Стабильные и растворимые антитела, ингибирующие tnf

Стабильные и растворимые антитела, ингибирующие tnf

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к оптимизированным антителам и производным антител, которые связываются с фактором некроза опухолей альфа (TNFα) и блокируют функцию фактора некроза опухолей альфа и применимы для диагностики и/или лечения, предупреждения или уменьшения интенсивности симптомов TNFα-ассоциированных заболеваний; их кодирующим последовательностям, получению и применению в фармакологически подходящих композициях.

Уровень техники

Фактор некроза опухолей альфа (TNFα, также известный как кахектин) является природно-встречающимся цитокином млекопитающих, продуцируемым многочисленными типами клеток, в том числе моноцитами и макрофагами, в ответ на эндотоксин или другие стимулы. TNFα является основным медиатором воспалительных, иммунологических и патофизиологических реакций (Grell, M., et аl. (1995) Cell, 83: 793-802).

Растворимый TNFa образуется расщеплением трансмембранного белка-предшественника (Kriegler, et аl. (1988) Cell 53: 45-53) и сборкой секретированных полипептидов 17 кДа в растворимые гомотримерные комплексы (Smith, et аl. (1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; в отношении обзоров по TNF см. Butler, et аl. (1986), Nature 320: 584; Old (1986), Science 230: 630). Эти комплексы затем связываются с рецепторами, обнаруженными на различных клетках. Связывание производит ряд провоспалительных эффектов, в том числе: (i) высвобождение других провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины (IL) IL-6, IL-8 и IL-1, (ii) высвобождение матриксных металлопротеиназ и (iii) положительная регуляция экспрессии эндотелиальных молекул адгезии, дополнительно усиливая воспалительный и иммунный каскад аттрагированием лейкоцитов в экстраваскулярные ткани.

Большое число нарушений ассоциированы с повышенными уровнями TNFα, причем многие из них являются существенно важными с медицинской точки зрения. Было показано, что TNFα положительно регулируется в ряде заболеваний человека, в том числе в хронических заболеваниях человека, таких как ревматоидный артрит (RA), воспалительные нарушения пищеварительного тракта, в том числе болезнь Крона и язвенный колит, в сепсисе, застойной сердечной недостаточности, бронхиальной астме и рассеянном склерозе. Мыши, трансгенные в отношении TNFα человека, продуцируют высокие уровни TNFα конститутивно и развивают самопроизвольный деструктивный полиартрит, сходный с RA (Keffer et al. 1991, EMBO J., 10, 4025-4031). Таким образом, TNFα называют провоспалительным цитокином.

TNFα хорошо установлен в настоящее время в качестве ключевого фактора в патогенезе ревматоидного артрита (RA), который является хроническим, прогрессирующим и изнуряющим заболеванием, характеризующимся многосуставным воспалением и деструкцией суставов, с системными симптомами недомогания и усталости. RA часто приводит к хроническому синовиальному воспалению с частым прогрессированием до деструкции суставного хряща и костей. Увеличенные уровни TNFα обнаружены как в синовиальной жидкости, так и в периферической крови пациентов, страдающих от ревматоидного артрита (RA). При введении блокирующих TNFα-агентов пациентам, страдающим от RA, они уменьшают воспаление, улучшают симптомы и задерживают повреждение сустава (McKown et аl. (1999), Arthritis Rheum. 42: 1204-1208).

Физиологически TNFα ассоциирован также с защитой от конкретных инфекций (Cerami et al. (1988), Immunol. Today 9:29). TNFα высвобождается макрофагами, которые были активированы липополисахаридами грамотрицательных бактерий. Как таковой, TNFα является, по-видимому, эндогенным медиатором первостепенной важности, участвующим в развитии и патогенезе эндотоксинового (бактериально-токсического) шока, связанного с бактериальным сепсисом (Michie, et аl. (1989), Br. J. Surg. 76: 670-671; Debets et аl. (1989), Second Vienna Shock Forum, p.463-466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage et al. (1987) Lancet 1: 355-357; Hammerle et al. (1989) Second Vienna Shock Forum, p.715-718; Debats et al. (1989), Crit. Care Clin. 17: 489-497; Calandra et al. (1990), J. Infect. Dis. 161: 982-987; Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123: 162-170).

Было обнаружено, что, как и в случае других систем органов, TNFα играет ключевую роль в центральной нервной системе, в частности, в воспалительных и аутоиммунных нарушениях нервной системы, включающих в себя рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре и тяжелую псевдопаралитическую миастению, и в дегенеративных нарушениях нервной системы, включающих в себя болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Гентингтона. TNFα участвует также в нарушениях родственных систем ретины и мышцы, включающих в себя ретробульбарный неврит, дерматомиозит, боковой амиотрофический склероз и мышечную дистрофию, а также в повреждениях нервной системы, включающих в себя травматическое повреждение головного мозга, острое повреждение спинного мозга и инсульт.

Гепатит является другим TNFα-связанным воспалительным нарушением, который среди других провоцирующих факторов может быть обусловлен вирусными инфекциями, в том числе вирусом Эпштейна-Барра, цитомегаловирусом и вирусами гепатита А-Е. Гепатит вызывает острое воспаление печени в портальной и дольчатой областях с последующими фиброзом и прогрессированием опухоли.

TNFα может опосредовать кахексию в случае рака, которая вызывает наибольшую болезненность и смертность (Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389: 299-305).

Ключевая роль TNFα в воспалении, клеточных иммунных реакциях и патологии многих заболеваний, привела к поиску антагонистов TNFα.

TNFα является важным цитокином, системная блокада которого несет в себе риск увеличенной частоты и тяжести клинически манифестированных инфекций, в частности, повторной активации латентного туберкулеза, и, возможно, другие риски, в том числе индукцию лимфом, демиелинизирующих заболеваний и сердечной недостаточности.

Одним классом антагонистов TNFα, предназначенных для лечения TNFα-опосредованных заболеваний, являются антитела или фрагменты антител, которые специфически связывают TNFα и посредством этого блокируют их функцию. Применение анти-ТNFα-антител показало, что блокада TNFα может обращать эффекты, приписываемые TNFα, в том числе снижение IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, молекул адгезии и деструкцию ткани (Feldman et al. (1997), Adv. Immunol. 1997: 283-350).

Антитела, направленные против TNFα, были предложены для профилактики и лечения эндотоксического шока (Beutler et аl. (1985) Science:234, 470-474). Применение aнти-TNFα-антител в лечении септического шока обсуждается Bodmer et аl., (Critical Care Medicine, 21:441-446, 1993), Wherry et al., 1993 (Critical Care Medicine, 21:436-440) и Kirschenbaum et al., 1998 (Critical Care Medicine, 26:1625-1626).

Способ лечения нейродегенеративного заболевания в человеке введением моноклонального анти-TNFα-aнтитела или его TNFα-связывающего фрагмента был описан в US 2003147891.

WO 0149321 описывает применение TNFα-блокаторов, в том числе анти-TNFα-антител, для лечения неврологических и родственных нарушений, вызываемых TNFα. Он обеспечивает способ лечения указанных заболеваний введением антагониста TNFα.

WO 03047510 описывает различные типы моноклональных и сконструированных антител, направленных против TNFα, их получение, соединения, содержащие их, и применение в медицине.

Антитела, применимые для терапий TNFα-опосредованных заболеваний, обычно являются либо моноклональными антителами (mAb), продуцируемыми технологией гибридом из природного источника, либо сконструированными антителами. Последние либо соответствуют природно-встречающимся антителам в том смысле, что они содержат полноразмерные тяжелые и легкие цепи, либо соответствуют Fab-фрагментам, которые могут быть также созданы из природных антител протеолитическим расщеплением, или одноцепочечным scFv-антителам, в которых фрагменты вариабельных областей тяжелых и легких цепей связаны пептидным линкером.

Как тяжелые, так и легкие цепи антитела содержат константные и вариабельные домены. Поскольку антитела не человека являются иммуногенными, количество последовательностей, подобных последовательностям человека, в антителе часто увеличивают в так называемом «гибридном» антителе, которое содержит константные области IgG человека и вариабельные области, соответствующие последовательностям антитела животного, в большинстве случаев мышиных антител, с желаемой специфичностью. Затем эти вариабельные области могут быть дополнительно адаптированы, чтобы они стали более сходными с типичным антителом человека, посредством мутагенеза, что приводит к «гуманизированному» антителу. В еще одном альтернативном подходе только антиген-связывающие части, т.е. определяющие комплементарность участки (CDR) вариабельных областей мышиного антитела, объединяют с каркасом антитела человека, что приводит к «CDR-привитому» антителу.

Моноклональные антитела против TNFα были описаны в известном уровне техники. Meager et al., 1987 (Hybridoma 6:305-311) описывают мышиные моноклональные антитела против рекомбинантного TNFα. Shimamoto et al., 1988 (Immunology Letters 17:311-318) описывают применение мышиных моноклональных антител против TNFα в предотвращении эндотоксического шока в мышах.

US 5919452 описывает химерные анти-ТNFα-антитела и их применение в лечении патологий, ассоциированных с присутствием TNFα.

Применение анти-TNFα-антител в лечении RA и болезни Крона обсуждается в Feldman et al., 1998 (Transplantation Proceedings 30:4126-4127), Adorini et al., 1997 (Trends in Immunology Today 18:209-211) и в Feldman et al., 1997 (Advanced Immunology 64:283-350). Антитела к TNFα, использованные в таких терапиях, являются обычно химерными антителами, такими как антитела, описанные в US 5919452.

US 2003187231 описывает гуманизированные анти-ТNFα-антитела, по меньшей мере, с одним CDR-районом не человека, которые улучшали характеристики связывания. Кроме того, в Международной заявке на патент WO 92/11383 описаны рекомбинантные антитела, в том числе CDR-привитые антитела, специфические в отношении TNFα. Rankin et al. (1995) (British J. Rheumatology 34:334-342) описывают применение таких CDR-привитых антител в лечении ревматоидного артрита (RA).

WO 9211383 описывает рекомбинантное, гуманизированное CDR-привитое антитело, специфическое в отношении TNFα, которое произведено из мышиного моноклонального антитела 61Е7, hTNFI, hTNF3 или 101.4, и описывает получение и применение указанных антител в диагностике и/или терапии TNFα-ассоциированных нарушений.

Среди специфических ингибиторов TNFα, которые стали коммерчески доступными лишь недавно, моноклональное, химерное мышиное-человеческое антитело, направленное против TNFα (инфликсимаб, Remicade™; Cenrtocor Corporation/Johnson & Johnson), продемонстрировало клиническую эффективность в лечении RA (Elliot et al. 1994, Lancet 344:1105-1110; Mani et al. (1998), Arthritis & Rheumatism 41:1552-1563). Инфликсимаб продемонстрировал также клиническую эффективность в лечении воспалительного нарушения пищеварительного тракта, болезни Крона (Baert et al. 1999, Gastroenterology 116: 22-28).

US 22002037934 описывает лечение гепатита введением анти-TNFα-aнтитела, такого как инфликсимаб.

US 6428787 описывает лечение неврологических и TNFα-ассоциированных заболеваний aнти-TNFα-aнтителами, в том числе инфликсимабом, CDP571 и D2E7.

D2E7 (адалицумаб), моноклональное анти-ТNFα-антитело человека (Abbot) было разработано для лечения RA и болезни Крона (WO 9729131). Celltech разрабатывает CDP571 (ЕР 0626389), гуманизированное анти-ТNFα-IgG4-антитело, для лечения болезни Крона и CDP870, фрагмент гуманизированного моноклонального анти-ТNFα-антитела, для лечения RA. Локальное введение указанных антител для лечения локализованных нарушений описано в US 2003185826.

Многие одноцепочечные (scFv) антитела были созданы против множества различных антигенов, в частности, вследствие того, что они могут быть легко отобраны на высокую способность связывания с использованием, например, таких способов, как фаговый дисплей или рибосомный дисплей. Кроме того, scFv-антитела могут быть получены в микробных системах, которые связаны с меньшими расходами в сравнении с получением терапевтических полноразмерных антител.

Кроме общепринятых внеклеточных и in vitro применений, scFv были также успешно использованы для внутриклеточных применений (Worn et al., 2000, JBC, 28; 275(4):2795-2803; Auf der Maur et al. 2002, JBC, 22; 277 (47):960-966); таким образом, были развиты scFv, направленные против внутриклеточных антигенов. Обычно внутриклеточная экспрессия функциональных scFv является ограниченной их нестабильностью, нерастворимостью и склонностью к образованию агрегатов. По этой причине были успешно разработаны системы скрининга in vivo на антитела scFv, которые являются особенно растворимыми и стабильными при восстанавливающих условиях, типичных для внутриклеточной среды (например, ядра, цитоплазмы), с использованием так называемого "Quality Control" скрининга (Скрининга с контролем качества) (WO 0148017); Auf der Maur et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412; Aus der Maur et al. (2004), Methods 34:215-224), и они привели к идентификации особенно стабильных и растворимых каркасных последовательностей scFv для таких целей (WO 03097697). Кроме того, эти каркасы обнаруживают исключительно высокие уровни экспрессии и усиленные свойства стабильности и растворимости также и при природных, окислительных условиях во внеклеточной среде. Таким образом, эти благоприятные биофизические и биохимические свойства приводят к благоприятным выходам получения и позволяют использовать эти фрагменты антител, направленных против специфических антигенов, локально и/или системно в качестве белковых терапевтических агентов в конкретных терапевтических зонах. Поскольку как scFv-антитела, так и Fab-фрагменты, в противоположность полноразмерным антителам, не имеют Fc-части, которые узнаются Fc-рецептором моноцитов, таких как природные клетки-киллеры, они не провоцируют антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и, следовательно, не провоцируют неспецифическую токсичность вследствие связывания с Fc-рецепторами на клетках, не являющихся мишенями.

Таким образом, существует потребность в новых, эффективных формах антител для лечения TNFα-ассоциированных нарушений, таких как ревматоидный артрит (RA), в частности, лечений, которые могут обеспечить стойкую, регулируемую терапию местным введением с низкой степенью побочных действий. Данное изобретение обеспечивает антитела, композиции и способы для эффективного и непрерывного лечения воспалительных процессов артрита и других TNFα-опосредованных нарушений или патофизиологических механизмов, в частности различных форм боли.

Все публикации и ссылки, цитируемые здесь, включены тем самым в качестве ссылки в их полном объеме.

Раскрытие изобретения

Таким образом, главной целью данного изобретения является обеспечение стабильного и растворимого антитела или производного антитела, которое специфически связывает TNFα in vitro и in vivo. В предпочтительном варианте осуществления указанным производным антитела является scFv-антитело или Fab-фрагмент.

Теперь для осуществления этих и дополнительных целей этого изобретения, которые будут становиться все более очевидными по мере продолжения описания, указанное антитело или производное антитела характеризуются признаками, заключающимися в том, что они содержат вариабельный домен легкой цепи, имеющий последовательность SEQ ID NO:1 или производный из последовательности SEQ ID NO:1, который объединен с вариабельным доменом тяжелой цепи, имеющим последовательность SEQ ID NO:2 или производным из последовательности SEQ ID NO:2, причем в случае производной последовательности указанная последовательность имеет максимально до 5 изменений в каркасе указанного V_L-домена и/или максимально до 9 изменений в каркасе указанного V_H-домена.

Предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения является указанное антитело или производное антитела, где одно или несколько аминокислотных изменений введены в любом из положений в этом каркасе, предпочтительно в одном или нескольких положениях, выбранных из положений 4, 46, 65, 67, 70 и 83 V_L-домена и/или в одном или нескольких положениях, выбранных из группы положений 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 и 112 V_H-домена. Более предпочтительно, по меньшей мере, одно из этих превращений приводит к аминокислоте, присутствующей в SEQ ID NO:3 для V_L и/или SEQ ID NO:4 для V_H, и еще более предпочтительно максимально присутствуют 13 превращений в целом.

Наиболее предпочтительно указанное антитело или производные антитела содержат V_L-домен последовательности SEQ ID NO:1 и/или V_H-домен, имеющий последовательность SEQ ID NO:2 или произведенный из последовательности SEQ ID NO:2, или V_L-домен последовательности SEQ ID NO:11 и V_H-домен SEQ ID NO:4. Если V_H-домен антитела данного изобретения содержит V_L-домен SEQ ID NO:1, в предпочтительном варианте осуществления, V_H-последовательность произведена из SEQ ID NO:2 таким образом, что фенилаланин в положении 68 заменен на аланин, лейцин, изолейцин или валин. Дополнительные изменения в V_H являются необязательными. scFv-антитела этого типа приведены в SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 и SEQ ID NO:37.

В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения указанное антитело или производное антитела произведены из антитела с V_L-последовательностью SEQ ID NO:1 и V_H-последовательностью SEQ ID NO:2 и содержат, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, который превращен, по меньшей мере, в одном из CDR в остаток, присутствующий в соответствующем CDR V_L-последовательности SEQ ID NO:5 и/или V_H-последовательности SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:25.

В одном очень предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, по меньшей мере, один из CDR группы CDR2 V_L, CDR3 V_L, CDR2 V_H или CDR3 V_H превращен в соответствующий CDR V_L-последовательности SEQ ID NO:5 и/или V_H-последовательности 25 или SEQ ID NO:6.

Наиболее предпочтительно, указанное антитело или производное антитела содержат следующие комбинации V_L/V_H-последовательностей:

V_L SEQ ID NO:7/V_H SEQ ID NO:2,

V_L SEQ ID NO:8/V_H SEQ ID NO:2,

V_L SEQ ID NO:1/V_H SEQ ID NO:9,

V_L SEQ ID NO:1/V_H SEQ ID NO:25,

V_L SEQ ID NO:1/V_H SEQ ID NO:28,

V_L SEQ ID NO:1/V_H SEQ ID NO:29,

V_L SEQ ID NO:26/V_H SEQ ID NO:30,

V_L SEQ ID NO:27/V_H SEQ ID NO:30.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело или производное антитела данного изобретения имеют специфичность в отношении TNFα человека. Предпочтительно связывание антитела характеризуется К_d~100 нМ или менее. Более предпочтительным является антитело с K_d 10 нМ или менее и наиболее предпочтительным является антитело с K_d 1 нМ или менее.

Производными антитела в соответствии с этим изобретением являются, например, Fc-слияния, слияния с токсином, слияния с ферментативными активностями, различные форматы, такие как миниантитела, диантитела, линейные антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические фрагменты антител, в частности, scFv- и Fab-фрагменты.

Другой предпочтительной целью данного изобретения является scFv-антитело, домены V_L и V_H которого соединены при помощи линкера, предпочтительно в виде V_L-линкер-V_H-последовательности SEQ ID NO:10.

Другой предпочтительной целью данного изобретения является scFv-антитело, произведенное из SEQ ID NO:40 (ТВ-А). Такое антитело может быть получено мутагенезом и содержит три или менее мутаций в каркасной, CDR- и/или линкерной последовательности. Предпочтительно, это scFv-антитело имеет последовательность SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 или SEQ ID NO:38.

Другой предпочтительной целью данного изобретения является Fab-фрагмент, содержащий V_L-домен, который слит с константной областью каппа-цепи Ig человека, и V_H-домен, который слит с СН1-доменом IgG человека, посредством чего эти два слитых полипептида соединены межцепочечным дисульфидным мостиком.

Еще в одном аспекте это антитело или производное антитела, например, фрагмент антитела данного изобретения является меченым или химически модифицированным.

Данное изобретение обеспечивает также ДНК-последовательность, кодирующую любые из антител или производных антител данного изобретения, а также клонирующий или экспрессирующий вектор, содержащий указанную ДНК-последовательность. Кроме того, обеспечена подходящая клетка-хозяин, трансформированная указанной ДНК-последовательностью, которая предпочтительно является Е. coli, клеткой дрожжей или клеткой млекопитающего.

Кроме того, обеспечен способ получения антител или производных антител данного изобретения, предусматривающий культивирование клетки-хозяина, трансформированной ДНК, кодирующей любые из указанных антител или производных антител, в условиях, которые делают возможным синтез указанного антитела или производного антитела, и извлечение указанной молекулы из указанной культуры. Предпочтительно указанный способ обеспечивает scFv-антитело или Fab-фрагмент, очищенные из Е. coli.

Другим аспектом данного изобретения является применение антител или производных антител, обеспеченных данным изобретением, в качестве диагностического инструмента для диагностики in vitro и/или фармацевтического агента. Это применение является особенно предпочтительным в контексте любого связанного с TNFα состояния.

Данное изобретение включает в себя также композицию, содержащую антитело или производное антитела данного изобретения в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом, причем указанная композиция предназначена для применения в качестве лекарственного средства для лечения TNFα-ассоциированных заболеваний.

В дополнительном аспекте данное изобретение обеспечивает комбинированный препарат, содержащий антитело или производное антитела данного изобретения, предпочтительно со вторым соединением, которое не является антителом или производным антитела, специфическим в отношении TNFα.

Еще в одном аспекте данного изобретения вектор, содержащий ДНК-последовательность, кодирующую scFv-антитело данного изобретения, используют для генотерапии.

Лечение TNFα-ассоциированных заболеваний достигается блокированием TNFα вследствие сильного взаимодействия TNFα с этим антителом или производным антитела. Предпочтительно, предполагается лечение аутоиммунных, острых или хронических воспалительных состояний, связанных с раком заболеваний, боли, неврологических и нейродегенеративных нарушений, инфекционных заболеваний и сердечно-сосудистых заболеваний.

Краткое описание чертежей

Данное изобретение будет более понятным, и цели, другие, чем описанные выше цели, станут очевидными при рассмотрении со следующим подробным описанием. Такое описание делает ссылки на прилагаемый графический материал.

Фиг.1 показывает схему scFv-антитела с последовательностями ТВ-А и ТВ-В, определяющими границы диапазона наиболее частых вариаций. Звездочки обозначают положения, в которых допускаются аминокислотные изменения в каркасе антител данного изобретения. Аминокислоты, указанные ниже CDR (CDR выделены серым фоном), могут быть использованы в соответствующих CDR.

Фиг.2 показывает примерную схему для представления Fab-фрагмента.

Фиг.3 показывает продукционный выход scFv при экспрессии в Е. coli. A. Электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле экспрессируемых белков. В. Аналитическая гель-фильтрация ТВ-А и TB-wt, показывающая превосходную растворимость ТВ-А.

Фиг.4 показывает сравнение аффинности различных scFv-антител к TNFα, определяемой при помощи ELISA.

Фиг.5 показывает ингибирование цитотоксичности, индуцированной TNFα человека, в фибробластах мыши L929. А. Зависимое от концентрации ингибирование ТВ-А в сравнении с TB-wt и инфликсимабом с величинами IC₅₀. В. Сравнение ТВ-А-производных в отношении блокирования TNFα-индуцированной цитотоксичности. С. Сравнение форматов scFv и Fab ТВ-А.

Фиг.6 показывает эффект лечения антителом индуцированного TNFα человека опухания сустава у крысы (эксперимент: 5.3., эксперимент 1).

Фиг.7 показывает схему балльных оценок для гистопатологической оценки воспаления.

Фиг.8 показывает эффект лечения антителом индуцированного TNFα человека воспалении сустава у крысы (эксперимент: 5.3., эксперимент 1).

Фиг.9 показывает эффект лечения антителом индуцированного TNFα человека опухания сустава у крысы (эксперимент: 5.3., эксперимент 2).

Фиг.10 показывает эффект лечения антителом индуцированного TNFα человека воспаления сустава у крысы (эксперимент: 5.3., эксперимент 2).

Фиг.11 показывает стабильность ТВ-А в различных жидкостях тела.

Осуществление изобретения

Было обнаружено, что антитела или производные антител, содержащие каркасы, идентифицированные в так называемом скрининге с контролем качества ("Quality Control") (WO 0148 017), характеризуются в целом высокой стабильностью и/или растворимостью и, следовательно, могут быть также применимы в контексте внеклеточных применений, таких как нейтрализация TNFα. Данное изобретение обеспечивает антитела или производные антител, отличающиеся повышенной стабильностью и растворимостью, которые специфически узнают и связывают TNFα и, следовательно, являются подходящими для блокирования функции TNFα in vivo. Указанные антитела или производные антител отличаются особым каркасом, произведенным с использованием скрининга с «контролем качества» на антитела с особенно стабильными и растворимыми каркасами независимо от их антиген-связывающего сайта, которые были описаны в ЕР 1479694. Если каркасами, используемыми в этом скрининге, являются каркасы антитела человека, они могут рассматриваться как неиммуногенные каркасы для применений в человеке. CDR этих антител данного изобретения являются идентичными CDR или произведены из CDR мышиного моноклонального антитела Di62 (Doring et аl., 1994), которое специфически связывается с TNFα человека с высокой аффинностью (K_d=0,4 нМ) и может блокировать связывание TNFα с его рецептором. Кроме того, Di62 ингибирует индуцированную TNFα человека цитотоксичность в клетках мыши L929. Вполне понятная стадия прививки CDR из мышиного антитела на, несомненно, наиболее подходящий акцепторный каркас человека с неопределенными антиген-связывающими свойствами, где указанный каркас имеет V_L-последовательность SEQ ID NO:5 и V_H-последовательность SEQ ID NO:6, причем указанные последовательности связаны (GGGGS)₄-линкером (SEQ ID NO:10), приводила к scFv-антителу с последовательностью:

причем указанное scFv-антитело названо ТВ-В. ТВ-В давало хорошие выходы в экспрессии белка (фиг.3А), но не было способно специфически связывать TNFα (фиг.4А).

Таким образом, для получения антитела или производного антитела, которое является (i) достаточно специфическим в отношении связывания TNFα, (ii) достаточно растворимым для возможности эффективного получения и очистки и для блокирования TNFα in vivo, (iii) достаточно стабильным для применения в качестве фармацевтического агента без быстрой деградации и (iv) достаточно неиммуногенным, искали компромисс между наилучшей растворимостью и наилучшими антиген-связывающими свойствами варьирования этого каркаса и этих CDR. Данное изобретение обеспечивает последовательность для V_L и V_H, которая оптимизирована в отношении комбинации критериев (i-iv). scFv-антитело, содержащее указанную V_L (SEQ ID NO:1, связанную (GGGGS)₄-линкером с указанной V_H (SEQ ID NO:2), названо ТВ-А. Последовательность ТВ-А представлена SEQ ID NO:40. Это антитело является все еще достаточно стабильным и растворимым для получения удовлетворительных выходов при экспрессии и очистке из Е. coli (фиг.3А), и оно не агрегируется (фиг.3В). Его характеристики связывания с TNFα являются превосходными, с K_d 0,8 нМ.

Данное изобретение описывает также V_L- и V_H-последовательности, произведенные из последовательностей, представленных в ТВ-А, различными способами. Во-первых, было обнаружено, что точковые мутации в положениях до пяти положений в каркасе V_L и/или в положениях до девяти положений в каркасе V_H являются приемлемыми, в частности, точковые мутации, которые делают эти каркасы более ТВ-В-подобными, т.е. более подобными SEQ ID NO:3 для V_L или SEQ ID NO:4 для V_H. scFv-антитело, содержащее V_L-домен последовательности SEQ ID NO:11 и V_H-домен последовательности SEQ ID NO:4, связанные (GGGGS)₄-линкером, названо ТВ-В R46L, так как оно отличается только в положении 46 V_L от ТВ-В. В отличие от ТВ-В это антитело все еще имеет хорошие связывающие свойства в отношении TNFα (K_d~100 нМ). Это предполагает, что количество изменений в ТВ-В R46L относительно ТВ-А представляет верхний предел для изменений в каркасе вариабельного домена.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения в каркасы V_L и/или V_H ТВ-А вводят лишь одно- или двухточковые мутации. Предпочтительные остатки каркаса для мутаций находятся в положениях 4, 46, 65, 67, 70 и 83 для V_L и в положениях 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 и 112 для V_H. Эти положения нумеруются в соответствии с нумерацией в списке последовательностей. Аминокислотные замены являются предпочтительно либо «консервативными», либо такими, что заменяющие аминокислоты являются более сходными или предпочтительно даже идентичными с соответствующими аминокислотами, присутствующими в последовательности ТВ-В. Например, аминокислота А76 V_H в ТВ-А может быть изменена в 176, так как 176 присутствует в ТВ-В, но она может быть также изменена в другую аминокислоту со сходной, т.е. неполярной боковой цепью, такую как V или L. Этот пример является примером «консервативной» замены аминокислоты. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, подходящие для «консервативных» замен, обсуждаемых в данном контексте, были определены в данной области, в том числе основные боковые цепи (К, R, Н), кислотные боковые цепи (D, Е), незаряженные полярные боковые цепи (Q, N, S, Т, Y, С), неполярные боковые цепи (G, А, V, L, I, P, F, M, W), бета-разветвленные боковые цепи (Т, V, I) и ароматические боковые цепи (Y, F, W, Н). Предпочтительным консервативным изменением является изменение V_L в положении 83, в котором V заменен либо на F (SEQ ID NO:26), либо на A (SEQ ID NO:27). Однако в SEQ ID NO:32 неконсервативным изменением в V_L является V83E, которое комбинировано с изменением в CDR1, т.е. N31D, и в V_H с изменением V79A. Другим экстраординарным вариантом ТВ-А является вариант SEQ ID NO:33, с консервативным изменением F68L в V_H, связанной с V_L линкером, несущим R в положении 2, вместо G.

Очень предпочтительными заменами единственных аминокислот являются R65S или Y67S в V_L и K43Q или F68 на V, L или А в V_H. Очень предпочтительными двойными заменами являются F70L/L72R или A76I/S77G в V_H. scFv-антитела, содержащие последовательности ТВ-А с указанными изменениями, обнаруживают ингибирование TNFα-индуцированной цитотоксичности в клетках L929. Результаты некоторых из них показаны на фиг.5В. Их последовательности являются следующими:

SEQ ID NO:18=ТВ-А H_K43Q (ТВ-А-Н43)

SEQ ID NO:19=ТВ-А H_F68V (TB-A-H68)

SEQ ID NO:20=ТВ-А H_F70L/L72R (ТВ-А Н70/72)

SEQ ID NO:21=ТВ-А H_A76I/S77G (ТВ-А Н76/77)

SEQ ID NO:22=ТВ-А L_L46R (ТВ-А L46)

SEQ ID NO:23=ТВ-А L_R65S (ТВ-А L65)

SEQ ID NO:24=ТВ-А L_Y67S (ТВ-А L67).

В предпочтительном варианте осуществления любой из вышеупомянутых V_H-доменов может быть объединен с любым из вышеупомянутых V_L-доменов.

В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения V_L- и V_H-домены ТВ-А и ТВ-В перетасованы таким образом, что V_L-домен ТВ-А (SEQ ID NO:1) объединен с V_H-доменом ТВ-В (SEQ ID NO:4) или V_L-домен ТВ-В (SEQ ID NO:4) объединен с V_H-доменом ТВ-А (SEQ ID NO:2). В очень предпочтительном варианте осуществления эти перетасованные версии, полученные в scFv, соединены (GGGGS)₄-линкером последовательности SEQ ID NO:10, что приводит к scFv-антителам ТВ-АВ (SEQ ID NO:12) или ТВ-ВА (SEQ ID NO:13) соответственно. Указанный (GGGGS)₄-линкер может иметь аминокислотную замену глицина на более гидрофильную, т.е. полярную или даже заряженную аминокислоту, которая может делать антитело более растворимым. Среди этих вариаций, предпочтительной является вариация с последовательностью GRGGS-(GGGGS)₃ (SEQ ID NO:39).

В рамках данного изобретения находится также объединение V_L- или V_H-доменов ТВ-В-подобных последовательностей с V_H- или V_L-доменами ТВ-А-подобных последовательностей, вследствие чего ТВ-В/ТВ-А-подобные обозначают, что эти последовательности являются более близкими к одной, чем к другой последовательности.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения одна или несколько аминокислот изменены в CDR-районах V_L- и/или V_H-последовательностей ТВ-А таким образом, что они совпадают с соответствующими аминокислотами, присутствующими в выбранных последовательностях SEQ ID NO:5 V_L и/или SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:25 V_H. Очень предпочтительными являются изменения в одном из CDR V_L (CDR2 V_L или CDR3 V_L) и/или CDR V_H (CDR2 или CDR3), причем наиболее предпочтительные изменения приводят к последовательностям SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8 V_L и/или последовательностям SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:9 V_H соответственно.

В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения V_L-последовательности SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:27 объединяют с V_H-последовательностью SEQ ID NO:30. В еще одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения V_L-последовательность SEQ ID NO:1 объединяют с V_H-последовательностями SEQ ID NO:28 или SEQ ID NO:29.

Обычно любая из описанных V_L-последовательностей может быть объединена с любой из описанных V_H-последовательностей.

Объектами данного изобретения являются антитела и фрагменты антител, в частности V_L- или V_H-полипептиды, одноцепочечные антитела (scFv) или Fab-фрагменты. В случае scFv-антител, выбранный V_L-домен может быть связан с выбранным V_H-доменом в любой ориентации гибким линкером. Подходящий линкер существующего уровня техники состоит из повторяемых аминокислотных последовательностей GGGGS или их вариантов. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения используют (GGGGS)₄-линкер SEQ ID NO:10 или его производное SEQ ID NO:39, но возможны также варианты из 1-3-повторов (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Другие линкеры, которые могут быть использованы для данного изобретения, описаны Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59. Расположение может быть либо V_L-линкер-V_H, либо V_H-линкер-V_L, причем первая ориентация является предпочтительной ориентацией.

В случае Fab-фрагментов, выбранные вариабельные домены легкой цепи V_L сливают с константной областью каппа-цепи Ig человека, тогда как подходящие вариабельные домены тяжелой цепи V_H сливают с первым (N-концевым) константным доменом СН1 IgG человека. В примерном варианте осуществления данного изобретения, Сκ-домен имеет последовательность SEQ ID NO:14, а домен СН1, используемый для конструирования Fab-фрагментов, имеет последовательность SEQ ID NO:15. Фиг.2 показывает пример Fab-фрагмента, в котором используют V_L- и V_H-домены ТВ-А таким образом, что V_L-домен непосредственно связан с константным доменом каппа человека, что приводит к последовательности:

а V_H-домен слит с первым константным доменом (СН1), что приводит к последовательности:

На С-конце образуется межцепочечный дисульфидный мостик между двумя константными доменами.

Антитела или производные антител данного изобретения могут иметь аффинности в отношении TNFα человека с константами диссоциации К_d в диапазоне 0,8-10000 нМ. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения K_d равна ≤10 нМ. Аффинность антитела в отношении антигена может быть определена экспериментально с использованием подходящего способа (Berzofsky et al. "Antibody-Antigen Interactions", in Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: New York, NY (1992); Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY) и описанных в этих ссылках способов.

В одном аспекте данного изобретения антитела или производные антител, в частности scFv-антитела или Fab-фрагменты, являются мечеными. Детектируемое мечение TNFα-специфического антитела или производного антитела может выполняться связыванием его с ферментом для использования в ферментном иммуноанализе (EIA) или твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA), которые хорошо известны специалисту в данной области (например, Current Protocols in Immunology, Coligan et al. Eds, John Wiley & Sons, 2005).

Посредством радиоактивного мечения TNFα-специфических антител или производных антител можно детектировать TNFα с использованием радиоиммуноанализа (RIA) (см., например. Work et аl., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y. (1978). Радиоактивный изотоп может быть детектирован с использованием гамма-счетчика или сцинтилляционного счетчика ил