Теломеразная обратная транскриптаза птиц

Теломеразная обратная транскриптаза птиц

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение конкретно относится к новым рекомбинантным обратным транскриптазам теломеразам, молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим их, к клеткам, содержащим указанную молекулу нуклеиновой кислоты, и к применению этих клеток для получения целевого вещества.

В 1965 L.Hayflick сделал открытие, что клетки обладают программируемым моментом гибели. В качестве одного из объяснений старения он предположил, что число раз, которое человеческая клетка может делиться, ограничено (Exp Cell Res. 1965 Mar; 37: 614-36). Теперь известно, что это вызвано укорочением теломеров, когда клетка делится. Хромосомы кэппированы теломерами, состоящими из консервативной, тандемно повторяющейся, некодирующей гексамерной последовательности ДНК, ассоциированной с одно- и двунитевыми связывающими белками. Теломеры ответственны за функции стабильности генома и, в частности, за репликацию концов хромосом. Для успешной концевой репликации хромосом требуется как уникальная структура теломера, так и специализированный фермент обратная транскриптаза теломераза, который представляет собой нуклеопротеин, обладающий ферментативной активностью обратной транскриптазы. Обратная транскриптаза теломераза способна к удлинению ряда повторов теломера, что дает возможность протяженной репликации комплементарной дочерней нити. В клетках, в которых отсутствует обратная транскриптаза теломераза, теломерная ДНК укорачивается при последовательных делениях, поскольку ферменты синтеза ДНК неспособны полностью реплицировать концы хромосом, как только удалена инициирующая РНК затравка. В различных работах сообщены данные о том, что так называемые "теломерные часы" являются важным признаком продолжительности жизни человеческой клетки. Теломерная гипотеза клеточного старения предполагает, что укорочение теломера связано с полным отсутствием активности обратной транскриптазы теломеразы и является пусковым механизмом нестабильности хромосом, приводящей к старению, апоптозу. Теломеразная обратно-транскриптазная активность подлежит понижающей регуляции в соматических клеточных линиях в процессе развития in vivo и в первичных клетках in vitro, что коррелирует с укорочением теломеров. Напротив, повышающая регуляция или нарушение регуляции теломеразной обратно-транскриптазной активности происходит в трансформированных клетках и опухолях. кДНК обратной транскриптазы теломеразы (TERT) из нескольких млекопитающих и одной амфибии клонирована и изучена (Nakamura et al., 1997, Science 277, 955-959; Greenberg et al., 1998, Oncogene 16, 1723-1730).

Поскольку гиперэкспрессия TERT в клетке приводит к иммортализации указанной клетки, предложено использование TERT для получения клеточных линий (McSharry et al., 2001 J Gen Virol. 82, 855-63). Однако активность TERT ограничена видом. Например, человеческая TERT несовместима с птичьим аппаратом сохранения теломеров (Michailidis et al., 2005, Biochem Biophys Res Commun. 335 (1), 240-6). Следовательно, для разработки птичьих клеточных линий и более конкретно клеточных линий семейства утиных существует необходимость в TERT, которая работает в этих конкретных клетках.

Эукариотические клеточные линии являются фундаментальными для изготовления вирусных вакцин и многих продуктов биотехнологии. Биологические вещества, продуцируемые в клеточных культурах, включают ферменты, гормоны, иммунобиологические агенты (моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины) и противораковые агенты. Хотя многие более простые белки можно продуцировать, используя бактериальные клетки, более сложные белки, которые являются гликозилированными, в настоящее время должны быть получены в эукариотических клетках.

Птичьи клеточные линии особенно полезны, поскольку многие вирусы, используемые в фармацевтической композиции, способны реплицироваться на них. Более конкретно, различные вирусы способны расти только на птичьих клетках. Это верно, например, в случае модифицированного вируса вакцинии Анкара (MVA), который неспособен расти на большинстве клеток млекопитающих. Этот поксвирус, который образован из вируса вакцинии в результате более чем 500 пассажей на CEF, использовали в ранних семидесятых годах для вакцинации людей с иммунодефицитом против оспы. В настоящее время MVA, главным образом, используют в качестве вектора для целей генотерапии и иммунотерапии. Например, MVA используют в качестве вектора для гена MUC1 для вакцинации пациентов против опухоли, экспрессирующей данный антиген (Scholl et al., 2003, J Biomed Biotechnol., 2003, 3, 194-201). MVA, несущий ген, кодирующий антигены HPV, также используют в качестве вектора для терапевтического лечения поражений шейки матки высокой степени. В более недавнее время MVA был вектором выбора для изготовления профилактической терапии против вновь возникающих заболеваний или вероятного биологического оружия, такого как вирус лихорадки Западного Нила и сибирской язвы.

Следовательно, существует необходимость в новой обратной транскриптазе теломеразе, способной к иммортализации птичьих клеток и более конкретно клеток птиц семейства утиных.

Как используют на протяжении всей заявки, единственное число существительного используют в том смысле, что оно означает "по меньшей мере один", "по меньшей мере первый", "один или более чем один" или "множество" упоминаемых компонентов или стадий, если контекст явно не диктует противоположное. Например, термин "клетка" включает множество клеток, включая их смеси.

Термин "и/или", где его используют здесь, включает значение "и", "или" и "все комбинации или любая комбинация элементов, объединенных указанным термином".

Как используют здесь, термины "содержащий" и "содержать" предназначены для обозначения того, что продукты, композиции и способы включают упоминаемые компоненты или стадии, но не исключают другие. "Состоящий по существу из" при использовании для определения продуктов, композиций и способов должен означать исключение других компонентов или стадий любой существенной значимости. Таким образом, композиция, состоящая по существу из перечисленных компонентов, не должна включать следовые примеси и фармацевтически приемлемые носители. "Состоящий из" должен означать исключение более чем следовых элементов других компонентов или стадий.

Настоящее изобретение относится к изолированному и/или рекомбинантному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 60% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID №:1. В более предпочтительном воплощении изобретения полипептид по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80% и даже более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID №: 1. В более предпочтительном воплощении изобретения полипептид по изобретению содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID №: 1.

В предпочтительном воплощении полипептид по изобретению обладает активностью TERT, и в более предпочтительном воплощении изобретения экспрессия полипептида по изобретению дает возможность иммортализации клетки, принадлежащей к семейству утиных.

Как используют здесь, термин "изолированный" и/или "рекомбинантный" означает, что молекула нуклеиновой кислоты, ДНК, РНК, полипептиды или белки, обозначенные таким образом, получены в такой форме руками человека и, таким образом, выделены из их нативного клеточного окружения in vivo. В результате этого вмешательства человека рекомбинантные ДНК, РНК, полипептиды и белки по изобретению применимы в способах, описанных здесь, тогда как эти ДНК, РНК, полипептиды и белки, как они встречаются в природе, неприменимы.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по изобретению.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по изобретению, содержит по существу такую же нуклеотидную последовательность, как представлена в SEQ ID №:2. Предпочтительные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид по изобретению, содержат такую же нуклеотидную последовательность, как представлена в SEQ ID №:2.

Как используют здесь, термин "по существу такая же нуклеотидная последовательность" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, обладающей достаточной идентичностью с упомянутым полинуклеотидом, чтобы она могла гибридизоваться с упомянутым полинуклеотидом в умеренно жестких условиях гибридизации. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, имеющая по существу такую же нуклеотидную последовательность, как упомянутая нуклеотидная последовательность, кодирует по существу аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID №:1. В другом воплощении молекула нуклеиновой кислоты, имеющая по существу такую же нуклеотидную последовательность, как упомянутая нуклеотидная последовательность, имеет по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью с нуклеиново-кислотной последовательностью, представленной в SEQ ID №:2.

Гибридизация относится к связыванию комплементарных нитей нуклеиновой кислоты (то есть смысловой и антисмысловой нити или зонда и ДНК-мишени) друг с другом посредством водородных связей, подобных связям, которые встречаются в природе в хромосомной ДНК. Уровни жесткости, используемые для гибридизации данного зонда с ДНК-мишенью, может легко варьировать специалист в данной области техники.

Выражение "жесткая гибридизация" используют здесь как относящееся к условиям, при которых полинуклеиново-кислотные гибриды являются стабильными. Как известно специалистам в данной области техники, стабильность гибридов отражена в температуре плавления (Tm) гибридов. Как правило, стабильность гибрида является функцией концентрации ионов натрия и температуры. Типично реакцию гибридизации проводят в условиях более низкой жесткости с последующими отмывками варьирующей, но более высокой жесткости. Ссылка на жесткость гибридизации относится к таким условиям отмывки.

Как используют здесь, выражение "умеренно жесткая гибридизация" относится к условиям, которые позволяют ДНК-мишени связывать комплементарную нуклеиновую кислоту, которая имеет примерно 60% идентичности, предпочтительно примерно 75% идентичности, более предпочтительно примерно 85% идентичности с ДНК-мишенью; причем особенно предпочтительно более 90% идентичности с ДНК-мишенью. Предпочтительно умеренно жесткими условиями являются условия, эквивалентные гибридизации в 50% формамиде, 5*растворе Денхардта, 5*SSPE, 0,2% ДСН при 42°С с последующей отмывкой в 0,2*SSPE, 0,2% ДСН при 65°С.

Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может представлять собой РНК, кДНК или геномную последовательность или иметь смешанный тип. Она может, где пригодно, содержать один или более чем один интрон, где эти интроны имеют нативное, гетерологичное (например, интроны β-глобиновых генов кролика и т.д.) или синтетическое происхождение, в целях повышения экспрессии в клетках-хозяевах.

Настоящее изобретение также относится к вектору, который несет молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

Как используют здесь, термин "вектор" понимают как означающий вектор плазмидного или вирусного происхождения, и возможно такой вектор комбинируют с одним или более чем одним веществом, улучшающим эффективность трансфекции и/или стабильность указанного вектора и/или защиту указанного вектора in vivo против иммунной системы организма-хозяина. Эти вещества широко документированы в литературе, которая доступна специалистам в данной области техники (см., например, Feigner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654). Для иллюстрации, но без ограничения, они могут представлять собой полимеры, липиды, в частности катионные липиды, липосомы, ядерные или вирусные белки или нейтральные липиды. Эти вещества можно использовать отдельно или в комбинации. Примеры таких соединений, в частности, доступны в патентных заявках WO 98/08489, WO 98/17693 WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853, EP 890362 или WO 99/05183. Комбинация, которая может быть рассмотрена, представляет собой плазмидный рекомбинантный вектор, комбинированный с катионными липидами (DOGS, DC-Chol (3-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]-холестерин), спермин-холестерин, спермидин-холестерин и тому подобное) и нейтральными липидами (DOPE).

Выбор плазмид, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, огромен. Они могут представлять собой клонирующие и/или экспрессионные векторы. Как правило, они известны специалистам в данной области техники, и ряд их имеется в продаже, но также возможно сконструировать или модифицировать их методами генной инженерии. Могут быть упомянуты в качестве примеров плазмиды, имеющие происхождение от pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) или p Poly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201). Предпочтительно плазмида, используемая в контексте настоящего изобретения, содержит точку начала репликации, обеспечивающую инициацию репликации в продуцирующей клетке и/или клетке-хозяине (например, точка начала репликации ColE1 может быть выбрана для плазмиды, предназначенной для продуцирования в E. coli, а система oriP/EBNA1 может быть выбрана, если для нее желательно самореплицироваться в клетке-хозяине млекопитающего (Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815). Она может содержать дополнительные элементы, улучшающие ее сохранность и/или ее стабильность в данной клетке (последовательность cer, которая стимулирует мономерное сохранение плазмиды (Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103), последовательности для интеграции в клеточный геном).

Что касается вирусного вектора, возможно рассмотреть вектор, имеющий происхождение от поксвируса (вируса вакцинии, в частности, MVA, вируса оспы канареек и тому подобного), от аденовируса, от ретровируса, от вируса герпеса, от альфавируса, от обезьяньего пенистого вируса или от аденоассоциированного вируса. Предпочтительно следует использовать нерепликативный вектор. В этом отношении аденовирусные векторы наиболее конкретно пригодны для осуществления настоящего изобретения.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения вектор согласно изобретению дополнительно содержит элементы, необходимые для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению в клетке-хозяине.

Элементы, необходимые для экспрессии, состоят из группы элементов, дающих возможность транскрипции нуклеотидной последовательности на РНК и трансляции РНК на полипептид, в частности, промоторных последовательностей и/или регуляторных последовательностей, которые эффективны в указанной клетке, и возможно последовательностей, которые необходимы, чтобы дать возможность выделения или экспрессии на поверхности клеток-мишеней для указанного полипептида. Эти элементы могут быть регулируемыми или конститутивными. Конечно, промотор адаптирован к выбранному вектору и к клетке-хозяину. Для примера можно упомянуть эукариотические промоторы генов PGK (фосфоглицераткиназы), МТ (металлотионеина; Mclvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), oc-1 антитрипсина, CFTR, промоторы гена, кодирующего мышечную креатинкиназу, легочный поверхностно-активный актин, иммуноглобулин или β-актин (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRα (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. 8, 466-472), ранний промотор вируса SV40 (обезьяньего вируса), ДКП (длинный концевой повтор) RSV (вируса саркомы Рауса), промотор MPSV, промотор TK-HSV-1, ранний промотор вируса CMV (цитомегаловируса), промоторы вируса вакцинии р7,5K pH5R, pKIL, p28, pi1 и аденовирусные промоторы Е1А и MLP, либо комбинацию указанных промоторов. Ранний промотор цитомегаловируса (CMV) наиболее конкретно предпочтителен.

Согласно предпочтительному воплощению вектор по изобретению дополнительно содержит две последовательности клеточного генома, которые гомологичны участкам последовательности, содержащимся внутри области последовательности ДНК-мишени, нативной для генома. Присутствие указанных гомологичных последовательностей дает возможность сайт-специфической инсерции молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению в последовательность ДНК-мишени в результате гомологичной рекомбинации.

Термин "гомологичная рекомбинация" относится к обмену фрагментами ДНК между двумя молекулами ДНК в сайте по существу идентичных нуклеотидных последовательностей. Предпочтительно гомологичные последовательности в векторе на сто процентов гомологичны области последовательности-мишени. Однако можно использовать более низкую гомологию последовательности. Таким образом, можно использовать столь низкую гомологию последовательности, как 80%.

Гомологичные последовательности в векторе включают по меньшей мере 25 п.о., предпочтительны более длинные области, по меньшей мере 500 п.о. и более предпочтительно по меньшей мере 5000 п.о.

Согласно более предпочтительному воплощению изобретения молекула нуклеиновой кислоты окружена гомологичными последовательностями в векторе.

Как используют здесь, "окружена" означает, что одна из гомологичных последовательностей расположена до молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению и что одна из гомологичных последовательностей расположена после молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению. Как используют здесь, "окружена" не обязательно означает, что две гомологичные последовательности непосредственно сшиты с 3' или с 5' концом молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, и гомологичные последовательности могут быть разделены неограниченным числом нуклеотидов.

Как используют здесь, "последовательность ДНК-мишени" представляет собой область внутри генома клетки, которая является мишенью для модификации путем гомологичной рекомбинации с вектором. Последовательность ДНК-мишени включает структурные гены (то есть последовательности ДНК, кодирующие полипептиды, включающие в случае эукариот интроны и экзоны), регуляторные последовательности, такие как энхансерные последовательности, промоторы и тому подобное, а также другие области внутри интересующего генома. Последовательность ДНК-мишени может также представлять собой последовательность, которая, когда она направлена вектором, не обладает эффектом на функцию генома хозяина.

Как используют здесь, "встроенный в последовательность ДНК-мишени" в широком смысле означает, что процесс гомологичной рекомбинации, который приводит к инсерции молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, вводит делецию или перерыв в последовательность ДНК-мишени.

Специалист в данной области техники способен выбрать подходящие гомологичные последовательности с целью направления специфичной последовательности ДНК в геном клетки. Например, одна гомологичная последовательность может быть гомологична части последовательности ДНК-мишени, тогда как другая гомологичная последовательность гомологична последовательности ДНК, расположенной до или после последовательности-мишени. В соответствии с другим примером одна из гомологичных последовательностей может быть гомологична последовательности ДНК, расположенной до последовательности ДНК-мишени, тогда как другая гомологичная последовательность гомологична последовательности ДНК, расположенной после последовательности ДНК-мишени. В другом примере обе гомологичные последовательности гомологичны последовательностям, расположенным внутри последовательности ДНК-мишени.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения последовательность ДНК-мишени представляет собой ген HPRT (гипоксантинфосфорибозилтрансферазы).

Геномная последовательность, содержащая промотор HPRT и ген HPRT Cairina moschata, представлена в SEQ ID №:3. Последовательность, кодирующая старт HPRT при кодоне ATG в положении 8695 нуклеиново-кислотной последовательности, представлена в SEQ ID №:3, последовательность выше кодона ATG представляет собой промоторную последовательность HPRT.

Специалист в данной области техники способен выбрать гомологичные последовательности, необходимые для интеграции молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению в ген HPRT. Поскольку между различными членами семейства геномные последовательности, кодирующие HPRT, высокогомологичны среди птиц, специалист в данной области техники, таким образом, способен сконструировать гомологичные последовательности, необходимые для направления на ген HPRT других птичьих клеток.

Согласно более предпочтительному воплощению изобретения гомологичные последовательности адаптированы с целью инсерции молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению после промотора HPRT. В данном конкретном воплощении молекула нуклеиновой кислоты по изобретению оперативно сцеплена с эндогенным промотором HPRT клетки. В контексте настоящего изобретения "оперативно сцепленный" следует понимать так, что молекула нуклеиновой кислоты сцеплена с промотором таким образом, чтобы дать возможность ее экспрессии в клетке.

Согласно данному конкретному воплощению гомологичная последовательность выше молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно имеет нуклеиново-кислотную последовательность, которая гомологична по меньшей мере с 500 смежных п.о. и более предпочтительно по меньшей мере с 5000 смежных п.о. нуклеиново-кислотной последовательности, начиная от нуклеотида в положении 1 и заканчивая нуклеотидом в положении 8694 нуклеиново-кислотной последовательности, представленной в SEQ ID №:3, при условии, что указанная гомологичная последовательность не гомологична с нуклеиново-кислотной последовательностью, начиная с нуклеотида в положении 8695 и заканчивая нуклеотидом в положении 26916 нуклеиново-кислотной последовательности, представленной в SEQ ID №:3. Кроме того, эта верхняя (левая) нуклеотидная последовательность предпочтительно непосредственно сшита со стартовым кодоном молекулы нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению. Согласно даже более предпочтительному воплощению изобретения гомологичная последовательность выше молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению состоит из нуклеиново-кислотной последовательности, начиная от нуклеотида в положении 1383 и заканчивая нуклеотидом в положении 8694 нуклеиново-кислотной последовательности, представленной в SEQ ID №:3. Например, вектор согласно изобретению содержит нуклеиново-кислотную последовательность, начиная от нуклеотида в положении 1 и заканчивая нуклеотидом в положении 11227 нуклеиново-кислотной последовательности, представленной в SEQ ID №:4. Гомологичная последовательность, расположенная после молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, предпочтительно имеет нуклеиново-кислотную последовательность, которая гомологична по меньшей мере с 500 смежных п.о. и более предпочтительно по меньшей мере с 5000 смежных п.о. нуклеиново-кислотной последовательности, начиная от нуклеотида в положении 10581 и заканчивая нуклеотидом в положении 17800 нуклеиново-кислотной последовательности, представленной в SEQ ID №:3. И более предпочтительно указанная гомологичная последовательность, расположенная после молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, состоит из нуклеиново-кислотной последовательности, начиная от нуклеотида в положении 10581 и заканчивая нуклеотидом в положении 17800 нуклеиново-кислотной последовательности, представленной в SEQ ID №:3.

Согласно предпочтительному воплощению вектор по изобретению содержит первый селективный маркер, где этот первый селективный маркер представляет собой маркер положительной селекции, и где указанный первый селективный маркер и молекула нуклеиновой кислоты по изобретению расположены в одном и том же участке вектора, где границы указанного участка определены гомологичными последовательностями.

Как используют здесь, термин "маркер положительной селекции" конкретно относится к гену, кодирующему продукт, который обеспечивает выживание и/или рост только клеток, несущих этот ген, в определенных условиях. Типичные селективные маркеры кодируют белки, которые придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например к ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, комплементируют ауксотрофные дефициты или обеспечивают критические питательные вещества, недоступные из комплексной среды. В предпочтительном воплощении согласно изобретению первый селективный маркер кодирует белок, который придает устойчивость к антибиотикам.

Согласно более предпочтительному воплощению изобретения первый селективный маркер в векторе окружен последовательностями, дающими возможность его супрессии. Указанные последовательности, дающие возможность супрессии первого селективного маркера, не окружают молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению. Когда вектор является кольцевым, последовательности, дающие возможность супрессии первого селективного маркера, первый селективный маркер и молекула нуклеиновой кислоты по изобретению расположены в одном и том же участке вектора переноса, где границы указанного участка определены гомологичными последовательностями.

Последовательности, дающие возможность супрессии фрагмента нуклеиновой кислоты, хорошо известны специалистам в данной области техники (Nunes-Duby, S. et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26:391-406). Эти последовательности могут распознаваться одним или более чем одним специфичным ферментом, который индуцирует супрессию нуклеиновой кислоты, содержащейся между указанными последовательностями, где эти ферменты называют "рекомбиназами". Например, три хорошо известные рекомбиназы, дающие возможность супрессии фрагмента нуклеиновой кислоты, представляют собой рекомбиназы FLP, ISCEI и Cre.

Типичной сайт-специфической рекомбиназой является рекомбиназа Cre. Cre представляет собой 38 кДа продукт гена cre (рекомбинации циклизации) бактериофага Р1 и является сайт-специфической ДНК рекомбиназой семейства Int. Sternberg, N. et al. (1986) J. Mol. Biol. 187: 197-212. Cre распознает 34-п.о. сайт на геноме Р1, называемый loxP (локус X-over P1) и эффективно катализирует реципрокную консервативную рекомбинацию ДНК между парами сайтов loxP. Сайт loxP состоит из двух 13-п.о. инвертированных повторов, фланкирующих 8-п.о. непалиндромный коровый участок. Рекомбинация, опосредованная Cre, между двумя прямыми повторяющимися сайтами loxP приводит в результате к эксцизии ДНК между ними в виде ковалентно замкнутого кольца. Рекомбинация, опосредованная Cre, между парами сайтов loxP в обратной ориентации приведет в результате вероятнее к инверсии расположенной между ними ДНК, чем к эксцизии. Разрыв и соединение ДНК ограничено дискретными положениями внутри корового участка и иногда протекает на нити путем образования временной фосфотирозиновой связи ДНК-белок с ферментом.

Другой сайт-специфической рекомбиназой является I-Scel. Другая эндонуклеаза «хоминга» интронов, например, I-Tlil, I-Ceul, I-Crel, I-Ppol и P1-Pspl, может быть также заменена на l-Scel. Многие перечислены Belfort and Roberts ((1997) Nucleic Acids Research 25:3379-3388). Многие из этих эндонуклеаз имеют происхождение от интронов органелл, в которых использование кодонов отличается от стандартного ядерного использования кодонов. Для использования таких генов для ядерной экспрессии этих эндонуклеаз может быть необходимо изменить кодирующую последовательность, чтобы она совпадала с таковой ядерных генов. I-Scel является двунитевой эндонуклеазой, которая расщепляет ДНК внутри ее сайта распознавания. I-Scel образует 4 п.о. зигзагообразный разрыв с нависающими 3'ОН.

Фермент I-Scel имеет известный сайт распознавания. Сайт распознавания I-Scel представляет собой несимметричную последовательность, которая имеет протяженность 18 п.о.

5' TAGGGATAACAGGGTAAT 3'

3' ATCCCTATTGTCCCATTA 5'

Следовательно, в предпочтительном воплощении изобретения последовательности, дающие возможность супрессии первого селективного маркера, содержат сайт распознавания I-Scel.

Другой сайт-специфической рекомбиназой является рекомбиназа FLP. Рекомбиназа FLP распознает отдельный 34-п.о. минимальный сайт, который выдерживает только ограниченную вырожденность его последовательности распознавания (Jayaram, 1985; Senecoff et al., 1988). Взаимодействие между рекомбиназой FLP и последовательностью FRT изучено (Panigrahi et al, 1992). Примеры вариантов последовательностей FRT приведены Jayaram (1985) и Senecoff et al. (1988), и анализ на FLP-опосредованную рекомбинацию на различных субстратах описан Snaith et al. (1996).

В конкретном воплощении, где вектор по изобретению содержит последовательности, дающие возможность супрессии первого селективного маркера, указанный вектор может предпочтительно содержать первую гомологичную последовательность А и вторую гомологичную последовательность В, где гомологичные последовательности А и В имеют достаточную длину и достаточную гомологию, которые дают возможность гомологичной рекомбинации между ними. В отношении гомологичных последовательностей А и В "достаточная гомология" предпочтительно относится к последовательностям по меньшей мере с 70%, предпочтительно 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%, весьма предпочтительно по меньшей мере 99%, наиболее предпочтительно со 100% гомологии внутри этих гомологичных последовательностей на протяжении длины по меньшей мере 20 пар оснований, предпочтительно по меньшей мере 50 пар оснований, особенно предпочтительно по меньшей мере 100 пар оснований, весьма предпочтительно по меньшей мере 250 пар оснований, наиболее предпочтительно по меньшей мере 500 пар оснований. В данном воплощении вектор по изобретению содержит в 5'-3'-ориентации по отношению к молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению первую гомологичную последовательность А, последовательность, дающую возможность супрессии первого селективного маркера, первый селективный маркер, последовательность, дающую возможность супрессии первого селективного маркера, и гомологичную последовательность В.

Согласно предпочтительному воплощению вектор по изобретению содержит второй селективный маркер, который не окружен указанными гомологичными последовательностями, где указанный второй селективный маркер представляет собой маркер отрицательной селекции. Указанный второй селективный маркер особенно полезен, когда вектор по изобретению является кольцевым. Когда вектор является кольцевым, тот факт, что второй селективный маркер не окружен указанными гомологичными последовательностями, означает, что второй селективный маркер и молекула нуклеиновой кислоты по изобретению не расположены в одном и том же участке вектора переноса, где границы указанного участка определены гомологичными последовательностями.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения вектор по изобретению содержит третий селективный маркер, где указанный третий селективный маркер представляет собой маркер отрицательной селекции, и где указанный третий селективный маркер расположен между последовательностями, дающими возможность супрессии первого селективного маркера. Когда вектор является кольцевым, тот факт, что третий селективный маркер расположен между последовательностями, дающими возможность супрессии первого селективного маркера, означает, что третий селективный маркер и первый селективный маркер расположены в одном и том же участке вектора переноса, где границы указанного участка определены последовательностями, дающими возможность супрессии первого селективного маркера.

Как используют здесь, термин "маркер отрицательной селекции" конкретно относится к гену, кодирующему продукт, который уничтожает клетки, которые несут ген, в определенных условиях. Эти гены конкретно включают "суицидный ген". Продукты, кодируемые этими генами, способны трансформировать пролекарство в цитотоксическое соединение. Различные пары суицидный ген/пролекарство в настоящее время доступны. Можно более конкретно упомянуть пары:

- тимидинкиназа вируса простого герпеса типа I (HSV-1 ТК) и ацикловир или ганцикловир (GCV) (Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361);

- цитохром р450 и циклофосфамид (Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978);

- нуклеозидфосфорилаза пуринов из Escherichia coli (E.coli) и дезоксирибонуклеозид 6-метилпурин (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238);

- гуанинфосфорибозилтрансфераза из E.coli и 6-тиоксантин (Mzoz and Moolten, 1993, Human Gene Therapy 4, 589-595) и

- цитозиндезаминаза (ЦДаза) и 5-фторцитозин (5FC);

- FCUI и 5-фторцитозин (5FC) (WO 9954481);

- FCUI-8 и 5-фторцитозин (5FC) (WO 2005007857).

Первый, второй и третий селективный маркер можно использовать по отдельности. Например, вектор по изобретению может содержать первый и третий селективный маркер, но не содержать второй, или второй и третий селективный маркер, но не первый.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения первый, второй и/или третий селективный маркер помещают под контролем элементов, необходимых для их экспрессии в клетке-хозяине.

Элементы, необходимые для экспрессии, состоят из группы элементов, дающих возможность транскрипции нуклеотидной последовательности на РНК и трансляции РНК на полипептид, в частности, промоторных последовательностей и/или регуляторных последовательностей, которые эффективны в указанной клетке, и возможно последовательностей, которые необходимы, чтобы дать возможность выделения или экспрессии на поверхности клеток-мишеней для указанного полипептида. Эти элементы могут быть регулируемыми или конститутивными. Конечно, промотор адаптирован к выбранному вектору и к клетке-хозяину. Для примера можно упомянуть эукариотические промоторы генов PGK (фосфоглицераткиназы), МТ (металлотионеина; Mclvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), oc-1 антитрипсина, CFTR, промоторы гена, кодирующего мышечную креатинкиназу, легочный поверхностно-активный актин, иммуноглобулин или β-актин (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRa (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. 8, 466-472), ранний промотор вируса SV40 (обезьяньего вируса), ДКП (длинный концевой повтор) RSV (вируса саркомы Рауса), промотор MPSV, промотор TK-HSV-1, ранний промотор вируса CMV (цитомегаловируса), промоторы вируса вакцинии р7,5К pH5R, pKIL, p28, pi1 и аденовирусные промоторы Е1А и MLP, либо комбинацию указанных промоторов. Ранний промотор цитомегаловируса (CMV) наиболее конкретно предпочтителен.

Настоящее изобретение также относится к клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты или вектором согласно изобретению, и к клеткам, имеющим происхождение от нее. Как используют здесь, термин "имеющие происхождение" относится к клеткам, которые развиваются или дифференцируют из клетки, либо имеют в качестве предка клетку, трансформированную молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

Настоящее изобретение также относится к применению полипептидов, молекул нуклеиновой кислоты и векторов согласно изобретению для иммортализации клетки.

Настоящее изобретение также относится к клетке, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, где указанная молекула нуклеиновой кислоты оперативно сцеплена с эндогенным промотором HPRT клетки. "Оперативно сцепленный" следует понимать так, что молекула нуклеиновой кислоты сцеплена с промотором таким образом, чтобы дать возможность ее экспрессии в клетке. В предпочтительном воплощении клетка согласно изобретению содержит нуклеиново-кислотную последовательность, представленную в SEQ ID №:4.

Настоящее изобретение также относится к способу иммортализации клетки, включающему стадию трансфекции вектора согласно изобретению в указанную клетку.

Иммортализованная клетка, как используют здесь, относится к клетке, способной расти в культуре в течение более чем 35 пассажей.

Термин "число пассажей" относится к числу раз, которое клеточная популяция извлечена из культурального сосуда и претерпела процесс субкультивирования (пассажа) с целью поддержания клеток при достаточно низкой плотности, чтобы стимулировать дальнейший рост.

Как используют здесь, термин "трансфицированный" относится к стабильной трансфекции или транзитной трансфекции клетки по изобретению.

Термин "стабильная трансфекция" или "стабильно трансфицированный" относится к введению и интеграции чужеродной ДНК в геном трансфицированной клетки. Термин "стабильный трансфектант" относится к клетке, которая имеет стабильно интегрированную чужеродную ДНК в геномной ДНК.

Термин "транзитная трансфекция" или "транзитно трансфицированный" относится к введению чужеродной ДНК в клетку, где чужеродная ДНК неспособна интегрировать в геном трансфецированной клетки. Чужеродная ДН