Средство, обладающее антихеликобактерным действием

Средство, обладающее антихеликобактерным действием

Реферат

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средства, обладающего антихеликобактерным действием.

В настоящее время установлено, что бактерии Helicobacter pylori (HP) являются причиной развития хеликобактерного хронического гастрита, одним из важнейших факторов патогенеза язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и желудка, лимфомы желудка низкой степени злокачественности, а также рака желудка. Лечение ряда заболеваний гастродуоденальной зоны включает в себя в качестве обязательного компонента проведение эрадикационной терапии в случае обнаружения у больных в слизистой оболочке желудка H.pylori. Существующие схемы стандартной антихеликобактерной терапии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки сопровождаются побочными эффектами, атрофическими явлениями в слизистой желудка. Трехкомпонентная антибактериальная терапия с омепразолом не устраняет желудочную метаплазию слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, эрадикационный эффект современных антихеликобактерных схем (2-5 препаратов) колеблется от 65-94%. Вместе с тем увеличивается риск осложнений от лечения, появляются резистентные к терапии формы H.pylori, дисбактериоз. Наличие у больного устойчивого штамма делает данную терапию абсолютно бесперспективной, и даже 100% эрадикация Н.pylori еще не гарантирует от рецидива язвенной болезни. Оптимальная терапия «второй линии» после неудачной терапии Н. pylori еще не разработана. Современная фармакотерапия язвенной болезни не учитывает разнообразные сочетания факторов патогенеза заболевания у конкретного больного, недостаточно эффективна, небезопасна, не имеет в своем арсенале патогенетически обоснованных универсальных средств, обладающих цитопротекторным действием. Все вышесказанное обусловливает целесообразность поиска и разработки эффективных лекарственных препаратов, обладающих антихеликобактерным действием.

Наиболее близким является лекарственное средство Де-Нол (висмута трикалия дицитрат), который применяют преимущественно для лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, при активном хроническом гастродуодените и диспепсии, ассоциированных с Helicobacter pylori (в комбинации с антисекреторными средствами и антибиотиками). Де-Нол является антацидным средством, однако при приеме внутрь (в виде таблеток) он постепенно образует коллоидную массу, распределяющуюся по поверхности слизистой оболочки желудка, обволакивая париетальные клетки, оказывает не только антацидное, но и цитопротекторное действие. Практически не всасывается в ЖКТ.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств для лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки и других гастроэнтерологических заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori.

Поставленная задача достигается применением в качестве антихелибактерного средства низкоэтерифицированного некрахмального полисахарида со степенью этерификации - 1,2%, молекулярной массой - 39,3 кДа - пектата кальция, полученного из коммерческого цитрусового высокоэтерифицированного пектина (Copenhagen Pectin A/S, Lille Scensved, Дания). Пектат кальция представляет собой сухой белый порошок и имеет следующие физико-химические характеристики: содержание ангидрогалактуроновой кислоты - 67,3% и кальция - 38 мг/г образца, степень этерификации - 1,2%, молекулярная масса - 39,3 кДа.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что низкоэтерифицированный некрахмальный полисахарид пектат кальция с идентифицированной физико-химической структурой проявляет выраженное антихеликобактерное действие in vitro (культура Helicobacter pylori). Ранее были известны следующие свойства: пребиотическая активность (патент на изобретение №2366429) и профилактическое действие для предотвращения развития язвенных поражений желудка, вызванных приемом нестероидных противовоспалительных средств (патент на изобретение №2330671).

Пектат кальция получали из коммерческого пищевого цитрусового пектина методом ионного обмена в неводной среде. На 1-м этапе проводили щелочную деэтерификацию пектина. Для этого 100 г пектина суспендировали в 500 мл 50% об. этанола, нагретого до 40°C. Смесь перемешивали при данной температуре в течение 25-30 мин и фильтровали через бязевый фильтр под вакуумом. Пектин на фильтре промывали 400 мл 50% об. этанола. Промытый пектин суспендировали в 500 мл 50% об. этанола и термостатировали при температуре 10-15°C. Затем к смеси добавляли 0,02 г индикатора тимолфталеина и при постоянном перемешивании, постепенно, порциями по 50 мл добавляли 1 М раствор NaOH в 50% об. этаноле. Каждую последующую порцию NaOH добавляли только после обесцвечивания окраски индикатора. Температуру смеси поддерживали в диапазоне 10-15°C. Процесс заканчивали, когда после добавления очередной порции NaOH не происходило изменение окраски индикатора в течение 1 часа. По окончании процесса полученную смесь нейтрализовали добавлением 100 мл 1 М раствора HCl в 50% об. этаноле, фильтровали через бязевый фильтр под вакуумом и затем промывали 400 мл 50% об. этанола.

На 2-м этапе промытый пектин суспендировали в 500 мл 50% об. этанола и при непрерывном перемешивании постепенно добавляли 20 г хлористого кальция, растворенного в 200 мл 50% об. этанола. Смесь перемешивали еще в течение 20 минут и фильтровали через бязевый фильтр под вакуумом. Образовавшийся пектат кальция промывали на фильтре последовательно 400 мл 50% об. этанола, 200 мл 70% об. этанола и 200 мл 95% об. этанола. Промытый пектат кальция сушили при 80°C до остаточной влажности не более 6%.

Применение некрахмального полисахарида пектата кальция в качестве антихелибактерного средства в литературе не описано. Эти новые свойства пектата кальция явным образом не вытекают из уровня техники и неочевидны для специалиста. Пектат кальция может применяться в качестве антихеликобактерного средства в комплексной антихеликобактерной терапии контингента больных согласно решениям согласительного совещания EHPSG в Майстрихте (Нидерланды) в сентябре 2000 г.

В качестве тест-объекта использован музейный штамм Helicobacter pylori, полученный из коллекции культур кафедры микробиологии ГОУ ВПО СибГМУ, обладающий всеми типичными свойствами для данного вида микроорганизмов. Штамм бактерий восстановлен из высушенной методом лиофильной сушки культуры путем разведения и трехкратного пересева с последующей окраской по Граму и идентификацией под микроскопом. В качестве дополнительных методов идентификации культуры были использованы геликобактер-тест (пр-ва НИИ ЭКФ, Санкт-Петербург) и каталазный тест (добавление культуры хеликобактер в каплю 3% перекиси водорода и ее вскипание в течение 3-5 сек).

Культура Helicobacter pylori выращивалась на стандартизованных питательных средах: полужидком мясо-пептонно-печеночном агаре и шоколадном агаре, приготовленном на основе Колумбийского агара (HiMedia Laboratories. Pvt. Ltd. Mumbai, India).

Приготовление питательных сред

1. Полужидкий мясо-пептонно-печеночный агар. В состав среды входят: мясная вода (250 мл), печеночный отвар (250 мл), вода дистиллированная (500 мл), пептон бактериологический сухой (10 г), натрий хлористый (5 г), агар-агар (1,6 г), pH среды 7,2-7,4. Питательная среда описанного состава после непродолжительного кипячения без пригорания стерилизуется в режиме автоклава при 1,1 атм и 121°C в течение 20 мин. Остуженная до 45°C питательная среда разливается по 5 мл в стерильные пробирки.

2. Шоколадный агар. В состав среды входят: Колумбийский агар (37 г), вода дистиллированная (1000 мл), стерильная цельная человеческая кровь (50 мл), смесь антибиотиков (полимиксин В, ванкомицин и цефазолин), pH среды 6,8-7,0. В питательную среду после растворения Колумбийского агара и непродолжительного кипячения добавляется 2,5% цельной донорской крови. Шоколадный агар должен иметь светло-коричневую окраску. Затем среда стерилизуется в режиме автоклава при 1,1 атмосфер и 121°C в течение 20 мин. В остуженную до 50°C питательную среду добавляется 2,5% стерильной лизированной донорской крови и смесь антибиотиков, затем готовый шоколадный агар разливается по чашкам Петри.

Постановка экспериментов по изучению влияния пектата кальция на рост Helocibacter pylori

Для посева были использованы суточные культуры микроорганизмов в разведении 500 микробных тел (по стандарту мутности), которые контролировали микроскопически. К взвеси микроорганизмов был добавлен стерильный физиологический раствор (контрольные пробирки) или растворы пектата кальция (на физ. растворе) в концентрациях 2% и 4%. Для достоверности результатов пробирки дублировались. Через 24 ч производили посев культур из пробирок на чашки Петри в количестве 0,05 мл, стеклянным стерильным шпателем, равномерно распределяя по поверхности питательной среды. Посевы помещали в анаэростат (ВВ1 GasPak Anaerobic Systems, Becton Dickinson, USA), для создания микроаэрофильных условий были использованы газогенераторные пакеты (ВВ1 CampyPak Plus, Becton Dickinson, USA). Анаэростат был помещен в термостат с температурой 37°C на 48-72 ч. По истечении суток подсчитывали количество выросших колоний на чашке, которые представляли собой мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм, имеющие характерное золотисто-желтое окрашивание. Для достоверности результатов чашки Петри дублировались. Чистоту культур микроорганизмов контролировали под микроскопом. В качестве дополнительных методов идентификации культуры были использованы геликобактер-тест (пр-ва НИИ ЭКФ, Санкт-Петербург) и каталазный тест (добавление культуры хеликобактер в каплю 3% перекиси водорода и ее вскипание в течение 3-5 сек).

Результаты исследований представлены в примерах 1-2.

Пример 1. В результате эксперимента показано снижение количества выросших колоний Helocibacter pylori в чашке Петри при использовании пектата кальция в концентрациях 2 и 4% через 48 ч экспозиции. Выявлена существенная ингибиция числа колоний в 11 и 2,2 раза соответственно относительно контрольных значений (табл.1). Максимальный антихеликобактерный эффект отмечался при использовании пектата кальция в 2% концентрации.

Таблица 1
Влияние пектата кальция на рост культуры Helocibacter pylori
Название группы, концентрация (количество наблюдений)	Количество колоний Helocibacter pylori в чашке Петри
через 48 ч
1. Контроль (физ. раствор), (n=2)	60	50
2. Пектат кальция, 2% (n=2)	10	0
3. Пектат кальция, 4% (n=2)	20	30

Пример 2. Для определения антихеликобактерного действия пектата кальция исследовали влияние полисахарида в концентрациях 2% и 4% через 72 ч экспозиции на рост Helocibacter pylori.

Аналогичные изменения отмечались через 72 ч наблюдения: существенное снижение числа колоний культуры Helocibacter pylori в 12 (2%) и 2,4 (4%) раза по сравнению с таковыми значениями чашек Петри с чистой культурой.

Таблица 2
Влияние пектата кальция на рост культуры Helocibacter pylori
Название группы, концентрация (количество наблюдений)	Количество колоний Helocibacter pylori в чашке Петри
через 72 ч
1. Контроль (физ. раствор), (n=2)	70	50
2. Пектат кальция, 2% (n=2)	10	0
3. Пектат кальция, 4% (n=2)	20	30

Таким образом, в результате экспериментов выявлено подавление роста культуры Helocibacter pylori через 48 и 72 ч экспозиции, более выраженное при использовании пектата кальция в концентрации 2%.

Источники информации

1. Гуляев П.В. Адаптационные механизмы слизистой оболочки желудка и факторы, определяющие исходы терапии кислотозависимых заболеваний, ассоциированных с Helocibacter pylori на догоспитальном этапе. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология - 2009. - №4. - С.30-34.

2. Крылова С.Г., Хотимченко Ю.С., Зуева Е.П., Амосова Е.Н., Разина Т.Г., Ефимова Л.А., Хотимченко М.Ю., Ковалев В.В. Гастрозащитное действие некрахмальных полисахаридов природного происхождения. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2006. - Т.142. - №10. - С.437-441.

3. Сарсенбаева А.С., Игнатова Г.Л., Воротникова СВ. Методы диагностики инфекции Helocibacter pylori. Учебное пособие.-Челябинск, 2005 г. - 50 с.

4. Подопригора В.Г. Оксидативный стресс и язвенная болезнь. - М.: Медицина, 2004. - С.22-28.

5. Патент №2330671 (RU) «Способ профилактики язвенных поражений желудка, вызванных приемом нестероидных противоспалительных средств». Авторы: Зуева Елена Петровна, Хотимченко Максим Юрьевич, Крылова Светлана Геннадьевна, Ефимова Лариса Анатольевна, Разина Татьяна Георгиевна, Амосова Евдокия Наумовна, Хотимченко Юрий Степанович. Опубликовано: 10.08.2008 Бюл. №22.

6. Патент №2366429 (RU) «Средство, обладающее пребиотической активностью». Авторы: Крылова Светлана Геннадьевна, Ефимова Лариса Анатольевна, Красноженов Евгений Павлович, Зуева Елена Петровна, Юрий Степанович Хотимченко, Максим Юрьевич Хотимченко, Валерий Владимирович Ковалев. Опубликовано: 10.09.2009. Бюл. №25.

7. Kliotimchenko М., Zueva Е., Krylova S., Lopatina К., Khotimchenko Y., Rasina Т. Gastroprotective activity of pectins against acute indomethacine-induced gastric mucosal injury in rats. // Acta Pharmacologica Sinica (The 15-th World Congress of Pharmacology- China, 2006) - P.242.

8. Крылова С.Г., Ефимова Л.А., Зуева Е.П., Хотимченко Ю.С., Разина Т.Г., Амосова Е.Н., Лопатина К.А., Фомина Т.И. Противоязвенное действие некрахмальных полисахаридов. // Вестник РАМН - 2009. - №11 - С.35-39.

Применение низкоэтерифицированного некрахмального полисахарида пектата кальция со степенью этерификации - 1,2%, молекулярной массой - 39,3 кДа в качестве антихеликобактерного средства.