Способ улучшения структуры и/или функций артериол

Способ улучшения структуры и/или функций артериол

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная работа была частично поддержана грантом № HL30568 Национального института сердца, крови и легких Национальных институтов здравоохранения. Правительство Соединенных Штатов Америки может иметь определенные права на данное изобретение.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области сосудистой медицины. В особенности, настоящее изобретение относится к новым способам улучшения структуры и функций артериол и, таким образом, к уменьшению патологий, связанных с нарушением кровообращения.

Уровень техники

В данном контексте артериолы представляют собой кровеносные сосуды в системе артериального кровообращения (не путать с венозным кровообращением), диаметр которых (после фиксации перфузией или in vivo) <200 мкм. В настоящее время существует обширная литература, описывающая изменения в артериолах, связанные с гипертонией, старением, субарахноидальным кровоизлиянием, многоочаговой деменцией, болезнью Альцгеймера и хроническими заболеваниями почек, а также с другими состояниями. Из этой литературы следует, что самые разнообразные патологические состояния могут приводить к утолщению указанных артериол, что, в свою очередь, сопровождается ослаблением нормальной сосудистой активности.

Нормальной реакцией на снижение кровяного давления является расширение кровеносных сосудов, что уменьшает сопротивление потоку крови и позволяет поддерживать нормальный кровоток. Неспособность артериол расширяться несмотря на снижение кровяного давления может привести к уменьшению притока крови к целевому органу. Если целевым органом является мозг, то снижение кровотока может привести к инфаркту области, обеспечиваемой артериолами.

Так как артериолы очень малы, они обычно снабжают маленькую область мозга, и потому связанный с ними инфаркт будет невелик. Он может, вообще, восприниматься как провал в памяти. Однако, по мнению авторов изобретения, накопление серии таких инсультов может со временем привести к значительным повреждениям органов.

Основные способы профилактики таких повреждений органов включают контроль за кровяным давлением, а также за содержанием в плазме глюкозы и липидов. Известно, что некоторые агенты (такие как статины) позволяют улучшить структуру и функцию маленьких и больших артерий; это связывают со способностью таких агентов уменьшать содержание холестерина и снижать инфильтрацию в артерии воспалительных клеток (см., например, Schonbeck et al. (2004) Circulation 109 (21 Suppl 1): 1118-26).

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к неожиданному открытию, согласно которому кровеносные сосуды, размер которых меньше размера самых маленьких артерий (то есть артериолы), способны утолщаться, утрачивать свою функцию и вызывать повреждения тканей в таких непохожих друг на друга органах, как мозг и почки. Настоящее изобретение направлено на способ улучшения структуры и функции артериол и сохранение функций органов-мишеней, таких как мозг и почки.

Таким образом, в соответствии с некоторыми направлениями реализации изобретение относится к способам улучшения структуры и/или функции артериол. Способы, в целом, включают введение нуждающемуся в таком лечении млекопитающему одного или более активных агентов, описанных здесь в целом, в дозе, достаточной для улучшения структуры или функции артериол. В соответствии с различными аспектами изобретения артериола представляет собой артериолу в почке, и/или мозгу, и/или в альвеолах. Млекопитающее может быть представлено человеком, например пациентом, нуждающимся в таком терапевтическом или профилактическом лечении, или животным. Таким образом, рассматриваются как медицинские, так и ветеринарные возможности применения заявки. В соответствии с различными аспектами изобретения млекопитающее может быть представлено человеком с диагностированной потерей памяти, нарушением обучаемости и/или нарушением функции почек и/или нарушением альвеолярной функции (функции легких). В соответствии с некоторыми аспектами изобретения млекопитающее может быть представлено человеком, которому не поставлен диагноз атеросклероза, и/или похожих патологий и который не находится в группе риска этих заболеваний, и/или которого не лечат от атеросклероза и похожих патологий. В соответствии с различными аспектами изобретения доза активного ингредиента (например, пептида, и/или пептидомиметика, и/или липида) представлена в виде дозированной формы. В соответствии с различными аспектами изобретения активный агент (агенты) подготовлен для введения путем, выбранным из группы, включающей пероральное, назальное, ректальное введение, внутрибрюшинные и внутрисосудистые инъекции, подкожное, чрескожное и внутримышечное введение. В соответствии с различными аспектами изобретения способ введения выбран из группы, включающей пероральное, назальное, ректальное введение, внутрибрюшинные и внутрисосудистые инъекции, подкожное, чрескожное и внутримышечное введение. В соответствии с некоторыми аспектами активный агент (агенты) выбран из группы, включающей D4F, L4F, обратный D4F, обратный L4F, D4F с кольцевой перестановкой, L4F с кольцевой перестановкой, обратный D4F с кольцевой перестановкой, обратный L4F с кольцевой перестановкой, а также DMPC (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин). В соответствии с различными аспектами изобретения активный агент (агенты) вводят совместно с фармацевтически приемлемыми наполнителями.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся также к применению активного агента, описанного здесь, для профилактики и лечения нарушения структуры и функций артериол. Это также относится и к применению описанного здесь активного агента для изготовления лекарственных средств, используемых для профилактики и лечения нарушения структуры и функций артериол.

Настоящее изобретение относится также к наборам для лечения состояния, характеризующегося ненормальной структурой или функцией артериол. Обычно, такие наборы включают по меньшей мере один контейнер, содержащий описанные здесь активные агенты, а также инструкции по применению активных агентов для лечения состояний, характеризующихся ненормальной структурой или функцией артериол. В соответствии с различными аспектами изобретения активный агент (например, пептид, и/или пептидомиметик, и/или липид) представлен в виде дозированной единицы. В соответствии с различными аспектами изобретения активный агент (агенты) составлен для введения по пути, выбранному из группы, включающей пероральное, назальное, ректальное введение, внутрибрюшинные и внутрисосудистые инъекции, подкожное, чрескожное и внутримышечное введение. В соответствии с некоторыми аспектами активный агент (агенты) выбран из группы, включающей D4F, L4F, обратный D4F, обратный L4F, D4F с кольцевой перестановкой (кольцевой D4F), L4F с кольцевой перестановкой (кольцевой L4F), обратный D4F с кольцевой перестановкой (обратный кольцевой D4F), обратный L4F с кольцевой перестановкой (обратный кольцевой L4F), а также DMPC. В соответствии с различными аспектами изобретения активный агент (агенты) вводят совместно с фармацевтически приемлемыми наполнителями.

Определения

Термин "выделенный", "очищенный" или "биологически чистый" в отношении выделенного полипептида означает вещество, в основном или в значительной степени отделенное от компонентов, которые в обычных условиях сопровождают его в естественном состоянии. Применительно к нуклеиновым кислотам и/или полипептидам термин может означать нуклеиновые кислоты или полипептиды, не ограниченные по концам последовательностями, которые обычно прикреплены к ним. Химически синтезированные полипептиды являются "выделенными", поскольку они не найдены в естественном состоянии (например, в крови, сыворотке и т.д.). В соответствии с некоторыми аспектами термин "выделенный" показывает, что полипептид не встречается в природе.

Термины "полипептид", "пептид" и "протеин" здесь используются взаимозаменяемо и означают полимер из аминокислотных остатков. Термины применимы к аминокислотным полимерам, в которых по меньшей мере один аминокислотный остаток представляет собой искусственный химический аналог соответствующих природных аминокислот, а также к аминокислотным полимерам, которые встречаются в естественных условиях.

Термин "амфипатический спиральный пептид" означает пептид, содержащий по меньшей мере одну амфипатическую спираль (амфипатический спиральный домен). Некоторые амфипатические спиральные пептиды настоящего изобретения могут содержать две или более (например, 3, 4, 5 и т.д.) амфипатические спирали.

Термин "амфипатическая спираль класса А" означает белковую структуру, образующую α-спираль с разделением полярных и неполярных поверхностей с положительно заряженными остатками, находящимися на полярной-неполярной границе раздела, и с отрицательно заряженными остатками, находящимися в центре полярных поверхностей (см., например, Segrest et at. (1990) Proteins: Structure, Function, and Genetics 8: 103-117).

"Аполипопротеин J" (apo-J) встречается также и под другими названиями, включая кластерин, TRPM2, GP80 и SP 40,40 (Fritz (1995) Рр 112 In: Clusterin: Role in Vertebrate Development, Function, and Adaptation (Harmony JAK Ed.), R.G. Landes, Georgetown, TX). Впервые он был описан как гетеродимерный гликопротеин и компонент белков, секретируемых культуральными клетками Sertoli крыс (Kissinger et al. (1982) Biol Reprod; 27: 233240). Преобразованный продукт представляет собой одноцепочечный предшественник протеина, который подвергается внутриклеточному расщеплению в 34 кДа α-субъединицу и 47 кДа α-субъединицу, которые связаны дисульфидными мостиками (Collard and Griswold (187) Biochem., 26: 3297-3303). Это связано с повреждениями клеток, липидным транспортом и апоптозом и может принимать участие в удалении продуктов распада, образовавшихся в результате повреждений или гибели клеток. Показано, что кластерин имеет высокое сродство для связывания с разнообразными молекулами, включая липиды, пептиды, протеины, а также гидрофобный зонд 1-анилино-8-нафталинсульфонат (Bailey et al. (2001) Biochem., 40: 11828-11840).

Амфипатическая спираль класса G обнаружена в глобулярных протеинах, отсюда и название класса (G = globular, глобулярный). Признаком данного класса амфипатических цепей является случайное распределение положительно и отрицательно заряженных остатков на полярной поверхности, а также узкая неполярная грань. Вследствие узости неполярной поверхности представители этого класса с трудом связываются с фосфолипидами (см., например, Segrest et al. (1990) Proteins: Structure, Function, and Genetics. 8: 103-117; а также Erratum (1991) Proteins: Structure, Function and Genetics, 9: 79). Существует несколько взаимозаменяемых аполипопротеинов, обладающих похожими, но не идентичными характеристиками с G-амфипатической спиралью. Подобно G-амфипатической спирали представители указанного класса характеризуются случайным распределением положительно и отрицательно заряженных остатков на полярной поверхности. Однако в отличие от G-амфипатической спирали с узкой неполярной поверхностью, представители этого класса характеризуется более широкой неполярной поверхностью, что позволяет им легко связывать фосфолипиды, и для обозначения данного отличия этот класс называют G* (см. Segrest et al. (1992) J. Lipid Res., 33: 141-166; а также Anantharamaiah et al. (1993) Pp.109-142 In: The Amphipathic Helix, Epand, R.M. Ed CRC Press, Boca Raton, Florida). В работе Jones et al. (1992) J. Lipid Res. 33: 287-296 описаны компьютерные программы для идентификации и классификации амфипатических спиральных доменов. Эти программы включают, но не ограничиваются программами спирального колеса (WHEEL или WHEEL/SNORKEL), спиральными сетевыми программами (HELNET, HELNET/SNORKEL, HELNET/Angle), программами по присоединению спиральных колес (COMBO или COMBO/SNORKEL), программами для присоединения спиральных сетей (COMNET, COMNET/SNORKEL, COMBO/SELECT, COMBO/NET), консенсусными программами колес (CONSENSUS, CONSENSUS/SNORKEL) и им подобными.

Термин "улучшение" применительно к фразе "улучшение одного или нескольких симптомов атеросклероза" означает ослабление, предотвращение или устранение одного или нескольких симптомов, характеризующих атеросклероз и/или связанные с ним патологии. Такое ослабление включает, без ограничения указанным, устранение или снижение содержания окисленных фосфолипидов, снижение интенсивности образования и отрыва атеросклеротических бляшек, уменьшение числа таких клинических случаев, как сердечные приступы, ангина или инсульты, уменьшение гипертонии, уменьшение биосинтеза воспалительных белков, снижение содержания холестерина в плазме и т.д.

Термин "энантиомерные аминокислоты" означает аминокислоты, способные существовать по меньшей мере в двух формах, являющихся зеркальными отражениями друг друга. Большинство аминокислот (кроме глицина) являются энантиомерными и могут существовать в так называемой L-форме (L аминокислоты) и D-форме (D-аминокислоты). Большинство природных аминокислот является L-аминокислотами. Термины "L-аминокислоты" и "D-аминокислоты" применяют для обозначения абсолютных конфигураций аминокислот, а не конкретного направления вращения плоскости поляризованного света. Эти определения соответствуют терминам, распространенным среди компетентных специалистов в данной области. В настоящей заявке аминокислоты обозначают с использованием стандартных однобуквенных или трехбуквенных кодов, например, приведенных в стандарте Standard ST.25 руководства Handbook On Industrial Property Information and Documentation.

Термин "защитная группа" означает химическую группу, которая, связываясь с функциональной группой аминокислоты (например, с боковой цепочкой, альфа-аминогруппой, альфа-карбоксильной группой и т.д.) блокирует или маскирует свойства этой группы. Предпочтительные амино-терминальные защитные группы включают, без ограничения указанным, ацетильные или аминогруппы. Другие амино-терминальные защитные группы включают, без ограничения указанным, алкильные цепи, как в жирных кислотах, пропионил, формил и другие. Предпочтительные карбоксильные терминальные защитные группы включают, без ограничения указанным, группы, образующие амиды или эфиры.

Фраза "защитить фосфолипид от окисления окисляющим агентом" означает способность соединения уменьшить скорость окисления фосфолипида (или количество образующегося окисленного фосфолипида), если фосфолипид взаимодействует с окислителем (например, с перекисью водорода, 13-(S)-HPODE, 15-(S)-HPETE, HPODE, HPETE, HODE, НЕТЕ и т.д.).

Термин "липопротеины низкой плотности", или ЛПНП (LDL) следует интерпретировать так, как принято среди компетентных специалистов в данной области. В целом, LDL означает комплекс протеина и липидов, который при выделении методом ультрацентрифугирования обнаруживается во фракции с плотностью от 1,019 до 1,063.

Термин "липопротеины высокой плотности", или ЛПВП (HDL) следует интерпретировать так, как принято среди компетентных специалистов в данной области. В целом, HDL означает комплекс протеина и липидов, который при выделении методом ультрацентрифугирования обнаруживается во фракции с плотностью от 1,063 до 1,21.

Термин "HDL группы I" (ЛПВП группы I) означает липопротеины высокой плотности или их компоненты (например, A-I, параоксоназу, ацетилгидролазу фактора активации тромбоцитов и т.д.), которые уменьшают количество окисленных липидов, то есть липопротеинов низкой плотности) или которые защищают окисляемые липиды от окисления окисляющими агентами.

Термин "HDL группы II" (ЛПВП группы II) означает такие HDL, которые проявляют незначительную активность (или не проявляют активности) по защите липидов от окисления или по "починке" (например, восстановлению) окисленных липидов.

Термин "компонент HDL" означает компонент (например, молекулы), включающий в себя липопротеины высокой плотности. Анализ на наличие HDL, защищающих липиды от окисления или исправляющих (например, восстанавливающих) окисленные липиды, включает в себя также и анализ на наличие компонентов HDL (например, апоА-I, параоксоназу, ацетилгидролазу фактора активации тромбоцитов и т.д.), которые проявляют такую активность.

Термин "человеческий пептид апоА-I (ароА-I)" означает человеческий пептид апоА-I полной длины или его фрагмент или домен, который содержит амфипатическую спираль класса А.

"Реакция моноцитов" здесь означает моноцитарную активность, характеризующую воспалительный ответ, который связан с образованием атеросклеротических бляшек. Реакцию моноцитов характеризуют адгезией моноцитов к клеткам сосудистой стенки (например, к клеткам сосудистого эндотелия) и/или хемотаксис в субэндотелиальное пространство и/или дифференциацию моноцитов в макрофаги.

Термин "отсутствие изменений" при использовании в связи с количеством окисленных фосфолипидов означает отсутствие детектируемых изменений, предпочтительно, отсутствие статистически значимых изменений (например, доверительный интервал, по меньшей мере 85%, предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 98% или 99%). Термин может применяться также к анализам, в которых обнаружено, что содержание окисленных фосфолипидов изменяется, но не так сильно, как в отсутствие описанных здесь протеинов, или по сравнению с другими положительными или отрицательными контролями.

Далее будут использованы следующие сокращения: РАРС: L-α-1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин; POVPC: 1-пальмитоил-2-(5-оксовалерил)-sn-глицеро-3-фосфохолин; PGPC: 1-пальмитоил-2-глутарил-sn-глицеро-3-фосфохолин; PEIPC: 1-пальмитоил-2-(5,6-эпоксиизопростан Е₂)-sn-глицеро-3-фосфохолин; ChC18:2: холестериллинолеат; ChC18:2-OOH: холестериллинолеат гидропероксид; DMPC: 1,2-дитетрадеканоил-рац-глицерол-3-фосфохолин; PON: параоксоназа; HPF: стандартизированное поле высокой энергии; РАРС: L-α-1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин; BL/6: C57BL/6J; C3H:C3H/HeJ.

Термин "консервативная замена" применительно к протеинам или пептидам соответствует аминокислотным заменам, которые несущественно изменяют активность (специфичность (например, для липопротеинов) или сродство связывания (например, для липидов или липопротеинов)) молекулы. Как правило, консервативные аминокислотные замены предполагают замену одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком с такими же химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). Каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые, как правило, являются примерами консервативных замен друг для друга: 1) Аланин (А), серин (S), треонин (Т); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (К); 5) изолейцин (I), лейцин (L); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

Термин "идентичный" или "идентичный на указанное число процентов" в контексте сравнения двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей означает две или более последовательности или подпоследовательности, которые одинаковые или обладают указанным процентом одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов, если их сравнивают и выравнивают для достижения максимального соответствия по одному из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или методом визуального контроля. В случае пептидов настоящего изобретения идентичность последовательностей определяется по полной длине пептида.

Как правило, при сравнении последовательностей одна последовательность играет роль последовательности сравнения, с которой сравнивают тестируемые последовательности. В соответствии с алгоритмом сравнения последовательностей тестовую последовательность и последовательность сравнения вводят в компьютер и при необходимости задают координаты подпоследовательностей и параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Основываясь на введенных параметрах, программа реализации алгоритма сравнения вычисляет процент идентичности тестовой последовательности по отношению к последовательности сравнения.

Оптимальное выравнивание последовательностей для их сравнения можно выполнить, например, по алгоритму локальной гомологий (Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)), по алгоритму выравнивания гомологии (Needleman &Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)), по методу поиска сходства (Pearson & Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85: 2444), с использованием компьютеризованной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, и TFASTA программного пакета Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, W1), а также методом визуального контроля (см., в общем случае, работы Ausubel et al., supra).

Примером применимого алгоритма является PILEUP. Программа создает множественное выравнивание для группы родственных последовательностей с использованием прогрессивного, попарного выравнивания, при этом выводятся соотношения последовательностей и процент их идентичности. Программа выводит на экран также "дерево" или "дендрограмму", демонстрирующую отношения кластеризации, используемые для создания выравнивания. PILEUP использует в своей работе упрощенный метод прогрессивного выравнивания (Feng & Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: 351-360). Это метод напоминает описанный в работе Higgins & Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153. С ее помощью можно выровнять до 300 последовательностей длиной до 5000 нуклеотидов или аминокислот каждая. Процедура множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух самых похожих последовательностей, в результате получают кластер двух выровненных последовательностей. Этот кластер затем выравнивают по отношению к следующей наиболее похожей последовательности или кластеру выровненных последовательностей. Для выравнивания двух кластеров последовательностей используют простое расширение метода попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Финальное выравнивание достигается серией прогрессивных попарных выравниваний. Для запуска программы необходимо указать конкретные последовательности и координаты аминокислот и нуклеотидов для областей сравнения, а также различные параметры. Например, для сравнения последовательности сравнения с другой тестовой последовательностью с целью определения отношения процентной идентичности последовательностей необходимо задать следующие параметры: вес пробела по умолчанию (3,00), вес длины пробела по умолчанию и взвешенные концы пробелов.

Другим примером алгоритма, применимого при определении процента идентичности последовательностей и их сходства, является алгоритм BLAST, описанный в работе Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Программное обеспечение, необходимое для BLAST-анализа, доступно широкой общественности в Национальном центре биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)). Программа сначала находит высокоранговые пары последовательностей (HSP). Для этого в последовательности-запросе идентифицируются короткие слова длины W, которые при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных либо точно соответствуют ему, либо удовлетворяют некоторому пороговому значению Т. Т называют пороговым рангом слова соседа. Эти первоначальные слова-соседи затем используются как начальные данные для инициации поисков более длинных содержащих их HSP. Слова удлиняются вдоль каждой последовательности в обоих направлениях так долго, как только можно увеличивать кумулятивный ранг выравнивания. Для подсчета кумулятивных рангов используются (в случае нуклеотидных последовательностей) параметры М (подкрепляющий ранг для пары соответствующих остатков; всегда больше нуля) и N (штрафной ранг для пары несоответствующих остатков; всегда меньше нуля). В случае аминокислотных последовательностей для подсчета кумулятивного ранга используется матрица рангов. Удлинение слов в каждом направлении прекращается, в случае, если кумулятивный ранг опускается ниже максимального значения на величину X; в связи с накоплением одного или нескольких отрицательно ранжированных выравниваний остатков кумулятивный ранг опускается до нуля или ниже; при достижении конца одной из последовательностей. Параметры W, Т и Х алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. Для нуклеотидных последовательностей программа по умолчанию использует длину слова (W), равную 11, ожидание (Е) 10, М=5, N=4, и сравниваются обе цепочки. Для аминокислотных последовательностей длина слова W по умолчанию равна 3, ожидание (Е) 10, а также используется матрица ранжирования BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89: 10915).

Помимо подсчета процента идентичности последовательностей, алгоритм BLAST производит также статистический анализ сходства двух последовательностей (см., например, Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5787). Одной характеристикой сходства, выдаваемой указанным алгоритмом, является мельчайшая вероятность суммы (Р(N)), соответствующая вероятности случайного возникновения соответствия между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеотидная последовательность считается совпадающей с последовательностью сравнения, если мельчайшая вероятность суммы при сравнении тестовой последовательности с последовательностью сравнения меньше, чем, приблизительно, 0,1, более предпочтительно, если меньше, чем, приблизительно, 0,01, наиболее предпочтительно, если меньше, чем, приблизительно, 0,001.

"Кольцевой протеин" - это такой белок, естественные/природные концы которого соединены друг с другом, и образовавшийся кольцевой протеин открыт в какой-либо другой точке для создания новых С- и N-концов. Кольцевые протеины нельзя создать фактическим соединением концов и созданием открытого участка в другом месте, их синтезируют/экспрессируют de novo с помощью последовательности, идентичной соответствующему кольцевому варианту. Два протеина считаются связанными кольцевой перестановкой (СР)), если фрагмент С-терминального участка первого протеина соответствует фрагменту N-терминального участка второго протеина, а фрагмент N-терминального участка первого протеина соответствует фрагменту С-терминального участка второго протеина. Специалисты, компетентные в данной области, знают методы идентификации кольцевых перестановок (см., например, Uliel et al. (1999) Bioinfonnatics, 15(11): 930-936).

Краткое описание чертежей

На фигурах 1А, 1В и 1C показано, что мышь, у которой отсутствуют рецепторы LDL (LDLR-/-), имеет артериолы мозга с более толстыми стенками, по сравнению с мышью дикого типа (WT). Фигура 1А: толщина стенок маленьких артериол (диаметром 15-40 мкм); Фигура 1В: толщина стенок средних артериол (диаметром 41-80 мкм); Фигура 1C: толщина стенок больших артериол (диаметром 81-160 мкм).

На фигуре 2 показаны результаты непрерывного выполнения задачи, требующей выбора альтернативного решения в Т-образном лабиринте (Т-САТ) для мышей LDR-/- на Западной диете, которым давали D4F и "искаженный" D4F ("искаженный" пептид - означает здесь пептид, который состоит из остатков встречающегося в природе пептида или его функционального производного, в котором изменен порядок следования аминокислотных остатков).

На фигуре 3 показаны результаты непрерывного выполнения задачи, требующей выбора альтернативного решения в Т-образном лабиринте (Т-САТ) для мышей LDR-/- на Западной диете, которым давали D4F и "искаженный" D4F (sc D-4F), выраженные в виде процента изменения.

Фигура 4 иллюстрирует улучшение выполнения задачи в Т-образном лабиринте под действием D4F.

На фигуре 5 показано, что пероральное введение DMPC улучшает вазореактивность сосудов у мышей с отсутствующими рецепторами LDL на Западной диете.

На фигурах 6А-6С показано, что толщина стенок артериол мозга (измеренных на секциях Н&Е) увеличена у мышей с отсутствующими рецепторами LDL с обедненным питанием (n=4) по сравнению с мышами дикого типа (n=4), и еще больше увеличивается при переводе мышей на Западную диету (n=4). На фигуре 6А показана толщина стенок артериол с просветом 15-40 мкм диаметром. На фигуре 6В показана толщина стенок артериол с просветом 41-80 мкм диаметром. На фигуре 6С показана толщина стенок артериол с просветом 81-160 мкм диаметром. На гистограмме представлены данные по среднему ± SEM. WT, мышь дикого типа; LDL-/- Chow, мышь с отсутствующими LDL-рецепторами на обедненной диете; LDL-/- Western, мышь с отсутствующими LDL-рецепторами на Западной диете через 6 недель.

На фигурах 7A-7G показано, что толщина стенок артериол мозга (измеренных на секциях Н&Е) уменьшена у мышей с отсутствующими рецепторами LDL, которым давали D-4F, но не "искаженный" D-4F. Мышей с отсутствующими рецепторами LDL 6 недель держали на Западной диете, после чего они получили 300 мкг/мл D-4F в питьевой воде (n=15) или 300 мкг/мл "искаженного" D-4F в питьевой воде (n=15). На фигуре 7А показана толщина стенок артериол с просветом 10-20 мкм диаметром. На фигуре 7В показана толщина стенок артериол с просветом 21-50 мкм диаметром. На фигуре 7С показана толщина стенок артериол с просветом 51-100 мкм диаметром. На фигуре 7D показаны диаметры просветов артериол у мышей. На фигуре 7Е показано значение толщины стенок, поделенное на диаметр просвета для артериол диаметром 10-20 мкм. На фигуре 7F показано значение толщины стенок, поделенное на диаметр просвета для артериол диаметром 21-50 мкм. На фигуре 7G показано значение толщины стенок, деленное на диаметр просвета для артериол диаметром 51-100 мкм. На гистограмме представлено среднее значение ± SEM для 15 мышей в каждой группе.

Как показано на фигурах 8А-8Е, содержание α-актина гладкой мускулатуры артериол мозга увеличено у мышей с отсутствующими рецепторами LDL на Западной диете. Значение этого параметра снижается после лечения D-4F, но не "искаженным" D-4F. Фигура 8А: мышей с отсутствующими рецепторами LDL кормили обедненной пищей (n=10) или держали на Западной диете (n=10) в течение 6 недель, после чего артериолы их мозга были окрашены для определения α-актина гладкой мускулатуры, и для каждой артериолы определили отношение толщины стенки к диаметру просвета. Значения выражены как среднее значение ± SEM для 10 мышей в каждой группе. Фигуры 8В-8Е. Артериолы мозга мышей, описанных на фигуре 7 и Панели А этой фигуры, окрашены для определения ± -актина гладкой мускулатуры. Фигура 8В: Примеры артериол мозга, окрашенных для определения α-актина гладкой мускулатуры. Фигура 8С: отношение толщины стенки к диаметру просвета для артериол с просветом диаметром 10-20 мкм, взятых у мышей, фигура 7. Фигура 8D: отношение толщины стенки к диаметру просвета для артериол с просветом диаметром 21-50 мкм, взятых у мышей, фигура 7. Фигура 8Е: отношение толщины стенки к диаметру просвета для артериол с просветом диаметром 51-100 мкм, взятых у мышей, фигура 7. На гистограмме представлено среднее значение ± SEM для 15 мышей в каждой группе.

На фигурах 9A-9G показаны показатели мышей с отсутствующими рецепторами LDL в Т-образном лабиринте при непрерывном выполнении задачи, требующей выбора альтернативного решения (Т-САТ) в зависимости от диеты и лечения. Фигуры 9A-9D: у мышей, описанных на фигуре 8А, определяли характеристики пространственной памяти на модели Т-САТ. Фигура 9А: Определено число спонтанных чередований. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM для 15 испытаний с 10 мышами в каждой группе. Фигура 9В: Определен процент спонтанных чередований. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM для 15 испытаний с 10 мышами в каждой группе. Фигура 9С: Определена скорость спонтанных чередований, отличающаяся от 50% случайного выбора. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM для 15 испытаний с 10 мышами в каждой группе. Фигура 9D: Определено время, требующееся для завершения испытания. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM для 15 испытаний с 10 мышами в каждой группе. Фигуры 9E-9G: мышей, описанных на фигуре 7 и фигурах 8В-8Е, тестировали на производительность пространственной памяти в соответствии с моделью Т-САТ, как описано выше. Фигура 9Е: Определено число спонтанных чередований. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM для 15 испытаний с 15 мышами в каждой группе. Фигура 9F: Определен процент спонтанных чередований. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM для 15 испытаний с 15 мышами в каждой группе. Фигура 9G: Определена скорость спонтанных чередований, отличающаяся от 50% случайного выбора. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM для 15 испытаний с 15 мышами в каждой группе.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, согласно которому кровеносные сосуды, размер которых меньше размера самых маленьких артерий (то есть артериолы), способны утолщаться, утрачивать свою функцию и вызывать повреждения тканей в таких непохожих друг на друга органах-мишенях, как мозг и почки. Настоящее изобретение относится к способу улучшения структуры и функции артериол и сохранению функций органов-мишеней, таких как мозг и почки.

Авторы изобретения предположили, что нарушения, наблюдаемые в больших артериях, имеют место также и в маленьких артериях и даже в мельчайших кровеносных сосудах, артериолах. Артериолы представляют собой кровеносные сосуды диаметром меньше, приблизительно, 200 мкм, более типично, меньше, приблизительно, 100 мкм. Авторы предположили также, что, если благоприятный эффект ароА-I пептидомиметика (D-4F) наблюдается как в больших артериях (Navab et al. (2002) Circulation, 105: 290-292; Van Lenten et al. (2002) Circulation, 106: 1127-1132), так и в маленьких артериях (Ou et al. (2003) Circulation, 107: 2337-2341), он должен иметь место также и в артериолах. Было также обнаружено, что стенки артериол головного мозга от 10 до 100 мкм диаметром утолщаются у мышей с отсутствующими рецепторами LDL по сравнению с мышами дикого типа, что это утолщение более выражено для Западной диеты, и что оно сопровождается снижением показателей выполнения задачи в Т-образном лабиринте при непрерывном выполнении задачи, требующей выбора альтернативного решения. Увеличение толщины стенок артериол мозга частично обусловлено повышением содержания α-актина гладкой мускулатуры артериол, положение значительно улучшалось при лечении D-4F. Видимо, лечение D-4F мышей с отсутствующими рецепторами LDL, питающихся в соответствии с Западной диетой, снижает толщину стенок артериол мозга независимо от содержания липидов в плазме и от диаметра просвета артериол; при этом также улучшается пространственная память.

Соответственно, предполагается, что использование D-4F, L-4F и других активных агентов описанных здесь пептидов позволяет эффективно улучшить описанную здесь структуру и/или функцию артериол и, таким образом, облегчить один или несколько симптомов состояния, характеризующегося нарушениями структуры и/или функции артериол. Такие состояния включают, например, нарушения неврологической функции (например, связанные с болезнью Альцгеймера, Паркинсона, возрастным ухудшением памяти, ухудшением памяти, вызванным инсультом, болезнью Бенсвангера и т.п.), нарушения функции почек, нарушения функции альвеол и подобные им.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к новым способам улучшения структуры и функции артериол путем введения одного или нескольких агентов, которые изолируют, и/или удаляют, и/или разрушают воспалительные липиды и конвертируют провоспалительные липопротеины высокой плотности (HDL) в противовоспалительные HDL или делают противовоспалительные HDL еще более противовоспалительными. К числу таких активных агентов относятся некоторые пептиды, содержащие амфипатическую спираль класса А (см., например, U.S. Patent 6,664,230, PCT Publications WO 2002/15923, и WO 2004/034977, а также находящиеся на рассмотрении патентные заявки USSN: 09/896,841, 10/187,215, 10/273,386, и 10/423,830, которые включены сюда по ссылке), пептиды, содержащие амфипатическую спираль класса G* (см., например, PCT publication WO 03/086,326, а также находящуюся на рассмотрении патентную заявку US application USSN 10/120,508, которая включена сюда по ссылке), короткие пептиды и непептиды с молекулярным весом меньше 900 дальтон, растворимость которых в этилацетате не превышает 4 мг/мл, которые растворимы в водном буфере при рН 7 и при контакте с фосфолипидами в водной среде образуют частицы диаметром, приблизительно, 7,5 мкм, а также упакованные бислои, размеры которых составляют, приблизительно, от 3,4 до 4,1 мкм, а расстояние между ними в стопе составляет, приблизительно, 2 нм (см., например, PCT/US 2004/026288, находящуюся на рассмотрении патентную заявку U.S. applications USSN 10/649,378, и 10/913,800 и находящуюся на рассмотрении патентную заявку U.S. application USSN 60/600,925, соответственно, которые включены сюда по ссылке); а также пероральные синтетические фосфолипиды, sn-1 и sn-2, положения в которых идентичны и содержат по меньшей мере 3 атома углерода (см., например, находящиеся на рассмотрении патентные заявки U.S. Applications 09/539,569 и 09/994,227, а также заявку РСТ publication WO 01/75168