоната, 3-(N,N-диметилмиристиламмонио)-пропансульфонат, 3-(N,N-диметилоктадециламмонио)-пропансульфонат, внутренняя соль 3-(N,N-диметилоктиламмонио)-пропансульфоната, 3-(N,N-диметилпальмитиламмонио)-пропансульфонат, N-алкил-N,N-диметиламмонио-1-пропансульфонаты, 3-холамидо-1-пропилдиметиламмонио-1-пропансульфонат, додецилфосфохолин, миристоил лизофосфатидилхолин, цвиттергент 3-12 (N-додецил-N,N-диметил-3-аммонио-1-пропансульфонат), цвиттергент 3-10 (внутренняя соль 3-(децилдиметиламмонио)-пропансульфоната), цвиттергент 3-08 (3-(октилдиметиламмонио)-пропансульфонат), глицерофосфолипиды (лецитины, кефалины, фосфатидилсерин), глицерогликолипиды (галактопиранозид), алкил, алкоксил (алкиловый эфир), алкокси (алкиловый эфир) - производные лизофосфатидил- и фосфатидилхолинов, например лауроил и миристоил производные лизофосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолин, и модификации полярной головной группы, то есть холины, этаноламины, фосфатидная кислота, серины, треонины, глицерин, инозитол, лизофосфатидилсерин и лизофосфатидилтреонин, ацилкарнитины и производные, N^бета-ацилированные производные лизина, аргинина или гистидина, или производные лизина или аргинина, ацилированные в боковой цепи, N^бета-ацилированные производные дипептидов, включающие любую комбинацию лизина, аргинина или гистидина и нейтральной или кислой аминокислоты, N^бета-ацилированные производные трипептида, включающие любую комбинацию нейтральной аминокислоты и двух заряженных аминокислот, или поверхностно-активное вещество можно выбрать из группы имидазолиновых производных, длинноцепочечных жирных кислот и их солей C₆-C₁₂ (например, олеиновая кислота и каприловая кислота), N-гексадецил-N,N-диметил-3-аммонио-1-пропансульфонат, анионные (алкил-арил-сульфонаты) одновалентные поверхностно-активные вещества, пальмитоил лизофосфатидил-1-серин, лизофосфолипиды (например, 1-ацил-sn-глицеро-3-фосфатные эфиры этаноламина, холина, серина или треонина) или их смеси.

Используемый здесь термин «алкилполиглюкозиды» относится к неразветвленной или разветвленной С_5-20-алкильной, -алкенильной или -алкинильной цепи, которая замещена одним или более глюкозидными остатками, такими как мальтозид, сахарид и т.п. Воплощения этих алкилполиглюкозидов включают С_6-18-алкилполиглюкозиды. Конкретные воплощения этих алкилполиглюкозидов включают цепи с четным числом углеродных атомов, такие как С₆, С₈, С₁₀, C₁₂, C₁₄, C₁₆, C₁₈ и C₂₀ алкильные цепи. Конкретные воплощения глюкозидных остатков включают пиранозид, глюкопиранозид, мальтозид, мальтотриозид и сахарозу. В воплощениях изобретения менее 6 глюкозидных остатков присоединены к алкильной группе. В воплощениях изобретения менее 5 глюкозидных остатков присоединены к алкильной группе. В воплощениях изобретения менее 4 глюкозидных остатков присоединены к алкильной группе. В воплощениях изобретения менее 3 глюкозидных остатков присоединены к алкильной группе. В воплощениях изобретения менее 2 глюкозидных остатков присоединены к алкильной группе. Конкретные воплощения алкилполиглюкозидов представляют собой алкилглюкозиды, такие как н-децил-β-D-глюкопиранозид, децил-β-D-мальтопиранозид, додецил-β-D-глюкопиранозид, н-додецил-β-D-мальтозид, тетрадецил-β-D-глюкопиранозид, децил-β-D-мальтозид, гексадецил-β-D-мальтозид, децил-β-D-мальтотриозид, додецил-β-D-мальтотриозид, тетрадецил-β-D-мальтотриозид, гексадецил-β-D-мальтотриозид, н-додецил-сахароза, н-децил-сахароза, монокапрат сахарозы, монолаурат сахарозы, мономиристат сахарозы и монопальмитат сахарозы.

Используемый здесь термин «лечение болезни» означает ведение и заботу о пациенте с развитым заболеванием, состоянием или расстройством. Цель лечения заключается в противодействии заболеванию, состоянию или расстройству. Лечение включает введение активных соединений, чтобы устранить или контролировать заболевание, состояние или расстройство, а также облегчить симптомы или осложнения, связанные с заболеванием, состоянием или расстройством, и предотвращение заболевания, состояния или расстройства.

Используемый здесь термин «предотвращение болезни» определен как ведение и забота о человеке с риском развития болезни до клинического проявления болезни. Цель предотвращения заключается в противодействии развитию заболевания, состояния или расстройства, и включает введение активных соединений, чтобы предотвратить или замедлить проявление симптомов или осложнений и предотвратить или замедлить развитие связанных заболеваний, состояний или расстройств.

Используемый здесь термин «аналог», относящийся к пептидам, означает модифицированный пептид, в котором один или более аминокислотных остатков пептида замещены другими аминокислотными остатками, и/или в котором один или более аминокислотных остатков удалены из пептида, и/или в котором один или более аминокислотных остатков добавлены в пептид. Подобное добавление или удаление аминокислотных остатков могут иметь место на N-конце пептида и/или на С-конце пептида. В одном воплощении аналог включает менее 6 модификаций (замещения, удаления, добавления) относительно нативного пептида. В другом воплощении аналог включает менее 5 модификаций (замещения, удаления, добавления) относительно нативного пептида. В другом воплощении аналог включает менее 4 модификаций (замещения, удаления, добавления) относительно нативного пептида. В другом воплощении аналог включает менее 3 модификаций (замещения, удаления, добавления) относительно нативного пептида. В другом воплощении аналог включает менее 2 модификаций (замещения, удаления, добавления) относительно нативного пептида. В другом воплощении аналог включает только одну модификацию (замещение, удаление, добавление) относительно нативного пептида.

Используемый здесь термин «производное» в отношении исходного пептида означает химически модифицированный исходный белок или его аналог, где в исходном белке или его аналоге отсутствует по меньшей мере один заместитель, т.е. исходный белок, который был ковалентно модифицирован. Характерные модификации представляют собой амиды, углеводы, алкильные группы, ацильные группы, эфиры, модификации молекулами ПЭГ и т.п.

Используемый здесь термин «соединение GLP-1» означает GLP-1(7-37) (SEQ ID NO. 1), его инсулинотропный аналог и его инсулинотропные производные. Неограничивающие примеры аналогов GLP-1 представляют собой GLP-1(7-36)-амид, Arg³⁴-GLP-1(7-37), Gly⁸-GLP-1(7-37), Val⁸-GLP-1(7-36)-амид и Val⁸Asp²²-GLP-1(7-37). Неограничивающие примеры производных GLP-1 представляют собой дeзaминo-His⁷,Arg²⁶,Lys³⁴(N^ε-(γ-Glu(N^α-гeкcaдeкaнoил)))-GLP-1(7-37), дезамино-His⁷,Arg²⁶,Lys³⁴(N^ε-октаноил)-GLP-1(7-37), Arg^26,34,Lys³⁸(N^ε-(ω-карбоксипентадеканоил))-GLР-1(7-38), Arg^26,34,Lys³⁶(N^ε-(γ-Glu(N^α-гексадеканоил)))-GLP-1(7-36) и Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε(γ-Glu(N^α-гексадеканоил)))-GLP-1(7-37).

Используемый здесь термин «дипептидиламинопептидаза IV защищенный» означает соединение, например аналог GLP-1, которое более устойчиво к дипептидиламинопептидазе IV (DPP-IV), чем нативное соединение, например GLP-1(7-37). Устойчивость соединения GLP-1 к расщеплению под действием дипептидиламинопептидазы IV определяют в ходе следующего анализа расщепления.

Аликвоты соединения GLP-1 (5 нмоль) инкубируют при 37°C с 1 мкл очищенной дипептидиламинопептидазы IV, соответствующей ферментативной активности 5 мЕд, в течение 10-180 минут в 100 мкл 0,1 М триэтиламин - HCl буфера, рН 7,4. Ферментативные реакции завершают добавлением 5 мкл 10% трифторуксусной кислоты, и продукты расщепления пептида разделяют и определяют количественно, используя ВЭЖХ анализ. Один метод проведения этого анализа: смеси вносят в 250×4,6 мм колонку Vydac C18 widepore (поры 30 нм, частицы 5 мкм) и элюируют при скорости потока 1 мл/мин с линейными и ступенчатыми градиентами ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте (0% ацетонитрила в течение 3 минут, 0-24% ацетонитрила в течение 17 минут, 24-48% ацетонитрила в течение 1 минуты) согласно Siegel et al., Regul. Pept. 1999; 79: 93-102 и Mentlein et al. Eur. J. Biochem. 1993; 214: 829-35. Пептиды и продукты их расщепления можно контролировать по их поглощению при 220 нм (пептидные связи) или при 280 нм (ароматические аминокислоты) и определяют количество путем интегрирования площадей их пиков относительно стандартов. Скорость гидролиза соединения GLP-1 под действием дипептидиламинопептидазы IV оценивают в периоды инкубации, которые приводят к менее 10% гидролизованного соединения GLP-1.

Используемый здесь термин «инсулинотропный», относящийся к пептиду или соединению, означает способность стимулировать секрецию инсулина в ответ на повышенный уровень глюкозы в плазме. Инсулинотропные пептиды и соединения являются агонистами рецептора GLP-1. Инсулинотропное свойство соединения можно определить анализами in vitro или in vivo, известными из предшествующего уровня техники. Следующий анализ in vitro можно использовать, чтобы определить инсулинотропную природу соединения, такого как пептид. Предпочтительно инсулинотропные соединения показывают значение ЭК₅₀ в нижеприведенном анализе менее 5 нМ, даже более предпочтительно значение ЭК₅₀ менее 500 пМ.

Клетки почек детеныша хомяка (ВНК), экспрессирующие клонированный рецептор GLP-1 человека (ВНК 467-12А), выращивают в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) с добавлением 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкл/мл стрептомицина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1 мг/мл генетецина G-418 (Life Technologies). Цитоплазматические мембраны получают гомогенизацией в буфере (10 мМ Tris-HCl, 30 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитол, рН 7,4, содержащий дополнительно 5 мг/мл лейпептина (Sigma), 5 мг/л пепстатина (Sigma), 100 мг/л бацитрацина (Sigma) и 16 мг/л апротинина (Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA)). Гомогенат центрифугировали поверх слоя 41% масс./об. сахарозы. Белый слой между двумя слоями растворяли в буфере и центрифугировали. Цитоплазматические мембраны хранили при -80°С до использования.

Функциональный анализ рецептора проводят, измеряя цАМФ как отклик на раздражение под действием инсулинотропного пептида или инсулинотропного соединения. Инкубации проводят на 96-луночном планшете микротитратора в общем объеме 140 мл и с последующими конечными концентрациями: 50 мМ Tris-HCl, 1 мМ EGTA, 1,5 мМ MgSO₄, 1,7 мМ АТФ, 20 мМ ГТФ, 2 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX), 0,01% масс/об Твин-20, рН 7,4. Соединения растворяют и разбавляют в буфере. ГТФ готовят заново для каждого эксперимента: 2,5 мкг мембраны добавляют в каждую лунку и смесь инкубируют в течение 90 минут при комнатной температуре в темноте, встряхивая. Реакцию останавливают, добавляя 25 мл 0,5 М HCl. Образованную цАМФ измеряют с помощью сцинтилляционного проксимального анализа (RPA 542, Amersham, UK). Строят кривую зависимости доза-эффект для соединения и рассчитывают значение ЭК₅₀, используя программное обеспечение GraphPad Prism.

Используемый здесь термин «пролекарство инсулинотропного соединения» означает химически модифицированное соединение, которое после введения пациенту превращается в инсулинотропное соединение. Подобные пролекарства обычно представляют собой варианты с добавлением аминокислот или эфиры инсулинотропного соединения.

Используемый здесь термин «соединение экзендина-4» определен как экзендин-4(1-39) (SEQ ID NO.2), его инсулинотропные фрагменты, его инсулинотропные аналоги и его инсулинотропные производные. Инсулинотропные фрагменты экзендина-4 представляют собой инсулинотропные пептиды, для которых может быть найдена полная последовательность в последовательности экзендина-4 (SEQ ID NO. 2) и где по меньшей мере одна концевая аминокислота удалена. Примерами инсулинотропных фрагментов экзендина-4(1-39) являются экзендин-4(1-38) и экзендин-4(1-31). Инсулинотропное свойство соединения можно определить анализами in vivo или in vitro, хорошо известными из предшествующего уровня техники. Например, соединение можно вводить животному и контролировать концентрацию инсулина в течение времени. Инсулинотропные аналоги экзендина-4(1-39) - это соответствующие молекулы, в которых один или более аминокислотных остатков заменены другими аминокислотными остатками, и/или из которых один или более аминокислотных остатков удалены, и/или в которые один или более аминокислотных остатков добавлены при условии, что указанный аналог либо является инсулинотропным соединением, либо пролекарством инсулинотропного соединения. Примером инсулинотропного аналога экзендина-4(1-39) является Ser²Аsр³-экзендин-4(1-39), в котором аминокислотные остатки в позиции 2 и 3 заменены на серин и аспарагиновую кислоту соответственно (этот конкретный аналог также известен из предшествующего уровня техники как экзендин-3). Инсулинотропными производными экзендина-4(1-39) и его аналогами являются те соединения, которые квалифицированный специалист в данной области считает производными этих пептидов, т.е. имеющими по меньшей мере один заместитель, которого нет в молекуле исходного пептида при условии, что указанное производное либо является инсулинотропным соединением, либо пролекарством инсулинотропного соединения. Примерами заместителей являются амиды, углеводы, алкильные группы, эфиры и липофильные заместители. Примером инсулинотропных производных экзендина-4(1-39) и его аналогов является Tyr³¹-экзендин-4(1-31)-амид.

Используемый здесь термин «стабильное соединение экзендина-4» означает химически модифицированный экзендин-4(1-39), т.е. аналог или производное, которое показывает период полужизни в плазме in vivo в человеке по меньшей мере 10 часов, как определено способом, описанным при определении «стабильного соединения GLP-1».

Используемый здесь термин «дипептидиламинопептидаза IV защищенное соединение экзендина-4» означает соединение экзендина-4, которое является более устойчивым к дипептидиламинопептидазе IV (DPP-IV) в плазме, чем экзендин-4 (SEQ ID NO.2), как определено в ходе анализа, описанного при определении дипептидиламинопептидаза IV защищенного соединения GLP-1.

Используемый здесь термин «изоэлектрическая точка» означает значение рН, при котором полный суммарный заряд макромолекулы, такой как пептид, равен нулю. В пептидах может быть несколько заряженных групп, и в изоэлектрической точке сумма всех этих зарядов равна нулю. При рН выше изоэлектрической точки полный суммарный заряд пептида будет отрицательным, тогда как при рН ниже изоэлектрической точки полный суммарный заряд пептида будет положительным.

Используемый здесь термин «восстановленная», относящийся к фармацевтической композиции, означает водную композицию, которую получали при добавлении воды к твердому материалу, включающему активный фармацевтический компонент. Фармацевтические композиции для восстановления применяют, когда жидкая композиция с приемлемым сроком хранения не может быть изготовлена. Пример восстановленной фармацевтической композиции представляет собой раствор, который получают, добавляя воду к лиофилизированной композиции. Этот раствор часто используют для парентерального введения, и, таким образом, для восстановления твердого материала обычно используют воду для инъекций.

Используемый здесь термин «приблизительно» означает в разумной близости от установленного численного значения, такой как плюс или минус 10%.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции длительного хранения, включающей инсулинотропный пептид, фармацевтически приемлемый консервант, поверхностно-активное вещество полоксамер или полисорбат 20 в концентрации от приблизительно 10 мг/л до приблизительно 400 мг/л, и возможно фармацевтически приемлемый модификатор тоничности, где рН указанной композиции находится в интервале от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,5.

В одном воплощении концентрация поверхностно-активного вещества составляет от приблизительно 20 мг/л до приблизительно 300 мг/л.

В другом воплощении концентрация поверхностно-активного вещества составляет от приблизительно 50 мг/л до приблизительно 200 мг/л.

В другом воплощении концентрация поверхностно-активного вещества составляет от приблизительно 10 мг/л до приблизительно 200 мг/л.

В другом воплощении концентрация поверхностно-активного вещества составляет от приблизительно 50 мг/л до приблизительно 400 мг/л.

В другом воплощении концентрация поверхностно-активного вещества составляет от приблизительно 50 мг/л до приблизительно 300 мг/л.

В другом воплощении поверхностно-активное вещество представляет собой полоксамер 188.

В другом воплощении поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полоксамера 407, полоксамера 124, полоксамера 181, полоксамера 182, полоксамера 237, полоксамера 331 и полоксамера 338.

В другом воплощении поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20.

Одно воплощение изобретения представляет собой композицию, включающую инсулинотропный пептид и алкилполиглюкозид, и возможно фармацевтически приемлемый модификатор тоничности.

Одно воплощение изобретения представляет собой композицию согласно воплощению выше, где рН указанной композиции находится в интервале от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,5.

Одно воплощение изобретения представляет собой композицию согласно любому из воплощений выше, где алкилполиглюкозид присутствует в концентрации от приблизительно 10 мг/л.

Одно воплощение изобретения представляет собой композицию согласно любому из воплощений выше, где алкилполиглюкозид присутствует в концентрации от приблизительно 1000 мг/л.

Одно воплощение изобретения представляет собой композицию согласно любому из воплощений выше, где алкилполиглюкозид присутствует в концентрации от приблизительно 10 мг/л до приблизительно 15000 мг/л.

Одно воплощение изобретения представляет собой композицию согласно любому из воплощений выше, где алкилполиглюкозид присутствует в концентрации от приблизительно 1000 мг/л до приблизительно 10000 мг/л.

Одно воплощение изобретения представляет собой композицию согласно любому из воплощений выше, где алкилполиглюкозид присутствует в концентрации от приблизительно 2000 мг/л до приблизительно 5000 мг/л.

Одно воплощение изобретения представляет собой композицию согласно любому из воплощений выше, где алкилполиглюкозид представляет собой С_10-20-алкилполиглюкозид.

Одно воплощение изобретения представляет собой композицию согласно любому из воплощений выше, где алкилполиглюкозид выбран из додецил-β-D-глюкопиранозида, додецил-β-D-мальтозида, тетрадецил-β-D-глюкопиранозида, децил-β-D-мальтозида, додецил-β-D-мальтозида, тетрадецил-β-D-мальтозида, гексадецил-β-D-мальтозида, децил-β-D-мальтотриозида, додецил-β-D-мальтотриозида, тетрадецил-β-D-мальтотриозида, гексадецил-β-D-мальтотриозида, н-додецил-сахарозы, н-децил-сахарозы.

В другом воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает два разных поверхностно-активных вещества.

В другом воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает два разных поверхностно-активных вещества, где по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество является неионным поверхностно-активным веществом.

В другом воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает два разных поверхностно-активных вещества, где оба разных поверхностно-активных вещества являются неионными поверхностно-активными веществами.

В другом воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает два разных поверхностно-активных вещества, где все поверхностно-активные вещества являются неионными поверхностно-активными веществами.

В другом воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает полоксамер 188 и полисорбат 20.

В другом воплощении изобретения рН фармацевтической композиции находится в интервале от приблизительно 7,4 до приблизительно 8,0.

В другом воплощении изобретения рН фармацевтической композиции находится в интервале от приблизительно 7,4 до приблизительно 8,5.

В другом воплощении изобретения рН фармацевтической композиции находится в интервале от приблизительно 7,7 до приблизительно 8,2.

В другом воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает буфер, который является фосфатным буфером.

В другом воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает буфер, который является цвиттер-ионным буфером.

В другом воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает буфер, который выбран из группы, состоящей из глицил-глицина, TRIS, бицина, HEPES, MOBS, MOPS, TES и их смесей.

В другом воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает модификатор тоничности, выбранный из группы, состоящей из глицерина, пропиленгликоля и маннита.

В другом воплощении фармацевтической композиции изобретения консервант выбран из группы, с