Белки, слитые с кошачьим аллергеном, и их применение

Белки, слитые с кошачьим аллергеном, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к областям медицины, общественного здравоохранения, иммунологии, молекулярной биологии и вирусологии. В изобретении предложены композиции, содержащие вирусоподобную частицу (ВПЧ) или вирусную частицу и по меньшей мере один антиген, прежде всего по меньшей мере один кошачий антиген, и наиболее конкретно по меньшей мере один кошачий антиген, который является человеческим аллергеном. В конкретных вариантах осуществления изобретения антиген представляет собой антиген Fe1 d1 или его фрагмент, ковалентно связанный с ВПЧ. В изобретении предложены также способы получения композиций. Композиции, предлагаемые в изобретении, индуцируют эффективные иммунные ответы, прежде всего гуморальные иммунные ответы, у млекопитающих, прежде всего у человека. Композиции и способы, предлагаемые в изобретении, можно применять для получения вакцин, предназначенных прежде всего для лечения и/или профилактики аллергии на кошачью перхоть и другие кошачьи антигены и аллергены.

Ссылка на родственные заявки

Домашняя кошка (Felis domesticus) является важным источником аллергенов в помещениях (Lau S. и др., Lancet 356, 2000, cc.1392-1397). Так, кошек содержат примерно в 25% домов в западных странах, и аллергия на кошек обнаружена у значительной части популяции. Серьезность симптомов колеблется от относительно слабого ринита и конъюнктивита до потенциально опасного для жизни обострения астмы.

Хотя в некоторых случаях у пациентов наблюдается сенсибилизация некоторыми другими молекулами кошачьей перхоти и шкуры, основным аллергеном является Fe1 d1 (т.е. аллерген 1 Felis domesticus; ранее обозначали как Cat 1, т.е. кошачий аллерген 1). Важность этого аллергена доказана в многочисленных исследованиях. Фактически более чем у 80% пациентов, страдающих аллергией на кошек, вырабатываются антитела типа IgE на этот сильный аллерген (van Ree R. и др., J. Allergy Clin Immunol 104, 1999, cc.1223-1230).

Fe1 d1 представляет собой кислый гликопротеин с молекулярной массой 35-39 кДа, содержащий 10-20% N-связанных углеводов, и он обнаружен в шкуре, слюне и слезных железах кошек. Он состоит из двух нековалентно связанных гетеродимеров. Каждый гетеродимер состоит из одного пептида, содержащего 70 остатков (обозначен как «цепь 1»), и одного пептида, содержащего 78, 85, 90 или 92 остатка (обозначен как «цепь 2»), которые кодируются различными генами (см. Duffort О.А. и др., Mol Immunol 28, 1991, cc.301-309; Morgenstern J.P. и др., Proc Natl Acad Sci USA 88, 1991, cc.9690-9694 и Griffith I.J. и др., Gene 113, 1992, cc.263-268).

Лечение пациентов, страдающих аллергией на кошек, в настоящее время осуществляют посредством десенсибилизирующей терапии, которая включает повторные инъекции возрастающими дозами либо неочищенного экстракта кошачьей перхоти, либо коротких пептидов, полученных из Fe1 d1. У Lilja с соавторами и Hedlin с соавторами описана программа десенсибилизации, в процессе которой страдающим аллергией на кошек пациентам вводят неочищенные экстракты кошачьей перхоти (Lilja Q и др., J Allergy Clin Immunol 83, 1989, cc.37-44 и Hedlin и др., J Allergy Clin Immunol 87, 1991, cc.955-964). Для осуществления этой программы требуется по меньшей мере 2-3 года, и пациенты после трехлетнего лечения все еще сохраняют системные симптомы. Применение для десенсибилизации коротких пептидов, полученных из Fe1 d1, приводит к несущественным различиям между группой, обработанной пептидов, и группой, обработанной плацебо (Oldfield W.L. и др., Lancet 360, 2002, cc.47-53). Эффективность была обнаружена только тогда, когда пациентам вводили короткий пептид в большом количестве (750 мкг) (Norman P.S. и др., Am J Respir Crit Care Med 154, 1996, cc.1623-1628).

Связанные с аллергией побочные действия, такие как астматические реакции замедленного типа, обнаружены как при лечении неочищенным экстрактом кошачьей перхоти, так и при лечении короткими пептидами. Таким образом, анафилактический шок, вызываемый инъецируемым аллергеном, имеет очень большое значение для безопасности любой программы десенсибилизации. Однако устранение этого явления посредством снижения количества инъецируемого аллергена либо снижает эффективность лечения, либо удлиняет период лечения. Таким образом, в области лечения аллергии на кошек существует большая потребность в альтернативных режимах десенсибилизации и, прежде всего, в режимах десенсибилизации, которые позволяют снижать аллергические симптомы, но не стимулируют связанную с аллергией побочную реакцию.

Краткое изложение сущности изобретения

При создании изобретения неожиданно было установлено, что предлагаемые в изобретении композиции и вакцины соответственно, которые содержат по меньшей мере один антиген Fe1 d1 или его фрагмент, предлагаемый в изобретении, не только не обладают способностью индуцировать иммунные ответы на Fe1 d1 и прежде всего гуморальные иммунные ответы, но также могут оказывать десенсибилизирующее действие на пациента, страдающего аллергией на кошек, и, в частности, при кратковременном использовании, выявлена высокая эффективность предлагаемых в изобретении композиций и вакцин соответственно. Кроме того, при создании изобретения неожиданно было установлено, что Fe1 d1, предлагаемый в изобретении, когда его ковалентно связывают с ВПЧ, предлагаемой в изобретении, обладает резко пониженной анафилактической активностью по сравнению с Fe1 d1, предлагаемым в изобретении, не связанным ковалентно с ВПЧ, сохраняя при этом высокую степень антигенности и иммуногенности. Это является важным преимуществом по сравнению с известными из прототипов схемами лечения аллергии на кошек, поскольку предлагаемые в изобретении композиции и вакцины соответственно резко снижают риск возникновения анафилактического шока у иммунизированных животных и людей. Кроме того, предлагаемые в изобретении композиции и вакцины соответственно позволяют применять антиген в существенно более высоких дозах по сравнению с дозами, которые применяли в известных из прототипов схемах лечения аллергии на кошек, что, в свою очередь, может повышать эффективность и/или укорачивать всю программу десенсибилизации. Таким образом, предлагаемые в изобретении композиции и вакцины соответственно индуцируют сильные иммунные ответы против Fe1 d1, но не стимулируют аллергическую реакцию.

Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая (а) коровую частицу, которая несет по меньшей мере один первый сайт присоединения, где коровая частица представляет собой вирусоподобную частицу (ВПЧ) или вирусную частицу; и (б) по меньшей мере один антиген, который несет по меньшей мере один второй сайт присоединения, где по меньшей мере один антиген представляет собой белок Fe1 d1 или фрагмент Fe1 d1, и где (а) и (б) ковалентно связаны через по меньшей мере один первый и по меньшей мере один второй сайт присоединения, предпочтительно с образованием упорядоченного и повторяющегося набора антигенов. Другим объектом настоящего изобретения является композиция вакцины. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу введения композиции вакцины человеку или млекопитающему кроме человека, такому как собака, которые страдают аллергией на кошек, предпочтительно на кошачий Fe1 d1. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения в состав вакцины входит также по меньшей мере один адъювант. Однако композиция вакцины, предлагаемая в изобретении, обладает способностью индуцировать сильный иммунный ответ, прежде всего гуморальный иммунный ответ, и при отсутствии по меньшей мере одного адъюванта. Таким образом, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения в вакцине отсутствует адъювант. Отказ от применения адъюванта может снижать вероятность возникновения возможных побочных действий, связанных с применением адъювантов.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения ВПЧ, входящую в состав композиции и композиции вакцины соответственно, получают рекомбинантно в хозяине, и ВПЧ практически свободна от РНК хозяина, предпочтительно свободна от нуклеиновых кислот хозяина. Снижение или предпочтительно элиминация нуклеиновых кислот хозяина, предпочтительно отсутствие нуклеиновых кислот хозяина, является важным устранения нежелательных Т-клеточных ответов, а также других нежелательных побочных действий, таких как лихорадка.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения композиция, предлагаемая в изобретении, содержит также по меньшей мере одну иммуностимулирующую субстанцию, предпочтительно по меньшей мере одну иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту упаковывают внутрь ВПЧ, предлагаемой в изобретении. Введение иммуностимулирующих субстанций, предпочтительно иммуностимулирующих нуклеиновых кислот, в композицию, предлагаемую в изобретении, может сдвигать иммунные ответы в сторону Th1-ответов и тем самым подавлять Th2-ответы и, как следствие, производство IgE.

Одним из объектов настоящего изобретения является способ лечения аллергии на кошек, заключающийся в том, что индивидууму, который страдает аллергией на кошек, предпочтительно человеку, вводят предлагаемую в изобретении композицию или вакцину соответственно.

Следующим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая композицию, предлагаемую в изобретении, и приемлемый фармацевтический носитель.

И еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения предлагаемой в изобретении композиции, заключающийся в том, что (а) получают коровую частицу, которая несет по меньшей мере один первый сайт присоединения, где коровая частица представляет собой вирусоподобную частицу (ВПЧ) или вирусную частицу; и (б) получают по меньшей мере один антиген, который несет по меньшей мере один второй сайт присоединения, где по меньшей мере один антиген представляет собой белок Fe1 d1 или фрагмент Fe1 d1, и (в) объединяют коровую частицу и по меньшей мере один антиген с получением композиции, где по меньшей мере один антиген и коровая частица связаны с помощью по меньшей мере одного первого и по меньшей мере одного второго сайтов присоединения.

Один из объектов изобретения является слитый белок Fe1 d1, который содержит цепь 1 Fe1 d1 и цепь 2 Fe1 d1, слитые через аминокислотный спейсер, который связывает N-конец одной цепи с С-концом другой цепи, где аминокислотный спейсер состоит из 10-30 аминокислотных остатков и где слитый белок получают в Е.coli или где слитый белок не является гликозилированным.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - окрашенные кумасси очищенные и ренатурированные слитые белки Fe1 d1 при электрофорезе в ДСН-ПААГ при использовании невосстанавливающих гелей. В образцы, представленные в полосе 1, был добавлен дитиотреитол (ДТТ) в качестве восстановителя. В образцы, представленные в полосе 2, ДТТ не добавляли;

на фиг.2 - дегрануляция базофилов при использовании либо только слитых белков Fe1 d1, либо слитых белков Fe1 d1, связанных с Qβ. По оси абсцисс отложена концентрация соответствующего белка Fe1 d1. По оси ординат отложен процент базофилов, подвергшихся дегрануляции;

на фиг.3 - результаты инъекционной кожной пробы добровольца, страдающего аллергией на кошек, которому вводили Qβ-FELD1 в день 0, 7 и 14 и проводили также пробы в день 0, 14 и 21;

на фиг.4А - балл при использовании возрастающих назальных доз и общий назальный балл (фиг.4Б) для добровольца, страдающего аллергией на кошек, которому вводили Qβ-FELD1 в день 0, 7 и 14 и проводили также пробы в день 0, 14 и 21.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, все технические и научные понятия, употребляемые в настоящем описании, имеют общепринятые значения, очевидные специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение.

Адъювант: Понятие «адъювант» в контексте настоящего описания относится к неспецифическим стимуляторам иммунного ответа или субстанциям, которые обеспечивают образование депо в хозяине, и при объединении с предлагаемыми в настоящем изобретении вакциной и фармацевтической композицией соответственно могут еще в большей степени усиливать иммунный ответ. Можно применять различные адъюванты. Их примерами являются полный и неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия и модифицированный мурамилдипептид. Кроме того, адъювантами являются минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол, и адъюванты, которые потенциально можно применять для введения человеку, такие как БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Такие адъюванты также хорошо известны в данной области. Другие адъюванты, которые можно вводить в сочетании с композициями, предлагаемыми в изобретении, включают (но не ограничиваясь ими) монофосфорильный липидный иммуномодулятор, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, соли алюминия (квасцы), MF-59, ОМ-174, ОМ-197, ОМ-294 и адъювант, применяемый в Virosomal -технологии (вирус-липосомной вакцине). Адъюванты могут представлять собой также смеси этих соединений. Как правило, ВПЧ представляет собой адъювант. Однако, когда понятие «адъювант» упоминается в контексте настоящего описания, то оно относится к адъюванту, который не является ВПЧ, применяемой в композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, но который добавлен к ВПЧ.

Антиген: В контексте настоящего описания понятие «антиген» относится к молекуле, которая обладает способностью связываться с антителом или Т-клеточным рецептором (ТКР), если презентируется с помощью молекул ГКГ. Понятие «антиген» в контексте настоящего описания включает также Т-клеточные эпитопы. Кроме того, антиген обладает способностью распознаваться иммунной системой и/или обладает способностью индуцировать гуморальный иммунный ответ и/или клеточный иммунный ответ, что приводит к активации В- и/или Т-лимфоцитов. Однако по меньшей мере в некоторых случаях, антиген может содержать или быть связанным с Th-клеточным эпитопом и использоваться в адъюванте. Антиген может нести один или несколько эпитопов (В- и Т-эпитопы). Описанная выше специфическая реакция подразумевает, что антиген должен предпочтительно реагировать, как правило, с высокой степенью избирательности, с соответствующим ему антителом или ТКР и не вступать в реакцию с множеством других антител или ТКР, которые могут вырабатываться в ответ на другие антигены. В контексте настоящего описания антигены могут представлять также смеси нескольких индивидуальных антигенов.

Антигенная детерминанта: Понятие «антигенная детерминанта» и «антигенный эпитоп», которые в контексте настоящего описания используются взаимозаменяемо, относится к непрерывным или прерывистым областям полипептида, которые могут иммуноспецифически связываться с антителом или Т-клеточным рецептором в контексте молекулы ГКГ. Иммуноспецифическое связывание исключает неспецифическое связывание, но не обязательно исключает перекрестную реактивность. Антигенная детерминанта, как правило, содержит 5-10 аминокислот в пространственной конформации, которая является уникальной для антигенной детерминанты.

Ассоциированный: Понятие «ассоциированный» (или соответствующее ему существительное ассоциация) в контексте настоящего описания относится ко всем возможным путям, предпочтительно химическим взаимодействиям, с помощью которых две молекулы соединяются друг с другом. Химические взаимодействия включают ковалентные и нековалентные взаимодействия Типичными примерами нековалентых взаимодействий являются ионные взаимодействия, гидрофобные взаимодействия или водородные связи, где основой ковалентных взаимодействий являются, например, ковалентные связи, такие как сложноэфирные связи, связи, образованные с помощью простого эфира, сложного фосфоэфира, амидные, пептидные связи, связи типа углерод-фосфор, связи типа углерод-сера, такие как тиоэфирные связи, или имидные связи.

Сайт присоединения, первый: в контексте настоящего описания понятие «первый сайт присоединения» относится к элементу, который встречается в естественных условиях в ВПЧ или который искусственно добавляют к ВПЧ, и с которым может связываться второй сайт присоединения. Первый сайт присоединения может представлять собой белок, полипептид, аминокислоту, пептид, сахар, полинуклеотид, природный или синтетический полимер, вторичный метаболит или соединение (биотин, флуоресцеин, ретинол, дигоксигенин, ионы металлов, фенилметилсульфонилфторид), или химически реактивную группу, такую как аминогруппа, карбоксильная группа, сульфгидрильная группа, гидроксильная группа, гуанидинильная группа, гистидинильная группа, или их комбинацию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения химически реактивная группа в качестве первого сайта присоединения представляет собой аминогруппу аминокислоты, такой как лизин. Первый сайт присоединения локализован, как правило, на поверхности, и предпочтительно на наружной поверхности ВПЧ. Множество первых сайтов присоединения присутствует на поверхности, предпочтительно на наружной поверхности вирусоподобной частицы, как правило, они имеют повторяющуюся конфигурацию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения первый сайт присоединения ассоциирован с ВПЧ с помощью по меньшей мере одной ковалентной связи, предпочтительно с помощью по меньшей мере одной пептидной связи. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения первый сайт присоединения представляет собой сайт, встречающийся в естественных условиях в ВПЧ. В другом варианте первый сайт присоединения искусственно добавляют к ВПЧ.

Сайт присоединения, второй: в контексте настоящего описания понятие «второй сайт присоединения» относится к элементу, который встречается в естественных условиях в сочетании с Fe1 d1, предлагаемым в настоящем изобретении, или который искусственно добавлен к нему, и с которым может связываться первый сайт присоединения. Второй сайт присоединения Fe1 d1, предлагаемого в изобретении, может представлять собой белок, полипептид, пептид, аминокислоту, сахар, полинуклеотид, природный или синтетический полимер, вторичный метаболит или соединение (биотин, флуоресцеин, ретинол, дигоксигенин, ионы металлов, фенилметилсульфонилфторид), или химически реактивную группу, такую как аминогруппа, карбоксильная группа, сульфгидрильная группа, гидроксильная группа, гуанидинильная группа, гистидинильная группа, или их комбинацию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения химически реактивная группа в качестве второго сайта присоединения представляет собой сульфгидрильную группу аминокислоты, такой как цистеин. Таким образом, понятие «белок Fe1 d1, несущий по меньший мере один второй сайт присоединения» относится к конструкции, содержащей Fe1 d1, предлагаемый в изобретении, и по меньшей мере один второй сайт присоединения. Однако в случае второго сайта присоединения, который не встречается в естественных условиях в сочетании с Fe1 d1, такая конструкция, как правило и предпочтительно, дополнительно, содержит «линкер». В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения второй сайт присоединения ассоциирован с Fe1 d1, предлагаемым в изобретении, с помощью по меньшей мере одной ковалентной связи, предпочтительно через с помощью по меньшей мере одной пептидной связи. В другом варианте осуществления изобретения второй сайт присоединения представляет собой сайт, встречающийся в естественных условиях в Fe1 d1, предлагаемом в изобретении. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения второй сайт присоединения искусственно добавляют к Fe1 d1, предлагаемому в изобретении, через аминокислотный линкер, предпочтительно содержащий цистеин. Предпочтительно линкер сливают с Fe1 d1, предлагаемым в изобретении, пептидной связью.

Оболочечный белок: В контексте настоящего описания понятие «оболочечный белок» и понятие «капсидный белок», которые используются взаимозаменяемо в контексте настоящего описания, относятся к вирусному белку, предпочтительно субъединице встречающегося в естественных условиях капсида вируса, предпочтительно РНК содержащего фага, который можно включать в вирусный капсид или ВПЧ.

Fe1 d1, предлагаемый в изобретении: Понятие «Fe1 d1, предлагаемый в изобретении» в контексте настоящего описания относится по меньшей мере к одному белку Fe1 d1 или по меньшей мере одному фрагменту Fe1 d.

Цепь 1 Fe1 d1: Понятие «цепь 1 Fe1 d1» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, который содержит или в другом варианте состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:22, или гомологичной ей последовательности. Понятие «последовательность, гомологичная SEQ ID NO:22» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, который идентичен SEQ ID NO:22 более чем на 70%, предпочтительно более чем на 80%, более предпочтительно более чем на 90% и еще более предпочтительно более чем на 95%. Понятие «цепь 1 Fe1 d1» в контексте настоящего описания относится также к полипептиду, который несет по меньшей мере одну пост-трансляционную модификацию, включающую (но, не ограничиваясь ими) по меньшей мере одно гликозилирование цепи 1 Fe1 d1, как она определена в настоящем описании. Предпочтительно цепь 1 Fe1 d1, как она определена в настоящем описании, состоит в целом максимум из 130, еще более предпочтительно максимум из 100 аминокислот.

Цепь 2 Fe1 d1: Понятие «цепь 2 Fe1 d1» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, который содержит или в другом варианте состоит из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:26, или гомологичной ей последовательности. Понятие «последовательность, гомологичная SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:26» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, который идентичен SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:26 более чем на 70%, предпочтительно более чем на 80%, более предпочтительно более чем на 90% и еще более предпочтительно более чем на 95%. Понятие «цепь 2 Fe1 d1» в контексте настоящего описания относится также к полипептиду, который несет по меньшей мере одну пост-трансляционную модификацию, включающую (но, не ограничиваясь ими) по меньшей мере одно гликозилирование цепи 2 Fe1 d1, как она определена в настоящем описании. Предпочтительно цепь 2 Fe1 d1, как она определена в настоящем описании, состоит в целом максимум из 150, еще более предпочтительно максимум из 130 и еще более предпочтительно максимум из 100 аминокислот.

Белок Fe1 d1: Понятие «белок Fe1 d1» в контексте настоящего описания относится к белку, который содержит или в другом варианте состоит из цепи 1 Fe1 d1 и цепи 2 Fe1 d1. Предпочтительно цепь 1 Fe1 d1 и цепь 2 Fe1 d1 связаны ковалентно. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения цепь 1 Fe1 d1 и цепь 2 Fe1 d1 связаны с помощью по меньшей одной дисульфидной связи. В другом варианте осуществления изобретения цепь 1 и цепь 2 слиты непосредственно или с помощью спейсера, в этом случае белок Fe1 d1 дополнительно содержит или в другом варианте представляет собой спейсер. Предпочтительно белок Fe1 d1, как он определен в настоящем описании, состоит в целом максимум из 300, еще более предпочтительно максимум из 200 аминокислот. Как правило и предпочтительно, белок Fe1 d1, предлагаемый в изобретении, обладает способностью индуцировать in vivo производство антитела, которое специфически связывается либо с встречающимся в естественных условиях Fe1 d1, либо с рекомбинантным Fe1 d1, который получают согласно методу, описанному в примере 5 настоящего описания.

Фрагмент Fe1 d1: Понятие «фрагмент Fe1 d1» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, который содержит или в другом варианте состоит по меньшей мере из одной антигенной детерминанты Fe1 d1. Как правило и предпочтительно, понятие «фрагмент Fe1 d1» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, который содержит или в другом варианте состоит по меньшей мере из двух антигенных детерминант Fe1 d1. Предпочтительно антигенные детерминанты ковалентно связаны, предпочтительно также антигенные детерминанты связаны с помощью по меньшей мере одной пептидной связи, в этом случае может требоваться спейсер между антигенными детерминантами. Предпочтительно по меньшей мере две антигенные детерминанты обе получают из цепи 1 Fe1 d1 и из цепи 2 Fe1 d1. Предпочтительно фрагмент Fe1 d1, как он определен в настоящем описании, состоит в целом максимум из 130, еще более предпочтительно максимум из 100 и еще более предпочтительно из 60 аминокислот. Как правило и предпочтительно, фрагмент Fe1 d1, предлагаемый в изобретении, обладает способностью индуцировать in vivo производство антитела, которое специфически связывается либо с встречающимся в естественных условиях Fe1 d1, либо с рекомбинантным Fe1 d1, который получают согласно методу, описанному в примере 5 настоящего описания.

Связанный: Понятие «связанный» (или существительное: связь) в контексте настоящего описания относится ко всем возможным путям, предпочтительно химическим взаимодействиям, с помощью которых соединяют вместе по меньшей мере один первый сайт присоединения и по меньшей мере один второй сайт присоединения. Химические взаимодействия представляют собой ковалентные и нековалентные взаимодействия. Типичными примерами нековалентных взаимодействий являются ионные взаимодействия, гидрофобные взаимодействия или водородные связи, в то время как ковалентные взаимодействия базируются, например, на ковалентных связях, таких как сложноэфирные связи, связи, образованные с помощью простого эфира, сложного фосфоэфира, амидные, пептидные, связи типа углерод-фосфор, связи типа углерод-сера, такие как тиоэфирные связи, или имидные связи. В конкретных предпочтительных вариантах осуществления изобретения первый сайт присоединения и второй сайт присоединения связывают с помощью по меньшей мере одной ковалентной связи, предпочтительно с помощью по меньшей мере одной непептидной связи и еще более предпочтительно с помощью только непептидной(ых) связи(ей). Однако понятие «связанный» в контексте настоящего описания не относится только к непосредственному связыванию по меньшей мере одного первого сайта присоединения и по меньшей мере одного второго сайта присоединения, но в другом варианте и предпочтительно относится к опосредованному связыванию по меньшей мере одного первого сайта присоединения и по меньшей мере одного второго сайта присоединения через промежуточную(ые) молекулу(ы), и для их создания, как правило и предпочтительно, используют по меньшей мере один, предпочтительно один, гетеробифункциональный перекрестносшивающий агент.

Линкер: «Линкер» в контексте настоящего описания либо ассоциирует второй сайт присоединения с Fe1 d1, предлагаемым в изобретении, или уже содержит, практически состоит или состоит из второго сайта присоединения. Предпочтительно «линкер» в контексте настоящего описания уже содержит второй сайт присоединения, как правило, но не обязательно, в виде одного аминокислотного остатка, предпочтительно остатка цистеина. Понятие «линкер» в контексте настоящего описания обозначают также как «аминокислотный линкер», прежде всего, когда линкер, предлагаемый в изобретении, содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток. Таким образом, понятия «линкер» и «аминокислотный линкер» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо. Однако не предусматривается, что линкер состоит только из аминокислотных остатков, даже, если состоящий из аминокислотных остатков линкер является предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. Аминокислотные остатки линкера предпочтительно представляют собой встречающиеся в естественных условиях аминокислоты или не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты, известные в данной области, включая их полностью L- или полностью D-изомеры и их смеси. Другими предпочтительными вариантами линкера, предлагаемого в настоящем изобретении, являются молекулы, содержащие сульфгидрильную группу или цистеиновый остаток, и, следовательно, такие молекулы также подпадают под объем изобретения. Другие линкеры, которые можно применять согласно настоящему изобретению, представляют собой молекулы, содержащие С₁-С₆алкильный, циклоалкильный, такой как циклопентильный или циклогексильный, циклоалкенильный, арильный или гетероарильный фрагмент. Однако линкеры, содержащие предпочтительно C₁-С₆алкильный, циклоалкильный (C₅, C₆), арильный или гетероарильный фрагмент и дополнительную(ые) аминокислоту(ы), можно применять также в качестве линкеров, предлагаемых в настоящем изобретении, и они подпадают под объем настоящего изобретения. Ассоциацию линкера с Fe1 d1, предлагаемым в изобретении, предпочтительно осуществляют с помощью по меньшей мере одной ковалентной связи, более предпочтительно по меньшей мере одной пептидной связи.

Упорядоченный и повторяющийся набор антигенов: В контексте настоящего описания понятие «упорядоченный и повторяющийся набор антигенов», в целом, относится к повторяющейся организации антигенов, как правило и предпочтительно, отличающейся единообразным пространственным расположением антигенов относительно вирусоподобной частицы. В одном из вариантов осуществления изобретения повторяющаяся организация может представлять собой геометрическую организацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие антигены, сшитые с ВПЧ РНК содержащих фагов, являются типичными и предпочтительными примерами приемлемых упорядоченных и повторяющихся наборов антигенов, которые, кроме того, имеют точно повторяющиеся паракристаллические схемы расположения антигенов, предпочтительно с интервалами от 1 до 30 нм, предпочтительно от 2 до 15 нм, еще более предпочтительно от 2 до 10 нм и еще более предпочтительно от 2 до 8 нм, и наиболее предпочтительно от 1,6 до 7 нм.

Упакованная: Понятие «упакованная» в контексте настоящего описания относится к состоянию полианионной макромолекулы или иммуностимулирующих субстанций относительно ВПЧ. Понятие «упакованная» в контексте настоящего описания включает связывание, которое может быть ковалентным, например, путем химического сочетания, или нековалентным, например, путем ионных взаимодействий, гидрофобных взаимодействий, водородных связей и т.д. Понятие «упакованная» относится к включению или частичному включению полианионной макромолекулы. Так, полианионную макромолекулу или иммуностимулирующие субстанции можно включать в ВПЧ без осуществления фактического связывания, в частности с помощью ковалентной связи. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одну полианионную макромолекулу или иммуностимулирующие субстанции упаковывают внутрь ВПЧ, наиболее предпочтительно нековалентно.

Спейсер: Понятие «спейсер», а также эквивалентное ему понятие «аминокислотный спейсер» в контексте настоящего описания относится к участку аминокислотной последовательности, который состоит не более чем из 30 аминокислот и который связывает N-конец одной цепи с С-концом другой цепи Fe1 d1.

Вирусная частица: Понятие «вирусная частица» в контексте настоящего описания относится к морфологической форме вируса. Для некоторых типов вирусов она представляет собой геном, окруженный белковым капсидом; другие типы вирусов имеют дополнительные структуры (например, оболочки, хвосты и т.д.).

Вирусоподобная частица (ВПЧ) в контексте настоящего описания относится к нерепликативной или неинфекционной, предпочтительно нерепликативной и неинфекционной, вирусной частице, или относится к нереплекативной или неинфекционной, предпочтительно нерепликативной и неинфекционной, структуре, напоминающей вирусную частицу, предпочтительно капсид вируса. Понятие «нерепликативный» в контексте настоящего описания обозначает отсутствие у генома, входящего в ВПЧ, способности к репликации. Понятие «неинфекционный» в контексте настоящего описания обозначает неспособность проникать в клетку-хозяина. Предпочтительно вирусоподобная частица, предлагаемая в изобретении, является нерепликативной и/или неинфекционной, поскольку у нее отсутствуют полностью или частично вирусный геном или функции генома. В одном из вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой вирусную частицу, в которой вирусный геном инактивирован физически или химически. Как правило и более предпочтительно, у вирусоподобной частицы отсутствуют все или часть репликативных и инфекционных компонентов вирусного генома. Вирусоподобная частица, предлагаемая в изобретении, может содержать нуклеиновую кислоту из генома, отличного от ее генома. Обычным и предпочтительным вариантом вирусоподобной частицы, предлагаемой в настоящем изобретении, является вирусный капсид, такой как вирусный капсид соответствующего вируса, бактериофага, предпочтительно РНК содержащего фага. Понятия «вирусный капсид» или «капсид» означают макромолекулярную структуру, состоящую из субъединиц вирусного белка. Как правило, она состоит из 60, 120, 180, 240, 300, 360 и более субъединиц вирусного белка. Как правило и предпочтительно, взаимодействия этих субъединиц приводят к формированию вирусного капсида или напоминающей вирусной капсид структуры с присущей ей повторяющейся организацией, при этом структура, как правило, является сферической или трубчатой. Например, капсиды РНК содержащих фагов или HbcAg (внутренний (коровый) антиген вируса гепатита В) имеют сферическую форму, обладающую икосаэдральной симметрией. Понятие «капсидоподобная структура» в контексте настоящего описания относится к макромолекулярной структуре, состоящей из субъединиц вирусного белка, которая имеет морфологическое строение, сходное с капсидом, как он определен выше, но не имеет характерного симметричного строения, сохраняя при этом достаточную упорядоченность и частоту встречаемости.

Одним из общих признаков вирусной частицы и вирусоподобной частицы является высокий уровень упорядоченности и повторяющаяся структура их субъединиц.

Вирусоподобная частица РНК содержащего фага: В контексте настоящего описания понятие «вирусоподобная частица РНК содержащего фага» относится к вирусоподобной частице, содержащей или предпочтительно практически состоящей или состоящей из оболочечных белков, их мутантов или фрагментов РНК содержащего фага. Кроме того, вирусоподобная частица РНК содержащего фага, имея структуру РНК содержащего фага, является нерепликативной или неинфекционной, и, как правило, у нее отсутствуют ген или гены, кодирующие комплекс репликации РНК содержащего фага, и, как правило, она лишена также гена или генов, кодирующих белок или белки, которые ответственны за связывание вируса с хозяином или за проникновение в хозяина. Однако под это определение подпадают также вирусоподобные частицы РНКовых фагов, в которых вышеупомянутый(ые) ген или гены еще присутствуют, но являются неактивными, и вследствие этого такие частицы также представляют собой нерепликативные и неинфекционные вирусоподобные частицы РНК содержащего фага. Предпочтительные ВПЧ, полученные из РНКовых фагов, обладают икосаэдральной симметрией и состоят из 180 субъединиц. В контексте настоящего описания понятие «субъединица» и «мономер» используют взаимозаменяемо, и они являются эквивалентными. В контексте настоящего описания понятие «РНК содержащий фаг» и понятие «РНК содержащий бактериофаг» используют взаимозаменяемо. Предпочтительными методами, с помощью которых вирусоподобную частицу РНК содержащего фага можно сделать нерепликативной и/или неинфекционной являются физическая, химическая инактивация, такая как УФ-облучение или обработка формальдегидом, как правило и предпочтительно, методы генной инженерии.

Один или несколько: В контексте настоящего описания упоминание единственного числа может обозначать «по меньшей мере один» или «один или несколько», если не указано иное.

Идентичность аминокислотных последовательностей полипептидов можно определять общепринятым методом с помощью известных компьютерных программ, таких как программа Bestfit. При использовании программы Bestfit или любой другой программы для сравнительного анализа последо