Улучшенные способы иммуноанализа

Улучшенные способы иммуноанализа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

В целом изобретение относится к области диагностических или прогностических анализов, в частности к оптимизации анализов для выявления антител в образце, содержащем жидкость организма пациента, где такие антитела используют в качестве биологических маркеров болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию.

Уровень техники

Многие диагностические, прогностические анализы и/или анализы для наблюдения основаны на выявлении биологического маркера конкретного болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию. Такие биологические маркеры представляют собой обычные белки или полипептиды, характерные для конкретного заболевания или связанные с предрасположенностью к заболеванию.

В последние годы стало очевидно, что антитела, а особенно аутоантитела, также могут служить в качестве биологических маркеров заболевания или предрасположенности к заболеванию. Аутоантитела представляют собой природные антитела, направленные против антигена, который иммунная система индивида распознает как чужеродный, даже если этот антиген на самом деле образовался у индивида. Они могут находиться в кровотоке в виде циркулирующих свободных аутоантител или в виде циркулирующих иммунных комплексов, состоящих из аутоантител, которые связаны с их маркерным белком-мишенью. Различия между белком дикого типа, экспрессируемым "нормальными" клетками, и измененной формой белка, продуцируемой пораженной заболеванием клеткой или в процессе заболевания, могут в некоторых случаях приводить к тому, что измененный белок распознается иммунной системой индивида как "чужеродный", и, таким образом, у этого индивида развивается иммунная реакция. Это может быть гуморальная (т.е. опосредуемая B-клетками) иммунная реакция, приводящая к продукции аутоантител, которые иммунологически специфичны в отношении измененного белка.

В WO 99/58978 описаны способы выявления/диагностики рака на основе оценки иммунной реакции индивида на два или более различных маркеров опухоли. Как правило, эти способы включают в себя контактирование полученного у индивида образца жидкости организма с набором из двух или более различных антигенов, являющихся маркерами опухоли, где каждый получен из отдельного белка-маркера опухоли, и регистрацию образования комплексов антигенов-маркеров опухоли, связанных с циркулирующими аутоантителами, которые иммунологически специфичны в отношении белков-маркеров опухоли. Присутствие таких циркулирующих аутоантител рассматривают как указание на наличие рака.

Анализы, посредством которых у индивида измеряют иммунную реакцию на наличие белка-маркера опухоли на уровне продукции аутоантител, представляют собой альтернативу непосредственному измерению или выявлению белка-маркера опухоли в жидкостях организма. В основном такие анализы связаны с косвенной регистрацией присутствия белка-маркера опухоли. По-видимому, вследствие природы иммунной реакции образование аутоантител может быть вызвано очень небольшим количеством циркулирующего белка-маркера опухоли, и, соответственно, косвенные способы на основе регистрации иммунной реакции на маркеры опухоли, являются более чувствительными, чем способы прямого измерения количества маркеров опухоли в жидкостях организма. Поэтому способы анализа на основе регистрации аутоантител могут представлять особую ценность в начале процесса заболевания, а также, возможно, и в отношении отбора пациентов с отсутствием симптомов, например, в отборе для выявления в популяции индивидов с отсутствием симптомов, обнаруживаемых у тех индивидов, которые "имеют риск" развития заболевания, для выявления в популяции индивидов с отсутствием симптомов тех индивидов, у которых развилось заболевание. Кроме того, способ на основе регистрации аутоантител может представлять особую ценность в начале процесса заболевания, а также, возможно, его можно использовать для выявления в популяции индивидов с симптомами тех индивидов, у которых развилось заболевание. Кроме того, способы могут быть эффективны для более раннего выявления повторного заболевания. Также способы анализа могут представлять ценность для выбора или наблюдения за вариантами лечения заболевания.

Также антитела и аутоантитела могут служить в качестве биологических маркеров других состояний заболевания или предрасположенности к заболеваниям, только лишь примерами которых являются ревматоидный артрит, системная красная волчанка (SLE), первичный билиарный цирроз (PBC), аутоиммунный тиреоидит (например, тиреоидит Хашимото), аутоиммунный гастрит (например, злокачественная анемия), аутоиммунное воспаление надпочечников (например, болезнь Аддисона), аутоиммунный гипопаратиреоз, аутоиммунный диабет (например, диабет типа 1), тяжелая миастения.

Авторы настоящего изобретения выявили, что когда анализы на основе регистрации антител используют в диагностических или прогностических целях для оценки болезненного состояния, развития заболевания или предрасположенности к заболеванию у индивида в популяции, то могут возникать сложности в разработке стандартизированного способа анализа, приемлемого в целом для популяции индивидов, подлежащих скринингу, поскольку абсолютные количества присутствующего антитела значительно отличаются от индивида к индивиду. Это может приводить к высокой частоте ложноотрицательных результатов, например, среди индивидов с низким количеством антитела. Сходным образом, существует проблема количественной оценки истинных положительных результатов, поскольку различия в абсолютных количествах антитела от индивида к индивиду обуславливают сложность установления порогового значения для положительного результата анализа, которое было бы приемлемым для всех индивидов в популяции, подлежащей скринингу.

К настоящему времени авторы настоящего изобретения определили, что проведение, а более конкретно, клиническое использование и достоверность, анализов на основе выявления антител, особенно аутоантител как биологических маркеров заболевания, можно значительно улучшить посредством включения стадии титрования антигена. Тестирование образца, в котором предполагается наличие антител против серий различных количеств антигена, и построение кривой титрования дает возможность достоверно выявить истинные положительные результаты скрининга, независимо от абсолютного количества антитела, присутствующего в образце. Такой способ отличается от способов предшествующего уровня, в которых антиген титровали только для построения калибровочной кривой, позволяющей установить наиболее подходящие концентрации антигена, которые следует использовать для выявления антител в настоящих образцах от пациентов. В этих способах для фактической диагностики предложено измерение только одной точки. Таким образом, эти способы не позволяют определить различие в количествах антитела от индивида к индивиду, что, как было сказано, приводит к возникновению ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что описанный в настоящей заявке способ титрования антигена согласно изобретению имеет более высокую специфичность и чувствительность, чем измерение реактивности аутоантител при одной концентрации антигена, или чем способы, в которых титруют образец сыворотки, а не антиген.

Сущность изобретения

В первом аспекте изобретение относится к способу выявления болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию у млекопитающего, где способ включает в себя выявление антитела в тестируемом образце, содержащем жидкость из организма указанного млекопитающего, где указанное антитело является биологическим маркером болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию, где способ включает в себя

(a) контактирование указанного тестируемого образца со множеством различных количеств антигена, специфичного в отношении указанного антитела,

(b) выявление величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена,

(c) построение графика или вычисление кривой зависимости величины указанного специфического связывания от количества антигена для каждого количества антигена, используемого на стадии (a), и

(d) определение наличия или отсутствия указанного болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию на основе величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена для каждой отдельной используемой концентрации антигена.

Во втором аспекте изобретение относится к способу выявления антитела в тестируемом образце, содержащем жидкость из организма млекопитающего, где указанное антитело направлено против чужеродного вещества, введенного в организм указанного млекопитающего, где способ включает в себя

(a) контактирование тестируемого образца со множеством различных количеств антигена, специфичного в отношении указанного антитела,

(b) выявление величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена и

(c) построение графика или вычисление кривой зависимости величины указанного специфического связывания от количества антигена для каждого количества антигена, используемого на стадии (a).

В третьем аспекте изобретение относится к способу выявления антитела в тестируемом образце, содержащем жидкость из организма млекопитающего, где указанное антитело представляет собой биологический маркер болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию, где способ включает в себя

(a) контактирование тестируемого образца со множеством различных количеств антигена, специфичного в отношении указанного антитела,

(b) выявление величины специфического связывания указанного антитела и указанного антигена и

(c) построение графика или вычисление кривой зависимости величины указанного специфического связывания от количества антигена для каждого количества антигена, используемого на стадии (a).

Предпочтительно во всех аспектах изобретения, чтобы млекопитающим являлся человек.

Предпочтительно во всех аспектах изобретения, чтобы способ осуществлялся in vitro для тестируемого образца, содержащего жидкость организма, извлекаемую или получаемую у млекопитающего.

Особым свойством изобретения во всех его аспектах является то, что решение относительно наличия или отсутствия соответствующего антитела в тестируемом образце основано на величине специфического связывания, наблюдаемой для каждой отдельной тестируемой концентрации антигена, иначе говоря, на совокупных величинах, а не только на считывании при одной концентрации. Таким образом, определение наличия или отсутствия болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию или антител против чужеродного вещества в образце от пациента можно осуществлять на основе непосредственно этих совокупных величин. Предпочтительно, чтобы оценка осуществлялась на основе обычно S-образной или сигмовидной кривой, когда строят график зависимости величины специфического связывания от количества антигена. Как очевидно из представленных в настоящей заявке примеров, авторами изобретения было выявлено, что способы титрования антигена согласно изобретению имеют более высокую специфичность и чувствительность, чем способы диагностики или регистрации, основанные на единичном считывании, а также снижают частоту ложноположительных и ложноотрицательных определений.

Краткое описание чертежей

Фиг.1: измерение количества аутоантител в сыворотке с использованием кривой титрования антигена. Сыворотка 17766(C) от пациента с раком в значительной степени связывает тестируемый антиген с характерной сигмовидной кривой , но не связывается с отрицательным контролем, VOL . В сравнении с этим, сыворотка от здорового индивида, 18052(N), не связывается с тестируемым антигеном или с отрицательным контролем .

Фиг.2: сравнение уровней аутоантитела против p53 у здоровых индивидов и пациентов с первичным раком молочной железы (PBC), как измерено с использованием анализа титрования антигена. Уровни аутоантитела выражены в виде разности величины OD₆₅₀, обусловленной связыванием с тестируемым антигеном (p53), и величины OD₆₅₀, обусловленной связыванием с отрицательным контролем. Нормальный уровень (-----) рассчитывали как среднее значение плюс 2 стандартных отклонения для обычной популяции.

На фиг.3 представлено сравнение уровней аутоантител против p53 и NY-ESO у здоровых индивидов и пациентов с раком легких, как измерено с использованием анализа титрования антигена. Уровни аутоантител выражены в виде разности величины OD₆₅₀, обусловленной связыванием с тестируемым антигеном (p53 или NY-ESO), и величины OD₆₅₀, обусловленной связыванием с отрицательным контролем. Нормальные отсекаемые уровни (-----) рассчитывали как среднее значение плюс 2 стандартных отклонения для обычной популяции.

На фиг.4 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против p53 и NY-ESO в образце асцитной жидкости, полученной у пациента с раком молочной железы. Для этого пациента проводили тест, но не обнаружили продукции аутоантител против c-myc.

На фиг.5 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против BRCA1, BRCA2 и HER2 в образце сыворотки от пациента с раком молочной железы (карцинома протоков in situ).

На фиг.6 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против NY-ESO в образце сыворотки от пациента с раком легких. Для этого пациента проводили тест, но не обнаружили продукции аутоантител против p53 или c-myc.

На фиг.7 представлена кривая титрования для выявления аутоантител против NY-ESO и p53 в образце сыворотки от пациента с раком легких. Для этого пациента проводили тест, но не обнаружили продукции аутоантител против c-myc.

На фиг.8(a) и 8(b) представлены результаты двух независимых анализов титрования для аутоантител против p53, c-myc и NY-ESO-1 в образцах сыворотки от "здорового" индивида (т.е. индивида без признаков рака).

На фиг.9(a) и 9(b) представлены результаты двух независимых анализов титрования, выполненных для образцов сыворотки от одного пациента с инвазивным раком молочной железы с использованием диапазона различных антигенов.

На фиг.10(a) и 10(b) представлены результаты анализов титрования, в которых образцы сыворотки от клинически нормального человека тестировали на наличие аутоантител с использованием биотинилированных антигенов BRCA2, HER2, c-myc и NY-ESO-1, небиотинилированного BRCA1 и контрольных продуктов экспрессии "пустого" вектора VOL, кодирующего биотиновую метку, но без дополнительного антигена.

На фиг.11 представлены результаты анализа аутоантител у пациента с первичным раком молочной железы с использованием анализа титрования антигена согласно изобретению в отношении антигенов p53, c-myc и NY-ESO-1 и контрольных продуктов экспрессии "пустого" вектора VOL.

На фиг.12 представлены результаты повторного анализа, представленного на фиг.11, но с использованием сыворотки от здорового индивида.

На фиг.13 представлены дополнительные результаты, полученные с использованием анализа титрования антигена в соответствии с данным изобретением для пациента с первичным раком молочной железы, у которого, однако, также наблюдают реакцию антител на биотин.

На фиг.14 на нормальных образцах представлены результаты экспериментального сравнения, полученных при анализе регистрации аутоантител, когда антиген титруют в соответствии с изобретением, и при анализе регистрации аутоантител, когда количество антигена остается постоянным, а титруют сыворотку.

На фиг.15 представлены результаты экспериментального сравнения для образца от пациента с первичным раком молочной железы, полученные при анализе регистрации аутоантител, когда антиген титруют в соответствии с изобретением, и при анализе регистрации аутоантител, когда количество антигена остается постоянным, а титруют сыворотку.

Подробное описание изобретения

В целом изобретение относится к способу иммуноанализа для выявления антитела, служащего биологическим маркером болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию, где способ характеризуется тем, что образец, подлежащий тестированию на наличие антитела, тестируют на предмет специфического связывания с различными количествами специфичного в отношении антитела антигена, и получают кривую титрования по связыванию антиген-антитело в зависимости от количества тестируемого антигена.

Общие характеристики иммуноанализов, например, ELISA, радиоиммунных анализов и т.п., хорошо известны специалистам в данной области (см. Immunoassay, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996). Как правило, иммуноанализы для выявления антител с конкретной иммунологической специфичностью требуют использования реагента (антигена), обладающего специфической иммунологической реактивностью в отношении тестируемого антитела. В зависимости от схемы анализа, этот антиген может быть иммобилизован на твердом носителе. Образец, подлежащий тестированию на наличие антитела, приводят в контакт с антигеном, и если антитела требуемой иммунологической специфичности присутствуют в образце, то они иммунологически взаимодействуют с антигеном, образуя комплексы антиген-антитело, которые затем можно выявлять или измерять количественно.

Способ согласно изобретению характеризуется тем, что стандартизированный образец, подлежащий тестированию на наличие антитела, тестируют против множества различных количеств антигена (также называемых в настоящей заявке сериями титрования). Образец тестируют против по меньшей мере двух, а предпочтительно, трех, четырех, пяти, шести или семи различных количеств антигена. Также обычные анализы могут включать отрицательный контроль, не содержащий какого-либо антигена.

В этом контексте термин "антиген" относится к веществу, содержащему по меньшей мере одну антигенную детерминанту или эпитоп, способный специфически взаимодействовать с антителом-мишенью, которое требуется выявить, или к любому веществу для захвата, специфически взаимодействующему с вариабельной областью или гипервариабельными участками указанного антитела. Как правило, антиген представляет собой природную или синтетическую биологическую макромолекулу, такую, например, как белок или пептид, полисахарид или нуклеиновая кислота, и может содержать антитела или их фрагменты, например, антиидиотипические антитела.

Специалисты в данной области понимают, что в способе согласно изобретению количество антигенных детерминант или эпитопов, доступных для связывания с антителом-мишенью, является важным для получения серий титрования. Во многих схемах анализа количество доступных для связывания антигенных детерминант или эпитопов прямо связано с количеством присутствующих молекул антигена. Однако в других вариантах осуществления, например, в определенных системах твердофазного анализа, количество подвергающихся воздействию антигенных детерминант или эпитопов может не быть прямо связано с количеством антигена, а может зависеть от других факторов, таких как прикрепление к твердому носителю. В этих вариантах осуществления ссылки в настоящей заявке на "различные количества антигена" в сериях титрования могут относиться к различным количествам антигенной детерминанты или эпитопа.

Относительную или абсолютную величину специфического связывания антитела и антигена определяют для каждого отдельного используемого количества антигена (антигенной детерминанты или эпитопа) и применяют для построения или расчета кривой (относительной или абсолютной) величины специфического связывания в зависимости от количества антигена для каждого тестируемого количества антигена. Характерные результаты проиллюстрированы на прилагающихся фигурах, только с целью примера, в отношении выявления множества различных антител. Наличие в тестируемом образце антитела, которое реакционноспособно в отношении используемого в анализе антигена, определяют на основе величины специфического связывания, наблюдаемого для каждого количества антигена, и обычно указывают посредством, в основном, S-образной или сигмовидной кривой. Как правило, абсолютные величины специфического связывания антитела и антигена не являются вещественными, за исключением случая, когда требуется осуществить количественное измерение. Для простого определения да/нет в отношении наличия или отсутствия антител достаточно только получить кривую надлежащей формы. Если различие в выявляемых величинах связывания для различных тестируемых количеств антигена отсутствует, то это можно оценивать как отсутствие поддающегося выявлению количества антитела. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения способ не является количественным. Таким образом, он способен обеспечить определение да/нет в отношении наличия или отсутствия антитела при использовании безразмерного пропорционального соотношения, которое не зависит от интенсивности сигнала.

Оценку количества антитела, присутствующего в конкретном образце, можно, при необходимости, получать из результатов анализов титрования антигена.

Способ согласно изобретению предпочтителен для использования в клинических, диагностических, прогностических, предсказательных и/или контролирующих анализах, где абсолютные количества присутствующего антитела-мишени могут значительно отличаться от пациента к пациенту. Авторами настоящего изобретения было выявлено, что если такие анализы основаны на регистрации связывания антитела с использованием единственной величины количества/концентрации тестируемого антигена, то образцы от пациентов, содержащие антитело в количестве, которое находится у самой нижней или самой верхней границы нормального физиологического диапазона для количества антитела среди популяции, могут быть пропущены вследствие ограничений способа анализа; образцы с низким количеством антитела могут быть оценены как ложноотрицательные результаты, тогда как образцы с очень высокими уровнями антитела могут выходить за пределы шкалы точной регистрации для выбранного способа анализа.

Также способ анализа титрования согласно изобретению особенно эффективен для регистрации антител/аутоантител как биологических маркеров болезненного состояния или предрасположенности, где от пациента к пациенту существуют значительные различия в специфичности и аффинности антител/аутоантител в отношении антигена-мишени. По самой своей природе реакции аутоантител могут значительно различаться от пациента к пациенту, где различия возникают как в абсолютных количествах присутствующих аутоантител, так и в специфичности/аффинности аутоантител. В способе согласно изобретению может учитываться такое различие от пациента к пациенту, что, таким образом, обеспечивает возможность разработки стандартной схемы анализа для любого рассматриваемого антитела/аутоантитела.

Как правило, взаимодействия между аутоантителами и их антигенами-мишенями обладают низкой аффинностью, однако прочность связывания может различаться от пациента к пациенту, как указано выше. Способ согласно изобретению особенно эффективен для регистрации связывания с низкой аффинностью, поскольку положительный результат можно выводить из формы кривой титрования.

Также способ согласно изобретению обеспечивает защиту от различий от суток к суткам в проведении иммуноанализов, используемых для выявления аутоантител/антител в целях диагностики, прогнозирования и/или наблюдения (за состоянием заболевания или лечением). Часто наблюдают, что при проведении иммуноанализов для выявления антител в образцах, содержащих жидкости организма пациента, могут быть значительные различия величины сигнала от суток к суткам. Такое отличие может возникать, например, вследствие различий в способе получения и хранения образцов до тестирования. Такие факторы затрудняют достоверную количественную оценку результатов клинических анализов, например, на основе простой пороговой величины для связывания антитело/антиген. Настоящее изобретение минимизирует эффекты такого различия от суток к суткам, поскольку положительный результат в отношении наличия антитела четко виден из формы кривой титрования вне зависимости от величины сигнала.

Дополнительные преимущества способа согласно изобретению состоят в том, что он предоставляет возможность разведения образца от пациента, обеспечивая при этом достоверные результаты, а также в том, что, как правило, способ приводит к получению одинакового по качеству результата скрининга (положительного/отрицательного) при использовании жидкостей организма из различных источников из одного индивида (например, кровь или сыворотка в сравнении с асцитной жидкостью или плевральным выпотом), даже если абсолютная концентрация антител в различных жидкостях может отличаться.

Способ согласно изобретению можно осуществлять по любой приемлемой схеме, позволяющей контактирование образца, в котором предполагают наличие антитела, и антигена во множестве различных количествах. Удобно, что контактирование образца и различных количеств антигена можно осуществлять в отдельных, но параллельных реакционных камерах, таких как лунки планшета для микротитрования. Различные количества антигена можно наносить в лунки планшета для микротитрования посредством получения серийных разведений из исходного источника антигена на протяжении лунок планшета для микротитрования. Исходный источник антигена может иметь известную или неизвестную концентрацию. Затем в лунки планшета можно добавлять аликвоты тестируемого образца при сохранении в каждой лунке постоянного объема и разведения тестируемого образца. Абсолютные количества антигена, добавляемого в лунки планшета для микротитрования, могут различаться в зависимости от таких факторов, как природа антитела-мишени, природа тестируемого образца, разведение тестируемого образца и т.д., как понимают специалисты в данной области. Как правило, количества антигена и разведение тестируемого образца выбирают таким образом, чтобы получить диапазон интенсивности сигнала, входящий в приемлемый регистрируемый диапазон для считывания данных, выбранного в способе для выявления связывания антитело/антиген. Общепринятые количества и разведения для тестирования образцов сыворотки человека, в которых предполагают наличие аутоантител против маркеров опухоли, приведены в прилагаемых примерах. Удобно, что тестируемые количества антигена могут различаться в диапазоне от 0,01 мкг/мл до 10 мкг/мл.

Как указано выше, также существует возможность строить кривую титрования, начиная с единственного исходного источника антигена, даже если абсолютная концентрация антигена в исходном источнике неизвестна. При условии, что используют один и тот же единственный исходный раствор и осуществляют серийные разведения одним и тем же способом, существует возможность сравнивать результаты отдельных анализов титрования этого антигена, осуществляемых с различными исходными тестируемыми образцами.

В другом варианте осуществления различные количества антигена (антигенных детерминант или эпитопов) могут быть зафиксированы в отдельных положениях или реакционных участках на твердом носителе. После этого весь носитель можно приводить в контакт с тестируемым образцом и регистрировать или измерять связывание антитела с антигеном в каждом из отдельных положений или реакционных участков. Приемлемые твердые носители также включают в себя микрочипы, например, чипы, где отдельные участки или точки на чипе содержат различные количества антигена. Микрочипы можно получать фиксированием различных количеств конкретного антигена в отдельных, поддающихся разрешению реакционных участках на чипе. В других вариантах осуществления фактическое количество фиксированных молекул антигена можно поддерживать практически постоянным, однако размер участков или точек на чипе меняют для изменения количества доступного связывающего эпитопа, обеспечивая серии титрований участков или точек с различными количествами доступного связывающего эпитопа. В таких вариантах осуществления для получения серий титрования важна концентрация двумерной поверхности связывающего эпитопа(ов) на антигене, а не абсолютное количество антигена. Способы получения и считывания данных для белковых/пептидных микрочипов общеизвестны в данной области.

Из приведенного выше описания понятно, что во всех вариантах осуществления изобретения различие в количестве антигена можно получать изменением плотности антигена или эпитопа, против которого тестируют образец, или посредством поддержания плотности антигена или эпитопа, но при увеличении площади поверхности, на которой закреплен антиген, или посредством обоих способов.

Микрочипы можно использовать для проведения параллельно множества анализов для антител различной специфичности для одного образца. Это можно осуществлять с использованием чипов, содержащих множество наборов различных антигенов, где каждый набор содержит конкретный антиген во множестве различных количеств или концентраций. Термин "различные антигены" включает антигены, получаемые из различных белков или полипептидов (например, антигены, получаемые из неродственных белков, которые кодируются различными генами), а также антигены, получаемые из различных пептидных эпитопов одного белка или полипептида. Рассматриваемый микрочип может содержать только наборы различных антигенов, полученных из различных белков или полипептидов, или только наборы различных антигенов, полученных из различных пептидных эпитопов одного белка или полипептида, или смесь двух наборов в любом соотношении. Следует отметить, что каждый отдельный набор антигена в различных количествах или концентрациях в любом из вариантов осуществления изобретения, как правило, содержит только один антиген, а не его смеси.

В рамках настоящей заявки термин "жидкость организма" в отношении вещества, подлежащего тестированию на наличие антител с использованием способа согласно изобретению, включает, наряду с прочим, плазму, сыворотку, цельную кровь, мочу, пот, лимфу, фекалии, спинномозговую жидкость, асцитную жидкость, плевральный выпот, сперму, мокроту, аспират из сосков, послеоперационное опухолевидное скопление сыворотки или жидкость в результате дренирования раны. Как указано выше, способы согласно изобретению предпочтительно осуществляют in vitro для тестируемого образца, содержащего жидкость организма, которую получают у тестируемого индивида. Тип используемой жидкости организма может различаться в зависимости от природы антитела, подлежащего тестированию, и клинического состояния, при котором используют анализ. Как правило, предпочтительно проводить анализы для образцов сыворотки или плазмы. В дополнение к жидкости организма тестируемый образец может содержать добавочные компоненты, такие как, например, разбавители, консерванты, стабилизаторы, буферные вещества и т.д.

В рамках настоящей заявки термин "антиген" используют в широком смысле для обозначения любого вещества, проявляющего специфическую иммунологическую реактивность в отношении подлежащего выявлению антитела-мишени. Приемлемые антигены могут включать в себя, но ими не ограничиваются, природные белки, рекомбинантные или синтетические белки или полипептиды, синтетические пептиды, пептидомиметики и т.д., а также полисахариды и нуклеиновые кислоты. Конкретно, при использовании в настоящей заявке термина "антиген" подразумевают, что он включает в себя любое вещество для захвата, имеет ли оно человеческое происхождение, происхождение от млекопитающего или иное, где вещество способно к специфическому иммунологическому взаимодействию со множеством гипервариабельных участков антитела, подлежащего выявлению. Например, с этой целью в качестве антигена можно также рассматривать антиидиотипические антитела, как можно рассматривать антигены, получаемые посредством фагового дисплея.

Определенные антигены могут содержать или быть получены из белков или полипептидов, которые выделяют из природных источников, включая в себя, но ими не ограничиваясь, белки или полипептиды, выделяемые из ткани или жидкостей из организма пациента. В таких вариантах осуществления антиген может содержать практически весь природный белок, т.е. белок практически в том виде, в котором его выделяют из природного источника, или он может содержать фрагмент природного белка. Для того, чтобы быть эффективным в качестве антигена в способе согласно изобретению, любой такой "фрагмент" должен сохранять иммунологическую реактивность в отношении антител, для которых его используют в тестировании. Например, приемлемые фрагменты можно получать химическим или ферментативным расщеплением выделенного белка.

В зависимости от точного характера анализа, в котором его используют, антиген может содержать природный белок или его фрагмент, связанный с одной или несколькими дополнительными молекулами, которые придают некоторые желаемые характеристики, отсутствующие у белка в природе. Например, белок или фрагмент можно конъюгировать с регистрируемой меткой, такой как, например, флуоресцентная метка, цветная метка, люминесцентная метка, радиоактивная метка или тяжелый металл, такой как коллоидное золото. В других вариантах осуществления белок или фрагмент можно экспрессировать в виде слитого белка. В качестве примера, слитые белки могут содержать пептид-метку на N- или C-конце для способствования очистке рекомбинантно экспрессируемого антигена.

В зависимости от схемы анализа, в котором его подлежит использовать, антиген может быть зафиксирован на твердом носителе, таком как, например, лунки планшета для микротитрования, гранулы микрочипов или чипы или магнитные гранулы. Фиксацию можно осуществлять нековалентной адсорбцией или ковалентным присоединением.

Можно использовать любые приемлемые способы присоединения при условии, что это в значительной степени не оказывает неблагоприятного эффекта на способность антигена иммунологически реагировать с антителом-мишенью.

Изобретение не ограничено твердофазными анализами, но также включает анализы, которые полностью или частично проводят в жидкой фазе, например, анализы с гранулами в жидкой фазе.

В одном из вариантов осуществления антигены могут быть мечены лигандом, способствующим фиксации, например, биотином. Затем антиген можно разводить до приемлемого диапазона титрования и после этого позволять реагировать в растворе с аутоантителами в образцах от пациентов. После этого получаемые иммунные комплексы можно фиксировать на твердом носителе посредством взаимодействия лиганд-рецептор (например, биотин-стрептавидин) и проводить остальную часть анализа, как описано ниже.

Для способствования получению биотинилированных антигенов для использования в способах анализа согласно изобретению кДНК, кодирующие полноразмерный антиген, его усеченный вариант или его антигенный участок, можно экспрессировать в виде слитого белка, меченного белковой или полипептидной меткой, к которой можно посредством ферментативной реакции присоединять вспомогательный биотиновый фактор. Векторы для получения рекомбинантных биотинилированных антигенов коммерчески доступны во множестве источников.

Как проиллюстрировано в прилагаемых примерах, дополнительное преимущество использования способа кривой титрования вместе с биотинилированными антигенами состоит в том, что анализ позволяет различить связывание биотинового компонента с антителами против биотина и истинное связывание антигена с родственным ему антителом. Авторами изобретения было выявлено, что у значительного количества популяции людей в природе продуцируются антитела против биотина, что может приводить к ложноположительным результатам в анализах, основанных на ис