Соединения, представляющие собой пептидные аналоги стимуляторов секреции гормона роста, и содержащие их препараты

Соединения, представляющие собой пептидные аналоги стимуляторов секреции гормона роста, и содержащие их препараты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение может быть отнесено к области рационального дизайна биологически активных молекулярных образований, регулирующих метаболическую активность и клеточную защиту организмов. Более конкретно изобретение может быть отнесено к области соединений, представляющих собой пептидные аналоги стимуляторов секреции гормона роста, чья активность включает, но не ограничена ими: контролируемое высвобождение гормона роста, кардиопротекцию, увеличение функционального ответа кардиоваскулярной системы, нейропротекцию, регуляцию и контроль аппетита, потребления жира и энергетический метаболизм.

Уровень техники

Синтетические стимуляторы секреции гормона роста (GH) состоят из семейства лигандов, включающих пептидные и непептидные молекулы, впервые описанные Momany и Bowers перед выделением синтетических пептидов GH-высвобождающего гормона (GHRH) из 6 и 7 аминокислот с получением в результате потенциальных GH-высвобождающих пептидов (GHRP); такие пептиды были описаны до того, как стало известно об их функции в организме или пути их действия. Мутационные исследования и in vivo и in vitro эксперименты обнаружили два расположения аминокислот L-D и D-L, разделенные одной аминокислотой, действующей в качестве спейсера, их рассматривали как оптимальные для GH-высвобождающей активности, и пептид (His-D-Trp-Ala-D-Trp-Phe-NH2) был адаптирован для высвобождения GH в концентрации 10-30 нг/мл с получением пептида известного как GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2), где остаток Lys необходим только для улучшения in vivo активности, поскольку считается, что он не является функциональным in vitro (Momany F.A., Bowers C.Y. et al. (1981) Design, synthesis and biological activity of peptides which release growth hormone, in vitro. Endocrinology, 108:31-39).

Были открыты другие аналогичные пептиды: в 1983 Bowers et al. открыли два GHRP-6-аналогичных пептида, GHRP-2 (D-Ala-D-β-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2) и GHRP-1 (Ala-His-D-β-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2). Эти три стимулятора секреции демонстрировали высвобождение GH и увеличение высвобождения GH in vitro из инкубированного гипофизарного гипоталамуса, полученного индивидуально из гипофиза, демонстрируя, что гипоталамусный импульс является важным при таком действии, также было продемонстрировано даже для людей, что при синергическом действии GHRP и GHRH высвобождается больше GH, чем при индивидуальном действии каждого из них (Bowers C.Y. (1993) GH-releasing peptides: structure and kinetics. J Pediatr Endocrinol, 6(1):21-31).

На основе пептида, известного как GHRP-2, были получены новые циклические пептиды путем замены N-концевого D-Ala на аминокислоту, имеющую боковую цепь, связанную с другой аминокислотой, вставленной между D-Phe и Lys. Один их таких пептидов (D-Lys-D-β-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Glu-Lys-NH2) был получен в результате с 10-кратно увеличенной активностью in vitro и со сравнимой эффективностью in vivo по отношению к GHRP-6 (McDowel R.S. et al. (1995) Growth hormone secretagogues: characterization, efficacy, and minimal bioactive conformation. PNAS USA, 92(24):11165-11169). Эксперименты были завершены структурными исследованиями раствора DL циклических пептидов, которые привели к заключению, что введение D-аминокислот в пептидные соединения были, по существу, необходимы для того, чтобы получить желаемую активность. Другие исследования были направлены на обнаружение активных молекул с увеличенной пероральной биодоступностью и более продолжительным временем выведения с получением в итоге открытий новых молекул GHRP и других не пептидных молекул. В 1993 году был впервые описан стимулятор секреции GH (Smith R.G. et al. (1993) A nonpeptidyl growth hormone secretagogue. Science, 260:1640-43) и позднее опубликован синтез не пептидных молекул с большим потенциалом - GHS, MK-067, обладающих большей биодоступностью и способных стимулировать секрецию GH через 24 часа после единичной дозы перорального введения (Patchett A.A., Nargund R.P. et al. (1995) Design and biological activities of L-163, 191 (MK-0677): a potent, orally active growth hormone secretagogue. PNAS USA, 92:7001-7005; Smith R.G., Van der Ploeg L.H. et al. (1997) Peptidomimetic regulation of growth hormone secretion. Endocr. Rev, 18:621-645). Сравнительно недавно была создана другая молекула (EP1572), представляющая собой пептидомиметик GHS с селективной и потенциальной активностью высвобождения GH, демонстрирующая потенциал связывания рецептора стимулятора секреции GH (GHS-R) в тканях человека и животного, подобная таким, как грелин и пептидная молекула GHS, индуцирующие значительное увеличение GH после подкожного введения новорожденным крысам (Broglio F., Boutignon F. et al. (2002) EP1572: a novel peptido-mimetic GH secretagogue with potent and selective GH-releasing activity in man. J Endocrinol Invest, 25:RC26-RC28).

В 1999 году грелин был открыт в виде пептида из 28 аминокислот, который продуцируется главным образом в желудке, однако его мРНК также обнаруживается в некоторых других тканях. Он продуцируется в желудке с помощью клеток Х/А, которые являются основной популяцией эндокринных клеток в кислотопродуцирующей слизистой оболочке. Грелин также обнаруживается в дугообразном ядре гипоталамуса, где РНК присутствует в NPY и AGRP нейронах, вовлеченных в контроль аппетита и энергетического баланса (Kojima M., Hosoda H. et al. (1999) Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature, 402:656-60; Nakazato M., Murakami N. et al. (2001) A role for ghrelin in the central regulation of feeding. Nature, 409:194-198). Его РНК также локализуется в поджелудочной железе и кишечнике. Он циркулирует в кровотоке взрослых людей в концентрации 100-120 fmol/ml, что предполагает, что он секретируется клетками желудка и может действовать по эндокринному пути. Также было опубликовано о продуцировании грелина в неопластических тканях (Takaya K., Ariyasu H. et al. (2000) Ghrelin strongly stimulates growth hormone release in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab, 85:4908-11; Papotti M. et al. (2001) Substantial production of ghrelin by a human medullary thyroid carcinoma cell line. J Clin Endoc. Metab, 86:4984-4990).

Другие исследования на животных продемонстрировали, что секреция грелина является пульсирующей и более ассоциирована с потребностью организма в GH-стимулах (Tolle V., Bassant M.H. et al. (2002) Ultradian rhythmicity of ghrelin secretion in relation with GH, feeding behaviour, and sleep wake patterns in rats. Endocrinology, 143:1353-1361).

Грелин представляет собой первый природный гормон, обнаруженный с гидроксильной группой одного из серинов, ацилированной с помощью октановой кислоты. Эта модификация была описана, как существенная для связывания с GHS-R1a, а также для способности высвобождения GH, и возможно для других эндокринных процессов.

Не ацилированный грелин циркулирует в больших количествах, чем ацилированный, хотя не было описано прямого эндокринного процесса, он рассматривается как задействованный в других не эндокринных функциях, подобных кардиососудистым эффектам, кардиопротективным, антипролиферативным и цитопротективным эффектам в целом, возможно опосредованным путем связывания с другими субтипами молекул GHS-R (Matsumoto M., Hosoda H. et al. (2001) Structure-activity relationship of ghrelin: pharmacological study of ghrelin peptides. Biochem Biophys Res Commun, 287:142-146; Hosoda H., Kojima M. et al. (2000) Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun, 279:909-913; Cassoni P., Papotti M. et al. (2001) Identification, characterization, and biological activity of specific receptors for natural (ghrelin) and synthetic growth hormone secretagogues and analogs in human breast carcinomas and cell lines. J Clin Endocrinol Metab, 86:1738-1745).

Существует другой эндогенный лиганд для молекулы GHS-R1a, который может быть выделен из эндокринной слизистой оболочки желудка, дес-Gln14-грелин, полученный в результате альтернативного процессинга гена грелина с потерей Gln14, и также как с грелином, был проведен эксперимент такого же процесса ацилирования остатка Ser3.

Исследования, проведенные с некоторыми аналогами грелина, обладающими третьим остатком, модифицированным с помощью некоторых алифатических или ароматических групп, и с некоторыми короткими пептидами, выделенными из боковой цепи грелина, продемонстрировали, что гидрофобные группы в остатке 3 являются существенными для активности. Также наблюдалось, что короткие сегменты, содержащие первые пять остатков грелина, способны к активации рецептора с эффективностью, сравнимой с эффективностью цельного пептида. Было продемонстрировано, что тетрапептиды обладают меньшим потенциалом, и фрагменты, лишенные N-концевой части, были не способны к активации рецептора (Bednarek M.A., Feighner S.D. et al. (2000) Structure-Function Studies on the New Growth Hormone-Releasing Peptide, Ghrelin: Minimal Sequence of Ghrelin Necessary for Activation of Growth Hormone Secretagogue Receptor 1a. J Med Chem, 43: 4370-4376; Silva Elipe M.V., Bednarek M.A. et al. (2001) 1H NMR structural analysis of human ghrelin and its six truncated analogs. Biopolymers, 59:489-501). Такие исследования предполагают, что полная последовательность грелина не является существенной для активности, и Gly-Ser-Ser(н-октаноил)-Phe представляет собой активный фрагмент при проявлении его активности как агониста молекулы GHS-R1a.

До и после открытия грелина были приложены большие усилия для обнаружения малых молекул и производных, которые могут выступать в роли лигандов для GHS-R. Большое количество патентов описывает молекулы такого типа (US Патенты 3239345; 4036979; 4411890; 5492916, 5494919; 5559128; 5663171; 5721250; 5721251; 5723616; 5726319; 5767124; 5798337; 5830433; 5919777; 6034216; 6548501; 6559150; 6576686; 6686359; Международные Патенты: WO 6548501; 6559150; 6576686; 6686359; Intl Pats: WO (89/07110; 89/07111; 92/07578; 93/04081; 94/11012; 94/13696; 94/19367; 95/11029; 95/13069; 95/14666; 95/17422; 95/17423; 95/34311; 96/02530; 96/15148; 96/22996; 96/22997; 96/24580; 96/24587; 96/32943; 96/33189; 96/35713; 96/38471; 97/00894; 97/06803; 97/07117; 97/09060; 97/11697; 97/15191; 97/15573; 97/21730; 97/22004; 97/22367; 97/22620; 97/23508; 97/24369; 97/34604; 97/36873; 97/38709; 97/40023; 97/40071; 97/41878; 97/41879; 97/43278; 97/44042; 97/46252; 98/03473; 98/10653; 98/18815; 98/22124; 98/46569; 98/51687; 98/58947; 98/58948; 98/58949; 98/58950; 99/08697; 99/09991; 99/36431; 99/39730; 99/45029; 99/58501; 99/64456; 99/65486, 99/65488; 00/01726; 00/10975; 01/47558; 01/92292; 01/96300; 01/97831) (Carpino, P. (2002) Recent developments in ghrelin receptor (GHS-. R1a) agonists and antagonists Exp. Opin. Then Patents 12:1599-1618). После такой всесторонней проверки были описаны другие соединения как антагонисты GHS-R (US 2005/288316 и WO 2005/048916), и были описаны другие соединения, которые связывались с GHS-R и использовались для разнообразных целей (WO 2005/046682; WO 2005/039625; JP 2003/335752; US 2004/009984; US 2003/130284; WO 03/004518). Сравнительно недавно были добавлены к существующему ряду соединений новые типы макроциклических соединений с главной целью - выступать в роли агонистов GHS-R, не вызывая высвобождения GH (US 2006/025566).

GHS-R представляет собой белок класса А сопряженного с G-белком рецептора, экспрессирующийся от одного гена в хромосомном локусе 3q26.2 человека. Были идентифицированы два типа кДНК как результат альтернативного процессинга пре-мРНК (McKee K.K., Tan C.P. et al. (1997) Cloning and characterization of two human G protein-coupled receptor genesi (GPR38 and GPR39) related to the growth hormone secretagogue and neurotensin receptors. Genomics, 46:426-434; McKee K.K., Palyha O.C. et al. (1997) Molecular analysis of rat pituitary and hypothalamic growth hormone secretagogue receptors. Mol Endocrinol, 11:415-423; US 6242199; WO 97/21730). кДНК 1а кодирует рецептор из 366 аминокислот, содержащий семь трансмембранных сегментов (GHS-R1a). кДНК1b кодирует укороченный белок (GHS-R1b), содержащий 289 аминокислот и пять трансмембранных сегментов. Хотя роль GHS-R1b еще не известна, была установлена его экспрессия в некоторых эндокринных и не эндокринных тканях (Howard A.D., Feighner S.D. et al. (1996) A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormone release. Science, 273:974-977; Gnanapavan S., Kola B. et al. (2002) The tissue distribution of the mRNA of ghrelin and subtypes of its receptor, GHS-R, in humans. J Clin Endocrinol Metab. 87:2988; Smith R.G., Leonard R. et al. (2001) Growth hormone secretagogue receptor family members and ligands. Endocrine, 14:9-14).

Человеческий белок GHS-R1a имеет 96% и 93% идентичности с соответствующими белками крысы и свиньи, и было показано близкое родство между последовательностями GHS-R1a человека и рыбы telosteous. Такие открытия позволяют предположить, что белок GHS-R1a обладает высокой межвидовой консервативностью, и, возможно, несет существенную биологическую функцию. (Palyha O.C., Feighner S.D. et al. (2000) Ligand activation domain of human orphan growth hormone (GH) secretagogue receptor (GHS-R) conserved from pufferfish to humans. Mol Endocrinol. 14:160-169).

Связывание грелина и синтетической молекулы GHS с GHS-R1a активирует сигнальный путь фосфолипазы С с увеличением концентрации инозитол-1,4,5 трифосфата (IP3) и активацией протеин киназы С (PKS), с последующим высвобождением Ca²⁺ из внутриклеточных компартментов. Активация белка GHS-R также ингибирует каналы К⁺, дающие возможность поглощения Ca²⁺ через потенциалозависимые каналы L-типа, но не Т-типа. В отличие от GHS-R1a белок GHS-R1b не связывается или реагирует на GHS, и его функция еще не известна (Chen C, Wu D. et al. (1996) Signal transduction systems employed by synthetic GH-releasing peptides in somatotrophs. J Endocrinol. 148:381-386; Casanueva F.F., Dieguez C. (1999) Neuroendocrine regulation and actions of leptin. Front Neuroendocrinol, 20:317-363; Howard A.D., Feighner S.D. et al. (1996) A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormone release. Science, 273:974-977).

Синтетическая молекула GHS, грелин и его природная изоформа (дес-Gln14-грелин) связывается с высокой степенью аффинности с GHS-R1a, и эффективность замещения мембранно-связанных меченных белков [³⁵S] MK-0677 или [¹²⁵I][Tyr⁴]грелина коррелирует с концентрацией, требующейся для стимуляции высвобождения GH (Muccioli G., Papotti M. et al. (2001) Binding of 1251-labeled ghrelin to membranes from human hypothalamus and pituitary gland. J Endocrinol Invest. 24:RC7-RC9; Hosoda H., Kojima M. et al. (2000) Purification and characterization of rat des-Gln14-ghrelin, a second endogenous ligand for the growth hormone secretagogue receptor. J Biol Chem, 275:21995-22000).

Для определения существенных структурных характеристик грелина, необходимых для связывания и активации GHS-R1a, исследовали короткие пептиды грелина в клетках HEK-293, экспрессирующих человеческий белок GHS-R1a, наблюдая, что N-концевые пептиды грелина из 4 и 5 аминокислот были способны к активации рецептора. На основе этих полученных in vitro результатов установили, что пептид Gly-Ser-Ser(n-октаноил)-Phe по существу требуется для активации рецептора (Van der Lely A.J., Tschop M. et al. (2004) Biological, Physiological, Pathophysiological, and Pharmacological Aspects of Ghrelin. Endocrine Reviews, 25(3):426-457). Первые 7 аминокислот грелина являются консервативными среди всех исследованных видов, однако способность грелиновых производных активировать GHS-R1a в трансфецированных клетках, как оказалось, не указывает на способность стимулировать высвобождение GH в соматотропных клетках, недавно было продемонстрировано, что (1-4) и (1-8) октаноил грелин не способны стимулировать высвобождение GH у крыс и не эффективны при замещении меченного [¹²⁵I][Tyr⁴]грелина из сайта связывания в препаратах мембран клеток слизистой оболочки или гипоталамуса человека (Torsello A., Ghe C et. al. (2002) Short ghrelin peptides neither displace ghrelin binding in vitro nor stimulate GH release in vivo. Endocrinology, 143:1968-1971). Другое исследование, проведенное на тех же клетках, экспрессирующих GHS-R1a человека или свиньи, обнаружило, что аденозин также активирует рецептор, но подобно коротким грелиновым аналогам не может стимулировать секрецию GH, предполагается, что аденозин представляет собой частичный агонист GHS-R1a, связанный с другим сайтом рецептора, отличным от сайта MK-0677 и GHRP-6 (Smith R.G., Griffin P.R. et. al. (2000) Adenosine: a partial agonist of the growth hormone secretagogue receptor. Biochem Biophys Res Commun, 276:1306-1313). Сравнительно недавно было опубликовано, что GHS-R1a также может связываться с користатином (CST), при этом нейропептид, гомологичный соматостатину, (SS), не способен сам по себе распознавать GHS-R1a (Deghenghi R., Papotti M. et. al. (2001) Cortistatin, but not somatostatin, binds to growth hormone secretagogue (GHS) receptors of human pituitary gland. J Endocrinol Invest, 24:RC1-RC3). GHS-R1a экспрессируется в дугообразном ядре и в соматотропных клетках слизистой оболочки, которые являются критическими зонами для активностей грелина и синтетической молекулы GHS, связанных с нейроэндокринной стимуляцией и со стимуляцией аппетита (Willesen M.G., Kristensen P., Romer J. (1999) Co-localization of growth hormone secretagogue receptor and NPY mRNA in the arcuate nucleus of the rat. Neuroendocrinology, 70:306-316; Bluet-Pajot M.T., Tolle V. et. al. (2001) Growth hormone secretagogues and hypothalamic networks. Endocrine, 14:1-8; Shintani M., Ogawa Y. et. al. (2001) Ghrelin, an endogenous growth hormone secretagogue, is a novel orexigenic peptide that antagonizes leptin action through the activation of hypothalamic neuropeptide Y/Y1 receptor pathway. Diabetes, 50:227-232). Грелин и синтетическая молекула GHS стимулируют экспрессию маркеров активности нейронов (c-fos и EGR-1) в нейронах дугообразного ядра. мРНК молекулы GHS-R1a детектировали во внешних областях гипоталамуса, подобных зубчатому изгибу и областям СА2 и СА3 гипоталамуса, в компактной части черного вещества и в вентральной тегментальной области, в дорсальных и срединных ядрах Raphe, в ядре Edinger-Westphal, в соединительной ткани (bridge) и в продолговатом мозге, что указывает возможные роли вне гипоталамуса. мРНК также была обнаружена в некоторых периферических органах, таких как желудок, кишечник, поджелудочная железа, почки, сердце, аорта, в некоторых аденомах человека и в некоторых неопластических образованиях легкого, желудка и поджелудочной железы человека (Hewson A.K., Dickson S.L. (2000) Systemic administration of ghrelin induces Fos and Egr-1 proteins in the hypothalamic arcuate nucleus of fasted and fed rats. J Neuroendochnol, 12:1047-1049; Muccioli G., Ghe et. al. (1998) Specific receptors for synthetic GH secretagogues in the human brain and pituitary gland. J Endocrinol, 157:99-106; Guan X.M., Yu H. et. al. (1997) Distribution of mRNA encoding the growth hormone secretagogue receptor in brain and peripheral tissues. Brain Res Mol Brain Res, 48:23-29;; Mori K., Yoshimoto et. al. (2000) Kidney produces a novel acylated peptide, ghrelin. FEBS Lett, 486:213-216; Nagaya N., Miyatake K. et. al. (2001) Hemodynamic, renal, and hormonal effects of ghrelin infusion in patients with chronic heart failure. J Clin Endocrinol Metab, 86:5854-5859; Korbonits M., Bustin S.A. et. al. (2001) The expression of the growth hormone secretagogue receptor ligand ghrelin in normal and abnormal human pituitary and other neuroendocrine tumours. J Clin Endocrinol Metab, 86:881-887; Papotti M., Cassoni P. et. al. (2001) Ghrelin-producing endocrine tumors of the stomach and intestine. J Clin Endocrinol Metab, 86:5052-5059).

Грелин и GHS обладают высокой аффинностью связывания с GHS-R1a. Однако существуют очевидные данные о других дополнительных сайтах для GHS. Специфичные сайты для Tyr-Ala-гексарелина и других GHS с подобной плотностью рецептора, по меньшей мере, равной плотности, обнаруженной в слизистой оболочке, были обнаружены в клетках сердца человека и крысы и во многих других не эндокринных периферических тканях, подобных легким, артериям, скелетным мышцам, почкам и печени (Muccioli G., Ghe C et. al. (1998) Specific receptors for synthetic GH secretagogues in the human brain and pituitary gland. J Endocrinol, 157:99-106; Muccioli G., Broglio F. et. al. (2000) Growth hormone-releasing peptides and the cardiovascular system. Ann Endocrinol (Pahs), 61:27-31; Bodart V., Bouchard J.F. et. al. (1999) Identification and characterization of a new growth hormone-releasing peptide receptor in the heart. Circ Res, 85:796-802; Katugampola S., Davenport A. (2003) Emerging roles for orphan G protein-coupled receptors in the cardiovascular system. Trends Pharmacol Sci, 24:30-35; Ghigo E., Arvat E. et. al. (2001) Biologic activities of growth hormone secretagogues in humans. Endocrine, 14:87-93; Papotti M., Ghe C, Cassoni P. et. al. (2000) Growth hormone secretagogue binding sites in peripheral human tissues. J Clin Endocrinol Metab, 85:3803-3807). Такие сайты связывания продемонстрировали низкую степень аффинности связывания с грелином, и, возможно, они не принадлежат грелиновым рецепторам, но принадлежат рецепторам пептидов, аналогичных грелину. Белок GHS-R, локализованный в ткани сердца, имеет больший молекулярный вес (84 кДа), чем GHS-R1а, и их последовательности не имеют гомологии, предсказанная аминокислотная последовательность для белка рецептора, локализованного в ткани сердца, является подобной последовательности CD36 (Papotti M., Ghe C. et. al. (2000) Growth hormone secretagogue binding sites in peripheral human tissues. J Clin Endocrinol Metab, 85:3803-3807; Bodart V., Febbraio M. et. al. (2002) CD36 mediates the cardiovascular action of growth hormone-releasing peptides in the heart. Circ R&s, 90:844-849). Функциональное значение рецепторов GHS периферических тканей и их обнаружение в кардиоваскулярной системе предполагает, что такие сайты связывания модулируют кардиопротективные активности пептидных молекул GHS.

Грелин и другие синтетические стимуляторы секреции стимулируют высвобождение GH соматотропными клетками in vitro, возможно, путем деполяризации мембраны и путем увеличения секретируемого GH на клетку, опубликовано также о стимулирующем эффекте GHS на синтез GH. (Kojima M., Hosoda H. et. al. (1999) Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature, 402:656-660; Sartor O., Bowers C.Y., Chang D. (1985) Parallel studies of His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 and human pancreatic growth hormone releasing factor-44-NH2 in rat primary pituitary cell monolayer culture. Endocrinology, 116:952-957; Bowers C.Y., Sartor A.O. et. al. (1991) On the actions of the growth hormone-releasing hexapeptide, GHRP. Endocrinology, 128:2027-2035; Wu D., Chen C, et al. (1994) The effect of GH-releasing peptide-2 (GHRP-2 or KP 102) on GH secretion from primary cultured ovine pituitary cells can be abolished by a specific GH-releasing factor (GRF) receptor antagonist. J Endocrinol, 140:R9-R13;).

Ранние исследования продемонстрировали, что GHS стимулировал секрецию GH с использованием другого рецептора и сигнального пути GHRH: Антагонист GHRH рецептора ингибирует вызванную белком GHRH секрецию GH, но высвобождение GHRH, стимулированное стимуляторами секреции и предполагаемыми антагонистами GHS-R, не влияет на высвобождение GH в ответ на GHRH, белок GHRP-6 не конкурирует с GHRH за связывание с сайтами GHRH, как обнаружено с помощью анализа связывания рецептора, существует дополнительный эффект на высвобождение GH при совместном введении GHS и GHRH, и не существует кросс-десенсибилизации между GHRH и GHS в отношении высвобождения GH (Wu D., Chen C. et al. (1994) The effect of GH-releasing peptide-2 (GHRP-2 or KP102) on GH secretion from primary cultured ovine pituitary cells can be abolished by a specific GH-releasing factor (GRF) receptor antagonist. J Endocrinol, 140:R9-13; Thorner M.O., Hartman M.L. et al. (1994) Current status of therapy with growth hormone-releasing neuropeptides. Savage MO, Bourguignon J, Grossman AB (eds). Frontiers in Paediatric Neuroendocrinology, 161-167).

Активность молекулы GHS - высвобождения GH сильнее в препаратах клеток слизистой оболочки-гипоталамуса, чем в выделенной слизистой оболочке, что согласуется с очевидностью факта более сильных эффектов in vivo стимуляции GH. (Mazza E., Ghigo E. et. al. (1989) Effect of the potentiation of cholinergic activity on the variability in individual GH response to GH-releasing hormone. J Endocrinol Invest, 12:795-798; Bowers C.Y., Sartor A.O. et. al. (1991) On the actions of the growth hormone-releasing hexapeptide, GHRP. Endocrinology, 128:2027-2035; Clark R.G., Carlsson M.S. et. al. (1989) The effects of a growth hormone-releasing peptide and growth hormone releasing factor in conscious and anaesthetized rats. J Neuroendocrinol, 1:249-255).

На уровне гипоталамуса грелин и GHS действуют на GHRH-секреторных нейронах, и повышенный уровень GHRH наблюдался в циркуляции слизистой оболочки воротной вены после введения GHS овце (Conley L.K., Teik J.A. et. al. (1995)" Mechanism of action of hexarelin and GHRP-6: analysis of the involvement of GHRH and somatostatin in the rat. Neuroendocrinology, 61:44-50; Guillaume V., Magnan E. et. al. (1994) Growth hormone (GH)-releasing hormone secretion is stimulated by a new GH-releasing hexapeptide in sheep. Endocrinology, 135:1073-1076).

Для GHS требуется GHRH для полного выражения его эффекта высвобождения GH, у человека ответ на GH ингибируется антагонистами рецептора GHRH и с помощью разрыва связи слизистой оболочки-гипоталамуса. (Bluet-Pajot M.T., Tolle V. et al. (2001) Growth hormone secretagogues and hypothalamic networks. Endocrine, 14:1-8; 148:371-380; Popovic V., Miljic D. et al. (2003) Ghrelin main action on the regulation of growth hormone release is exerted at hypothalamic level. J Clin Endocrinol Metab, 88:3450-3453). Пациенты с дефицитом GHRH рецептора не демонстрируют увеличения секреции GH в виде ответа на GHS-стимуляцию, но сохраняют способность увеличения уровня кортизола, ACTH и PRL после GHS-стимуляции (Maheshwari H.G., Pezzoli S.S. et al. (2002) Pulsatile growth hormone secretion persists in genetic growth hormone-releasing hormone resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab, 282:E943-E951; Maheshwari H.G., Rahim A. et al. (1999) Selective lack of growth hormone (GH) response to the GH-releasing peptide hexarelin in patients with GH-releasing hormone receptor deficiency. J Clin Endocrinol Metab, 84:956-959; Gondo R.G., Aguiar-Oliveira M.H., Hayashida C.Y. et al. (2001) Growth hormone-releasing peptide-2 stimulates GH secretion in GH-deficient patients with mutated GH-releasing hormone receptor. J Clin Endocrinol Metab, 86:3279-3283). Для животных и людей доказана очевидность индуцируемой GHS и GHRH гомологичной, но не гетерологичной десенсибилизации, GHS-активность гомологичной десенсибилизации была продемонстрирована во время инфузии GHS, но не при периодическом ежедневном пероральном или назальном введении пептида в течение более, чем 15 дней (Ghigo E., Arvat E. et al. (1994) Growth hormone-releasing activity of hexarelin, a new synthetic hexapeptide, after intravenous, subcutaneous, intranasal, and oral administration in man. J Clin Endocrinol Metab, 78:693-698; Ghigo E., Arvat E. et al. (1996) Short-term administration of intranasal or oral hexarelin, a synthetic hexapeptide, does not desensitize the growth hormone responsiveness in human aging. Eur J Endocrinol, 135:407-412). С другой стороны, парентеральное, внутриназальное или пероральное введение GHS увеличивает спонтанное пульсирование GH и повышает уровень IGF-1 у взрослых субъектов молодого возраста, так же как у детей и субъектов пожилого возраста (Chapman I.M., Bach M.A. et al. (1996) Stimulation of the growth hormone (GH)-insulin-like growth factor I axis by; daily oral administration of a GH secretagogue (MK-677) in healthy elderly subjects; J Clin Endocrinol Metab, 81:4249-4257; Copinschi G., Van Onderbergen A. et al. (1996) Effects of a 7-day treatment with a novel, orally active, growth hormone (GH) secretagogue, MK-0677, on 24-hour GH profiles, insulin-like growth factor I, and adrenocortical function in normal young men. J Clin Endocrinol Metab, 81:2776-2782; Laron Z., Frenkel J. et al. (1995) Intranasal administration of the GHRP hexarelin accelerates growth in short children. Clin Endocrinol (Oxf), 43:631-635).

Грелин способен стимулировать аппетит у крыс, и это свойство может быть опосредовано синтезом NPY и AGRP. Внутрижелудочковый грелин также способен аннулировать анорексигенные эффекты лептина, и установлено, что существует конкурентное взаимодействие между этими двумя пептидами при влиянии на контроль гомеостаза аппетита и энергии. Циркулирующие концентрации грелина у крысы повышены натощак и понижены после кормления или приема глюкозы (Shintani M., Ogawa Y. et al. (2001) Ghrelin, an endogenous growth hormone secretagogue, is a novel orexigenic peptide that antagonizes leptin action through the activation of hypothalamic neuropeptide Y/Y1 receptor pathway. Diabetes, 50:227-32; Nakazato M., Murakami N. et al. (2001) A role for ghrelin in the central regulation of feeding. Nature, 409(6817): 194-198; Tschbp M., Smiley D.L., Heiman M.L. (2000) Ghrelin induces adiposity in rodents. Nature, 407:908-13).

GHS также стимулирует аппетит и набор веса. Периодическая обработка с помощью GHRP-2 стимулирует накопление жировой ткани у NPY-дефицитных мышей и увеличивает экспрессию в гипоталамусе мРНК AGRP у контрольных мышей (Torsello, A., Luoni, M. et al. (1998) Novel hexarelin analogs stimulate feeding in the rat through a mechanism not involving growth hormone release. Eur. J. Pharmacol, 360:123-129; Ghigo, E., Arvat, E. et al. (1999) Endocrine and non-endocrine activities of growth hormone secretagogues in humans. Horm. Res, 51:9-15; Tschop, M., Statnick, et al. (2002) GH-releasing peptide-2 increases fat mass in mice lacking NPY: indication for a crucial mediating role of hypothalamic agouti-related protein. Endocrinology, 143:558-568).

Результатом введения грелина крысам является прибавление веса и повышение аппетита при значительном увеличении жировой ткани без наблюдаемых изменений в безжировой массе, костной ткани или в стимуляции роста. Липогенный эффект грелина является независимым от действия GH, и он может быть обнаружен у генетически модифицированной GH-дефицитной крысы. GH вызывает увеличение потребления энергии и вызывает удаление жира, что дает возможность находиться в балансе с грелином, грелин увеличивает жировую ткань и GH не дает возможности уменьшать безжировую ткань (Nakazato M., Murakami N. et al. (2001) A role for ghrelin in the central regulation of feeding. Nature, 409(6817):194-198; Wren A.M., Small C.J. et al. (2000) The novel hypothalamic peptide ghrelin stimulates food intake and growth hormone secretion. Endocrinology, 141(11):4325-4328; Tschop M., Smiley D.L., Heiman M.L. (2000) Ghrelin induces adiposity in rodents. Nature, 407:980-913).

У страдающих от ожирения индивидуумов уровень грелина уменьшен и не уменьшается после приема пищи, такое состояние является обратимым, поскольку потеря веса и грелина обозначают, что уровень в плазме является повышенным. Уровень грелина в плазме негативно коррелирует с индексом веса тела, весом жира тела, уровнем ожирения и уровнем в плазме инсулина, глюкозы и лептина (English P.J., Ghatei M.A. et. al. (2002) Food fails to suppress ghrelin levels in obese humans. J Clin Endocrinol Metab, 87(6):2984; Tschop M., Weyer C. et. al. (2001) Circulating ghrelin levels are decreased in human obesity. Diabetes, 50(4):707-9).

Было опубликовано, что недостаточность GH у пациентов, страдающих ожирением, становится обратимой после продолжительной диеты и заметной потери веса. Хроническое увеличение свободных жирных кислот и гиперинсулинизм, ассоциированные с низким уровнем грелинамогут играть важную роль, которая связана с причиной недостаточности GH при ожирении (Maccario M., Tassone F., Grottoli S., Rossetto R., Gauna C, Ghigo E. (2002) Neuroendocrine and metabolic determinants of the adaptation of GH/IGF-I axis to obesity. Ann Endocrinol (Paris), 63(2 Pt 1): 140-144). Поскольку было обнаружено, что грелин является адипогенным и вызывающим аппетит, можно рассмотреть роль его антагонистов при лечении ожирения, однако последствия такого антагонизма представляют собой понижение секреции GH и ассоциированы с увеличением массы жира (Jorgensen J.O., Vahl N., (1996) Influence of growth hormone and androgens on body composition in adults. Horm Res, 45:94-98). При продолжительном времени введения агонистов или антагонистов грелина обнаружится, какой из двух эффектов является доминирующим и определится его влияние на энергетический баланс.

У человека, страдающего ожирением, циркулирующая концентрация грелина понижена и негативно коррелирует с жировой тканью тела и циркулирующим уровнем инсулина и лептина (Taschöp M., Weyer C. et al. (2001) Circulating ghrelin levels are decreased in human obesity. Diabetes, 50:707-9).

Ось GH/IGF-1 играет очень важную роль во время кардио-развития и для поддержания структуры и функции сердца; повреждение сердечно-сосудистого действия является одним из симптомов дефицита GH, который может быть ликвидирован с помощью GH-терапии (Sacca L, Cittadini A, Fazio S (1994) Growth hormone and the heart. Endocr Rev 15:555-573; Caidahl K. Eden S. Bengtsson BA 1994 Cardiovascular and renal effects of growth hormone. Clin Endocrinol (Oxf) 40:393-400).

Существуют экспериментальные данные, демонстрирующие улучшение действия сердечной мышцы благодаря GH, среди них много исследований, использующих модель инфаркта миокарда (MI) у крыс, обработка которых после MI с помощью GH приводила в результате к повышению объема систолического выброса, кардиоспособности и другим систолическим изменениям вместе с продолжительной вазодилатацией и понижению общего периферического сопротивления благодаря действию GH/IGF-1, что, возможно, вносит вклад в улучшение сокращаемости миакарда (Timsit J. Riou B. et al. 1990 Effects of chronic growth hormone hypersecretion on intrinsic contractility, energetics, isomyosin pattern and myosin adenosine triphosphate activity of rat left ventricle. J Clin Invest 86:507-515; Tajima M. et al. (1999) Treatment with growth hormone enhances contractile reserve and intracellular calcium transients in myocytes from rats with post infarction heart failure. Circulation 99:127-134).

С другой стороны, модели животных с избытком GH проявляют замену на изоформу миозина с низкой активностью аденозин трифосфата, они могут понижать потребление энергии в процессе сокращения (Timsit J. Riou B. et al. (1990) Effects of chronic growth hormone hypersecretion on intrinsic contractility, energetics, isomyosin pattern and myosin adenosine triphosphate activity of rat left ventricle. J Clin Invest 86:507-515).

Существуют некоторые исследования кардио- и периферических эффектов GH и/или IGF-1, среди них положительные клинические данные, указывающие на будущую роль GH/IGF-1 в сердечно-сосудистой терапии (Fazio S., Sabatini D. et al. (1996) A preliminary study of growth hormone in the treatment of dilated cardiomyopathy. N Engl J Med, 334:809-814).

В некоторых in vivo исследованиях показано, что некоторые синтетические молекулы GHS и грелин обладают кардиопротективными свойствами, улучшая некоторые функциональные кардиоизменения, и имеют эффект, сравнимый с GH. Исходя из вероятности гемодинамики параметров гексарелина вместе с вероятностью гемодинамики параметров GH можно предположить, что воздействие GHS опосредована действием GH, однако недавние исследования поддерживают прямое воздействие на сердце (Locatelli V., Rossoni G., (1999) Growth Hormone independent cardioprotective effects of hexarelin in the rat. Endocrinology, 140:4024-4031; Tivesten A., Bollano E., (2000) The growth hormone secretagogue hexarelin improves cardiac function in rats after experimental myocardial infarction. Endocrinology, 141:60-66).

GHS-R1a мРНК была обнаружена в аорте и сердце, и ее присутствие также увеличивается в культуре кардиомиоцитов после их пре-инкубации с гексарелином (Gnanapavan S., Kola B. et al. (2002) The tissue distribution of the mRNA of ghrelin and subtypes of its receptor, GHS-R, in humans. J Clin Endocrinol Metab, 87: 2988-2991; Nagoya N., Kojima M. et al. (2001) Hemodynamic and hormonal effects of human ghrelin in healthy volunteers. Am J Physiol Regul Integr Comp Physio}, 280: R1483-R1487; Pang J.-J., Xu R.-K. et al. (2004) Hexarelin protects rat cardiomyocytes from angiotensin ll-induced apoptosis in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 286(3): H1063-1069).

Специфичные сайты связывания грелина были идентифицированы в сердце крысы и артериях человека, где плотность рецептора увеличивается при атеросклерозе, и радиоактивно-меченная пептидная молекула GHS была обнаружена специфически связанной с клетками миокарда крысы и некоторыми сердечно-сосудистыми тканями человека (желудочком, предсердием, аортой, коронарными тканями, сонной артерией, эндокардом и полой веной) в большем количестве, чем со слизистой оболочкой (Katugampola S.D. (2001) [125l-His(9)]-ghrelin, a novel radioligand for localising GHS orphan receptors in human and rat tissue: up-regulation of receptors with atherosclerosis. Br J Pharmacol, 134:143-149; Ong H., McNicoll N. et al. (1998) Identification of a pituitary growth hormone-releasing peptide (GHRP) receptor subtype by photo affinity labeling. Endocrinology, 139:432-435; Bodart V., McNicoll N. et al. (1999) Identification and characterization of a new GHRP receptor in the heart. Circ Res, 85:796-808; Papotti M., Ghe C. et al. (2000) Growth hormone secretagogue binding site in periferical human tissues. J Clin Endocrinol Metab, 85: 3803-3807).

Хотя введение больших фармакологических доз пептидной молекулы GHS индуцирует абсолютное, но временное сужение сосудов в перфундированном сердце крысы с использованием молодых крыс с индуцированным дефицитом GH путем иммунизации с помощью GHRH, также было обнаружено, что гексарелин может защитить против нарушения миокарда, индуцированного при ишемии и реперфузии, такие защитные активности ассоциированы с высвобождением простациклина и достижением вазапрессорной активности Ангиотензина II (Bodart V., Febbario M. et al. (2000) CD36 mediates the cardiovascular action of growth hormone-releasing peptides in the heart. Circ Res, 90:844-849; de Gennaro Colonna V., Rossoni G. et al. (1997) Hexarelin, a growth hormone-releasing peptide, discloses protectant activity against cardiovascular damage in rats with isolated growth hormone deficiency. Cardiologia, 42:1165-1172; de Gennaro Colonna V. et al. (1997) Cardiac ischemia and impairment of vascular endothelium function in hearts from growth hormone-deficient rats: protection by hexarelin. Eur J Pharmacol, 334:201-207).

Подобные результаты получены со старыми крысами, где обработка с помощью гексарелина приводила в результате к серьезной защите против пост-ишемической желудочковой дисфункции. Полное восстановление кардиофункции наблюдалось при реперфузии, и одновременное уменьшение уровня креатинкиназы подтверждало целостность мембран сердца, и предохранение от слабости сокращений, следующих за повторным доступом кислорода. Протективный эффект гексарелина также был продемонстрирован путем продуцирования 6-кето-PGF1a и путем восстановления коронарной васкулярной реактивности по отношению к Ангиотензину II (Rossoni G., de Gennaro Colonna V. et al. (1998) Protectant activity of hexarelin or growth hormone against post ischemic ventricular dysfunction in hearts from aged rats. J Cardiovasc Pharmacol, 32:260-265; Rossoni G., de Gennaro Colonna V. et al. (1998) Protectant activity of hexarelin or growth hormone against post ischemic ventricular dysfunction in hearts from aged rats. J Cardiovasc Pharmacol, 32:260-265; Locatelli V., Rossoni G. et al. (1999) Growth hormone-independent cardioprotective effects of hexarelin in the rat. Endocrinology, 140:4024-4031). Исследования на гипофизэктомированных крысах продемонстрировали кардиопротективный эффекты GHS, независимые от GH и опосредованные специфичными для миокарда рецепторами (Locatelli V., Rossoni G. et. al. (1999) Growth hormone-independent cardioprotective effects of hexarelin in the rat. Endocrinology, 140:4024-4031; Bodart V., McNicoll N. et al. (1999) Identification and characterization of a new GHRP receptor in the heart. Circ Res, 85:796-808).

Гексарелин повышает объем систолического выброса, кардиоспособность и уменьшает общее периферическое сопротивление после индукции инфаркта миокарда у крыс возрастом 4 недели, использованных в качестве модели. Хотя механизм инотропной активности синтетической молекулы GHS еще не ясен, существует очевидность увеличения сокращения папиллярной мышцы, при воздействии на эндотелиальные клетки или нервные окончания (Tivesten A., Bollano et al. (2000) The growth hormone secretagogue Hexarelin improve cardiac function in rats after experimental myocardial infarction. Endocrinology, 141:60-66; Bedendi I., Gallo M.P. et al. (2001) Role of endothelial cells in modulation of contractility induced by hexarelin in rat ventricle. Life Sci, 69:2189-2201)

Грелин не разделяет всех кардиоваскулярных воздействий синтетической молекулы GHS, грелин обеспечивает слабую защиту для сердца, предполагая, что эффекты синтетической молекулы GHS возникают благодаря связыванию и активации GHS-специфичных сайтов. Исследования с помощью меченного [¹²⁵I]Tyr-Ala-гексарелина обнаружили в миокарде крысы и в кардиоваскулярных тканях человека много сайтов связывания, отличных от сайтов GHSR-1a, что предполагает существование другого рецептора с последовательностью, подобной последовательности CD36, опосредующего коронарные воздействия синтетической молекулы GHS (Torsello A., Bresciani E. et al. (2003) Ghrelin plays a minor role in the physiological control of cardiac function in the rat. Endocrinology, 144:1787-1792; Muccioli G., Broglio F. et al. (2000) Growth hormone-releasing peptides and the cardiovascular system. Ann Endocrinol (Paris) 61:27-31; Bodart V., Febbraio M. et al. (2002) CD36 mediates the cardiovascular action of growth hormone-releasing^ peptides in the heart. Circ Res, 90:844-849). Хотя грелин является наименее активным на коронарном уровне, он представляет другие кардиоваскулярные эффекты. Грелин имеет большой потенциал in vivo и in vitro сосудорасширяющего эффекта, такое воздействие грелина направлено на мышцы, отличные от поперечно-полосатых, с потенциалом, сравнимым с потенциалом натрийуретических пептидов. У людей, представляющих собой пациентов с атеросклерозом, наблюдается повышенный уровень рецепторов грелина, предполагается, что он играет роль компенсации при повышенном сужении сосудов, наблюдаемом при таком состоянии (Okumura H., Nagaya N. et al. (2002) Vasodilatory effect of ghrelin, an endogenous peptide from the stomach. J Cardiovasc Pharmacol, 39:779-783; Wiley K.E., Davenport A.P. (2002) Comparison of vasodilators in human internal mammary artery: ghrelin is a potent physiological antagonist of endothelin-1. Br. J. Pharmacol, 136:1146-1152; Katugampola S.D. (2001) [125l-His(9)]-ghrelin, a novel radioligand for localising GHS orphan receptors in human and rat tissue: up-regulation of receptors with atherosclerosis. Br J Pharmacol, 134:143-149).

В других исследованиях продемонстрировано, что гексарелин, ацилированный грелин и даже грелин могут предотвращать индуцируемую доксорубицином клеточную смерть кардиомиоцитов H9c2 и эндотелиальных клеток, возможно стимулируя внутриклеточные сигналы, подобные активации ERK1/2 и PI 3-киназы АКТ (Baldanzi G., Filigheddu N. et. al. (2002) Ghrelin and des-acyl ghrelin inhibit cell death in cardiomyocytes and endothelial cells through ERK1/2 and PI 3-kinase/AKT. J Cell Biol, 159:1029-1037; Filigheddu N., Fubini A. et al. (2001) Hexarelin protects H9c2 cardiomyocytes from doxorubicin-induced cell death. Endocrine, 14:113-119).

Исследования in vivo на кардиомиоцитах и эндотелиальных клетках предполагает, что антиапоптозные эффекты GHS опосредованы ERK и AKT и путем ингибирования активации каспазы 3 и экспрессии BAX, увеличивающих экспрессию BCL-2 (Pang J.J., Xu R.K. et al. (2004) Hexarelin protects rat cardiomyocytes from angiotensin ll-induced apoptosis in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 286:H1063-H1069). Такие данные усиливают гипотезу существования другого субтипа GHS-R, так как неацилированный грелин не активирует GHS-R1a.

Грелин и GHS действительно обладают кардиоваскулярной активностью у людей, их введение здоровым добровольцам и пациентам с хронической сердечной недостаточностью уменьшает систематическое васкулярное сопротивление и увеличивает кардиоспособность и объем систолического выброса с уменьшением значения артериального давления, но без демонстрации каких-либо изменений сердечного ритма, давления на срединную пульмонарную артерию или капиллярное пульмонарное давление (Nagaya N., Kojima M. et al. (2001) Hemodynamic and hormonal effects of human ghrelin in healthy volunteers. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 280:R1483-R1487; Enomoto M., Nagaya N. et al. (2003) Cardiovascular and hormonal effects of subcutaneous administration of ghrelin, a novel growth hormone-releasing peptide, in healthy humans. Clin Sci (Lond), 105:431-435).

Также наблюдалось, что некоторые трофические факторы, включающие GH и IGF-1, обладают нейропротективными свойствами во время второй фазы in vivo гипоксийной ишемии (HI), и было показано, что активация пути PI3K с фосфорилированием АКТ представляет собой медиатор коэффициента выживаемости нейронов, индуцируемой in vitro с помощ