Способ in vitro-диагностики болезни альцгеймера с помощью моноклонального антитела

Способ in vitro-диагностики болезни альцгеймера с помощью моноклонального антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение связано с диагностикой неврологических заболеваний, в особенности с диагностикой болезни Альцгеймера с помощью антитела, которое способно взаимодействовать со специфическими пептидами, ассоциированными с указанным заболеванием.

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера (БА) - это неврологическое заболевание, которое вызывает гибель нейронов в мозге. Как правило, оно прогрессирует медленно, начинаясь после 50 лет, и его первые симптомы могут быть объяснены старческим возрастом или обычной забывчивостью. По мере того как заболевание прогрессирует, появляется постепенное ухудшение когнитивных способностей, включая способность принимать решения и выполнять повседневные задачи, и могут иметь место изменения личности, а также проблемы в поведении. На поздних стадиях БА приводит к деменции и в конце концов - к смерти. В настоящее время заболевание является неизлечимым и составляет основную причину смертности.

В настоящее время болезнь Альцгеймера обычно диагностируется по клинической картине, хотя окончательный диагноз может основываться только на гистологическом исследовании образцов мозга (аутопсии или биопсии), выявляющем присутствие характерных признаков в ткани мозга. Принимая во внимание риск, связанный с биопсией мозга у живых пациентов, эта процедура применяется очень редко, и, соответственно, считается, что частота появления ошибок при диагностике данного заболевания in vivo составляет около 20-30%.

В мозге индивидуумов с болезнью Альцгеймера выявляется два принципиальных патологических маркера: нейрофибриллярная дегенерация (которая идентифицируется по присутствию нейрофибриллярных клубков, дистрофических нейритов и нитей нейропилей) и отложения амилоидного вещества (то есть отложения так называемого β-амилоидного пептида, обычно сокращаемого до Аβ), причем и тот, и другой представлены в виде бляшек (диффузные бляшки и нейритные бляшки, эти последние приведенные формы являются характерными чертами заболевания и определяются, как только они появляются между нейронами и внутри них) и в виде отложений в сосудах (встречаются в стенках кровеносных сосудов головного мозга). И нейрофибриллярная дегенерация, и амилоидные отложения представляют собой дегенеративные процессы, которые связаны также и с нормальным старением мозга. У пожилых людей, которые не страдают деменцией, пептид Аβ откладывается преимущественно в виде диффузных бляшек. Этот тип отложения чрезвычайно выражен у некоторых субъектов с нормальными когнитивными способностями и, согласно некоторым авторам, связан с процессом «патологического старения», который рассматривается как промежуточное состояние между нормальным процессом старения мозга и БА [1]. Особенно интенсивное раннее развитие диффузных бляшек за несколько лет до появления нейритных бляшек имеет место также и при синдроме Дауна (СД) вследствие трисомии 21 хромосомы, которая приводит к гиперэкспрессии белка амилоидного предшественника (β-АРР). Хотя небольшое количество нейритных бляшек может наблюдаться и в мозге субъектов с нормальными когнитивными способностями, мозг, пораженный БА, так же как и при поражении СД, в старшем возрасте отличается развитием большого количества зрелых нейритных бляшек [2, 3]. В отличие от диффузных бляшек, которые содержат нефибриллярную форму Аβ (обозначенную как «преамилоид») [4], и сосудистые амилоидные отложения, и нейритные бляшки содержат пептид Аβ в фибриллярной форме и взаимодействуют с красителями для амилоидного вещества, такими как Конго Красный и Тиофлавин Т.

Когнитивное ухудшение при БА линейно коррелирует с прогрессией нейрофибриллярных изменений и утратой кортикальных синапсов [5]. Не было обнаружено локальной утраты синапсов, связанной с диффузными бляшками [6]. В противовес этому, нейритные бляшки ассоциированы с потерей синаптической плотности, нейрофибриллярными изменениями и активацией микроглии [7]. И чистые нейрофибриллярные изменения, и отложение Аβ следуют за четко устанавливаемыми последовательными чертами прогрессии БА [8, 9]. Однако хотя степень когнитивного угасания лучше коррелирует с последовательностью стадий, определяющихся нейрофибриллярными изменениями [5], тем не менее окончательный нейропатологический диагноз при БА основан на гистологической демонстрации значительно более высокой плотности нейритных бляшек в ассоциативных неокортикальных областях по сравнению с таковой, ожидаемой в соответствии с возрастной группой пациента, в пределах клинической картины деменции (критерии согласования CERAD: Консорциума по Учреждению Регистрации Болезни Альцгеймера) [10]. Формирование нейритных бляшек составляет основной патогенный процесс при БА, и молекулярный состав этих отложений β-амилоида, и отличия от диффузных бляшек в отношении указанного состава являются соответственно одной из основных областей интереса в современных исследованиях БА.

Знания о молекулярном составе отложений β-амилоида в ткани мозга пациентов с болезнью Альцгеймера радикально изменились в течение последних лет. Различные исследования с применением биохимических и иммуногистохимических методов с целью выявления различных форм пептида Аβ обеспечили довольно последовательную картину, которая дает возможность молекулярной интерпретации классических морфологических данных. Это были те исследования, которые обеспечили основу для унифицированной патогенной теории заболевания, именуемой амилоидной гипотезой [11], хотя в последнее время исходная гипотеза была переформулирована, с тем, чтобы учесть новую роль растворимых олигомеров Аβ в качестве основных агентов, вызывающих заболевание [12]. Принятие центральной и первичной патогенной роли пептидов Аβ при БА в настоящее время приводит к новым стратегиям лечения, направленным на предупреждение возникновения этих отложений или их удаление.

Топографическое распространение и временная последовательность отложения пептидов Аβ, характерных для мозга, пораженного БА, было выявлено с помощью антител, ориентированных на карбоксильный конец, N-конец или на внутренние части молекулы Аβ, наряду с выделением и очисткой изоформ Аβ биохимическими методами. Распределение пептидов, охарактеризованных по особенностям их карбоксильных концов, в ткани демонстрирует довольно правильную, четкую картину. Тогда как Аβ_х-40 является преобладающей формой в сосудистых отложениях и основной формой, встречающейся в CSF (спинномозговая жидкость), Аβ_х-42 является основной формой, обнаруживаемой в отложениях в ткани мозга (диффузные бляшки и нейритные бляшки) [13]. При БА, синдроме Дауна (СД) [13, 14] и нормальном старении [1] Аβ_х-42 является единственным компонентом диффузных бляшек и основным компонентом нейритных бляшек. Последние также могут содержать Аβ_х-40, преимущественно в районе их основного ядра. Также было установлено, что Аβ_х-42 является формой, которая откладывается на начальных стадиях.

Хотя изначально считалось, что Аβ_х-40 и Аβ_х-42 почти всегда начинаются с аминокислоты Asp1, иммуногистохимически и биохимически было четко показано, что большое количество гетерогенных изоформ пептида Аβ, модифицированных и укороченных на N-конце, входит в состав и диффузных, и нейритных бляшек [15]. Эти изоформы также проявляют тенденцию к регулярному распределению между диффузными и нейритными бляшками, так что полная картина топографического распространения различных пептидов Аβ, наконец, начинает проясняться. Тем не менее существуют некоторые несоответствия между стадиями, особенно в отношении свойств N-конца пептидов, которые образуют диффузные бляшки, и сравнительным количеством отложений амилоида, представляющего каждую из них.

Эти несоответствия касаются, в частности, пептида р3 (Aβ_17-42). Тогда как предполагается, что на некоторых стадиях Aβ_17-42 может быть главным компонентом диффузных бляшек [16], на остальных стадиях при этом обнаруживаются относительно большие количества более длинных форм (начинающихся с Asp1 или укороченных с N-конца или других модифицированных изоформ) [15]. Поскольку Aβ_17-42 образуется при расщеплении β-АРР α-секретазой (так называемый неамилоидогенный путь) и проявляет физико-химические свойства, совершенно отличные от свойств более длинных изоформ Аβ (последние образуются при расщеплении β-АРР γ-секретазой), его избирательное присутствие в диффузных бляшках может иметь критическое патогенное значение в развитии бляшек.

Gowing и др. [17] впервые выделили пептид Aβ_17-42 в качестве преобладающей формы, полученной из образцов мозга, пораженного БА, богатого диффузными бляшками. Это отложение не было обнаружено в сосудистых амилоидных отложениях или в нейритных бляшках. Коммерческие моноклональные антитела 6Е10, которые распознают Aβ_1-17, в сериях мозга, пораженного БА и СД, не дают иммуноокрашивания диффузных бляшек, ни неокортикальных, ни мозжечковых, [18]. Однако в полосатом теле, где в большом количестве присутствуют диффузные бляшки при отсутствии нейритных бляшек, обнаружилось некоторое количество бляшек, которые являются положительными в отношении антител 6Е10. Используя HPLC и иммуногистохимическое распознавание, Lalowski и др. [19] показали, что Aβ_17-42 составляет 70% от общего содержания амилоида в диффузных бляшках мозжечка, тогда как Aβ_1-42 составляет 12%, и другие укороченные формы Аβ_х-42 составляют 5% или менее. В мозге пожилых людей, больных СД, Saido и др. [20] обнаружили большее окрашивание диффузных бляшек специфическими антителами против Аβ N3 (pyroGlu), чем антителами против Aβ N(1). Iwatsubo и др. [15] исследовали диффузные бляшки в сериях мозга пожилых людей, больных БА и больных СД, с помощью групп антител, направленных на распознавание форм Аβ, укороченного и модифицированного с N-конца. Это исследование уникально тем, что ткань мозга, использованная для иммуногистохимического исследования, была фиксирована либо в 70% спирте, либо в 4% формальдегиде, с тем, чтобы иметь возможность проверить влияние обычной фиксации формальдегидом на появление артефактов. Во всех образцах ткани, фиксированных в 70% спирте, диффузные бляшки окрашивались интенсивнее при наличии Аβ N1 (L-Asp), Aβ N1 (L-isoAsp), Aβ N1 (D-Asp), Aβ N3 (pyroGlu) и Аβ Х-42. Слабое иммуноокрашивание получали с Аβ N11 (pyroGlu) и Аβ N17. Однако в материале, фиксированном в формальдегиде, некоторые диффузные бляшки окрашивались с Аβ N1 (L-Asp) и не окрашивались с Аβ N1 (L-isoAsp) или Аβ N1 (D-Asp), тогда как участок окрашивания на карбоксильном конце был неизмененным. Хотя авторы показали, что модификация N-конца может влиять на результат иммуноокрашивания в тканях, фиксированных в формальдегиде, они получили слабую реактивность для Аβ N17 даже в материале, фиксированном в спирте. Применяя моноклональное антитело, специфичное в отношении р3 (Aβ_17-42) [16], они обнаружили, что отложение этого пептида в значительной степени ограничивалось диффузными бляшками, дистрофическими нейритами и верхними частями нейритных бляшек в области миндалин, гиппокампа и парагиппокампа. Авторы высказали мнение о специфической роли р3 в начальном отложении амилоидной массы и возникновении нейритных бляшек. Tekirian и др. [21] показали в сериях мозга больных БА и контрольной группы присутствие Аβ N3 (пептид)>Аβ N1 (D)>Aβ N17 (L)>Aβ N1 (rD) в диффузных бляшках.

Что касается вариабельности карбокси-конца, в исследовании с использованием антител против Аβ_х-40, Аβ_х-42 или Aβ_x-43, Parvathy и др. [22] обнаружили подгруппу нейритных бляшек, которые реагируют только с антителами Аβ С40, и большую подгруппу бляшек, которые реагируют и с Аβ С40, и с Аβ С42.

Таким образом, в более ранних исследованиях установлено, что диффузные бляшки обнаруживают профиль Аβ, который является высокоспецифичным на карбоксильном конце, и профиль, который довольно специфичен на N-конце, последний зависит от некоторой гетерогенности между пациентами и между различными участками мозга. Присутствие Aβ_17-42 в значительной степени ограничивается диффузными бляшками, хотя существует большое различие между стадиями в отношении относительного содержания в них этого более короткого пептида. В исследованиях под руководством Kida и других [18] не было выявлено окрашивания для пептидов Аβ, которые содержат последовательность 12-16 в диффузных бляшках кортикального или субкортикального участков.

С учетом всех результатов, полученных в данной области, можно заключить, что, как было предложено Larner [23], формы пептида Аβ, которые являются специфичными в области своего N-конца, могут играть существенную роль в развитии диффузных бляшек, превращая их в нейритные бляшки. Следовательно, антитела, способные специфически детектировать формы с укороченным N-концом и, соответственно, четко дифференцировать диффузные бляшки и нейритные бляшки, являются чрезвычайно полезными в качестве инструментов в диагностике болезни Альцгеймера. К ним относятся антитела, способные дифференцировать подгруппы нейритных бляшек в соответствии с соотношением различных форм амилоидного пептида, различающихся по аминокислоте, которой заканчивается карбоксильный конец, и именно такие антитела будут особенно пригодными, особенно если их можно будет использовать для определения подгрупп бляшек, которые являются специфическим маркером заболевания. Моноклональное антитело согласно изобретению, направленное против последовательности, состоящей из аминокислот 12-16 β-амилоидного пептида и обладающее большей аффинностью в отношении формы Аβ42, чем формы Аβ40, удовлетворяет обеим характеристикам.

Другим аспектом, в соответствии с которым антитела, способные детектировать формы β-амилоидного пептида, были бы чрезвычайно пригодны в диагностике болезни Альцгеймера при помощи оценки концентрации различных форм этого пептида в биологических жидкостях, является аспект, который исследуется и для облегчения диагностики на основе биохимических параметров, и даже с целью распознавания доклинических случаев или случаев с особым риском развития заболевания, и для наблюдения пациентов, участвующих в клинических исследованиях. Для этого многие исследования сфокусированы на спинномозговой жидкости (CSF) с намерением выявить, есть ли изменения в концентрациях растворимых форм β-амилоидного пептида, присутствующего в этой жидкости, что дало бы возможность отличать больных от здоровой контрольной группы. Однако маловероятно, что исследование CSF, которое включает в себя применение инвазивной технологии, люмбарную пункцию, могло бы быть применимо для диагностики и стандартного наблюдения пациентов с болезнью Альцгеймера в клинической практике. Поэтому другие направления исследования сфокусированы на изучении различий в концентрации биологических маркеров в крови и моче (каковые включают в себя растворимые формы β-амилоидного пептида), которые могли бы коррелировать с появлением и развитием заболевания, хотя некоторые исследования и опубликованы к настоящему времени. Соответственно, обнаруживается, что уровни Аβ_х-42 и Аβ_х-40 в плазме возрастают при синдроме Дауна, и также они увеличиваются с возрастом у здоровых людей. Уровни в плазме Аβ_х-42, но не Аβ_х-40, повышаются у больных с болезнью Альцгеймера, и снижаются, если заболевание развивается [28, 29], хотя измерение концентрации этих веществ в плазме в настоящее время не может быть использовано для диагностики. Присутствие растворимых форм β-амилоидного пептида также детектировали в моче [30], хотя сравнительное исследование между больными и контрольной группой еще не доведено до конца. Хотя порядок величины концентраций β-амилоидного пептида, которые детектируются в плазме и моче, осложняет определение профилей, соответствующих здоровым индивидуумам и больным на разных стадиях заболевания, и возможная связь растворимых форм β-амилоидного пептида с другими белками, присутствующими в указанных биологических жидкостях, является еще одним препятствием, которое придется преодолеть, этот подход активно рассматривается, поскольку моноклональные антитела, которые могут взаимодействовать с формами β-амилоидного пептида, присутствующими в биологических жидкостях, дают возможность их детекции и могут представлять собой очень удобный способ диагностики болезни Альцгеймера. Антитело согласно изобретению, которое способно взаимодействовать с растворимыми формами β-амилоидного пептида и обнаруживать их присутствие в биологических жидкостях, таких как моча, является одним из антител, которые могут использоваться для реализации этих диагностических технологий. Кроме того, то обстоятельство, что оно специфически направлено против участка вблизи амино-конца β-амилоидного пептида, является свойством, представляющим интерес при разделении форм β-амилоидного пептида, в которых сохраняется амино-конец, и тех форм, в которых указанный конец укорочен.

Описаны другие моноклональные антитела, ориентированные специфически против участка вблизи N-конца β-амилоидного пептида, а также их применение в диагностических методах, связанных с БА. Например, в патенте США US-4666829 описано получение моноклонального антитела, выработанного против части амилоидного пептида, наиболее близкой к N-концу. Конкретно: был получен синтетический пептид, содержащий первые десять остатков указанного пептида (Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr), представленный в SEQ ID NO:1. Эпитоп, распознанный этим антителом, будет содержать эти аминокислоты 1-10, тогда как антитело, заявленное в настоящем изобретении, распознает по меньшей мере эпитоп, который содержит аминокислоты 12-16. Также существует различие в специфической последовательности, которую распознает это моноклональное антитело, в сравнении с таковым согласно настоящему изобретению; разработка предложенной диагностической технологии также отличается, поскольку то, что определяется, является исключительно связыванием антител, применяемых в отношении того, что рассматривается в указанном патенте, то есть пептида, который характерен для болезни Альцгеймера и образован 1-28 аминокислотами амилоидного пептида, без учета связывания с другими формами пептида различных длин и/или с вариациями в амино- и карбокси-концах. Более того, не было представлено экспериментального подтверждения, которое служило бы доказательством его возможности детектировать формы амилоидного пептида, присутствующего в биологических жидкостях.

Кроме того, в патентной заявке РСТ WO 90/12871 описано получение моноклонального антитела, обозначенного SV17-6E10. Это антитело получают посредством иммунизации пептидом с последовательностью Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Gln-Val-His-His-Gln-Lys-Leu, представленной в SEQ ID NO:2, которая могла считаться эквивалентной аминокислотной последовательности 1-17 аминокислот амилоидного пептида. Другое моноклональное антитело, направленное на участок, который содержит аминокислоты 1-17 - это указанное коммерческое моноклональное антитело 6Е10, которое, как указано в описании спецификации, соответствующей продукту, http://www.alexis_corp.com/monoclonal:antibodies-SIG-9320/opfa.1.1.SIG-9320.386.4.1.html, специфически, в пределах с 1 по 17 аминокислоты β-амилоидного пептида, распознает эпитоп, заключенный между аминокислотами 3-8. Этот эпитоп соответствует другому участку, расположенному ближе к N-концу, чем таковой в моноклональном антителе ЕМ5 согласно изобретению. Хотя оно способно давать дифференциальное окрашивание нейритных бляшек и сосудистых отложений без окрашивания диффузных бляшек, это антитело не проявляет различий в аффинности в отношении пептидов AR42 и Ар40.

Таким образом, моноклональное антитело согласно изобретению, которое было обозначено ЕМ5, представляет собой новый инструмент, поскольку оно распознает по меньшей мере один эпитоп в последовательности β-амилоидного пептида, который не распознается ни одним антителом, описанным в настоящее время в данной области науки. Следовательно, антитело согласно изобретению является пригодным для применения в диагностике болезни Альцгеймера. Оно специфически распознает нейритные бляшки, без обнаружения диффузных бляшек, которые не являются специфически ассоциированными с заболеванием. Среди нейритных бляшек моноклональное антитело согласно изобретению дает возможность обнаруживать подгруппу нейритных бляшек, различающихся по их молекулярному составу относительно отложений β-амилоидного пептида. Кроме того, моноклональное антитело согласно изобретению способно связываться с формами β-амилоидного пептида, присутствующими в растворе, создавая возможность для последующего детектирования и определения количества указанных пептидов, включая те случаи, когда раствор является биологической жидкостью, такой как моча.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение связано с моноклональным антителом, которое распознает в β-амилоидном пептиде эпитоп, соответствующий последовательности:

Val-His-His-Gln-Lys (SEQ ID NO:3),

и способно связываться с изоформами β-амилоидного пептида, которые содержат указанную последовательность, независимо от того, находится ли пептид в растворимой форме, агрегированной форме или денатурирован с помощью SDS, хотя проявляет большую аффинность к изоформе Аβ 42, чем к изоформе Аβ 40.

Данное изобретение относится также к фрагментам указанного антитела, которые также способны связываться с изоформами β-амилоидного пептида, содержащего указанную последовательность SEQ ID NO:3.

В данном изобретении описана также гибридомная клеточная линия, способная продуцировать ранее охарактеризованное моноклональное антитело, и способ получения указанного антитела с помощью указанной гибридомной линии клеток, и выращивание указанной клеточной линии в условиях, которые позволяют получать моноклональное антитело.

Дополнительно в данном изобретении описана композиция, содержащая антитело согласно изобретению или по меньшей мере один его фрагмент, способный связываться с SEQ ID NO:3. Возможным вариантом осуществления композиции согласно изобретению является тот, в котором антитело или его фрагмент соединяется с веществом, которое позволяет его детектировать; указанное вещество является вторым антителом, способным связываться с антителом согласно изобретению или с его фрагментом, и соединено с веществом, которое может позволить его детектировать, как, например фермент, способный катализировать превращение данного вещества в другое, которое можно детектировать, например, хромогенное вещество. Другим возможным вариантом осуществления композиции согласно изобретению является вариант, в котором антитело или его фрагмент соединены с неким веществом или частицей, которая способствует выделению присутствующих в растворе изоформ β-амилоидного пептида, как, например, магнитная частица, которая позволит разделить в растворе комплексы антиген-антитело или антиген-фрагмент антитела, образующиеся при наложении магнитного поля, таким образом делая возможным концентрирование изоформы β-амилоидного пептида, присутствующие в указанном растворе, и облегчать их последующую детекцию, идентификацию и/или количественную оценку.

Данное изобретение относится также к применению моноклонального антитела согласно изобретению или по меньшей мере одного его фрагмента, способного связываться с последовательностью SEQ ID NO:3, для детекции изоформ β-амилоидного пептида, которые содержат SEQ ID NO:3. Изоформы β-амилоидного пептида, которые следует детектировать, могут присутствовать в образце ткани мозга, взятой от человека, в растворе, таком как образец биологической жидкости или полученный из нее раствор, или даже может содержаться в некоторых других образцах небиологического типа, в которых также желательно детектировать возможное присутствие изоформ β-амилоидного пептида.

В заключение данное изобретение относится к способу диагностики болезни Альцгеймера in vitro, основанному на детекции изоформ β-амилоидного пептида посредством применения антитела согласно изобретению или по меньшей мере одного его фрагмента, способного связываться с SEQ ID NO:3. В предпочтительном варианте осуществления изобретения изоформы β-амилоидного пептида детектируются в образце ткани мозга, взятом у индивидуума. В этом случае особенно пригодными могут быть композиции согласно изобретению, в которых антитело или его фрагмент соединяется с веществом, которое может позволить детектировать их, при этом указанное вещество может быть вторым антителом, способным связываться с антителом согласно изобретению или с его фрагментом, и соединяется с еще одним веществом, которое может позволить детектировать его.

В другом предпочтительном варианте осуществления диагностической технологии согласно изобретению изоформы β-амилоидного пептида детектируются в растворе, предпочтительно в образце биологической жидкости, например, в спинномозговой жидкости, моче или крови, или даже в растворе, полученном из биологической жидкости, таком как плазма. В этом втором варианте осуществления изобретения предпочтительно использовать композиции согласно изобретению, в которых антитело или его фрагмент соединено с неким веществом или частицей, которая способствует выделению изоформ β-амилоидного пептида, присутствующих в растворе, например, с магнитной частицей, которая способствует разделению комплексов антиген-антитело или антиген-фрагмент антитела, образующихся в растворе под действием магнитного поля, таким образом создавая возможность концентрировать изоформы β-амилоидного пептида, присутствующие в растворе, и способствуя их последующей детекции, идентификации и/или количественной оценке. Таким образом, способ диагностики согласно изобретению включает в себя следующие стадии:

a) добавление композиции, которая содержит антитело согласно изобретению или по меньшей мере один его фрагмент, способный связываться с SEQ ID NO:3, соединенное с магнитной частицей, к образцу биологической жидкости или полученному из нее раствора;

b) выжидание в течение времени, достаточного для формирования комплексов антиген-антитело или антиген-фрагмент антитела между по меньшей мере одной изоформой β-амилоидного пептида и антителом или фрагментом антитела, содержащимися в композиции;

c) наложение магнитного поля для выделения из раствора комплексов антиген-антитело или антиген-фрагмент антитела;

d) удаление раствора;

e) разделение антитела или фрагмента антитела и молекул β-амилоидного пептида;

f) идентификацию и количественную оценку изоформ β-амилоидного пептида, выделенных из образца биологической жидкости или из полученного из нее раствора.

Предпочтительно, чтобы раствор, из которого экстрагируются изоформы β-амилоидного пептида, был образцом крови или мочи, поскольку их легче получить, чем в случае с образцами спинномозговой жидкости, или - альтернативно - образцом плазмы, полученным из образца крови. Особенно предпочтительно, чтобы из крови или плазмы, или мочи образец биологической жидкости был образцом мочи, который может быть получен без применения инвазивных методов. Однако в таком случае необходимо использовать очень чувствительный метод для идентификации и количественной оценки изоформ β-амилоидного пептида, такой как масс-спектрометрия MALDI-TOF.

Поликлональные антитела ЕМ2 и ЕМ3, которые также были получены авторами настоящего изобретения, также могут применяться в качестве дополнительного инструмента в способе диагностики согласно изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 приведены кривые связывания антител ЕМ5 (верхняя часть) и 6Е10 (нижняя часть) с иммобилизованными пептидами Аβ. Здесь приведены результаты, соответствующие различным концентрациям антител (абсцисса; концентрация в нМ) с обоими пептидами: Аβ 40 (заполненные значки) и Аβ 42 (пустые значки), в обоих случаях агрегированные (Δ) или не агрегированные (□). Каждая точка соответствует среднему значению экспериментов, проведенных в трех параллельных пробах. Оптическая плотность (O.D.) при 450 нм показана на оси ординат.

На фиг.2 показан результат изучения иммунного переноса антител ЕМ2, ЕМ3 и ЕМ5 относительно синтетических пептидов Аβ 1-40 и Аβ 1-42.

На фиг.3 приведена (в верхней части) гистограмма реактивности ЕМ5 к сериям синтетических пептидов Аβ, оцененной при помощи ELISA, со значениями оптической плотности (O.D. при 450 нм), соответствующими 20 мг/мл антител. Нижняя часть соответствует локализации эпитопа, распознанного ЕМ5, согласно результатам ELISA. 1-28R=Aβ_1-28 грызуна. В круглых скобках указаны различные мутации.

На фиг.4 показана локализация эпитопа пептида Аβ, распознанного моноклональным антителом ЕМ5, согласно масс-спектрометрическому анализу иммунопреципитированного β-амилоидного пептида, обработанного различными протеолитическими ферментами, приведенными в таблице в описании (пептиды 1-5). Последовательность 6 соответствует β-амилоидному пептиду без ферментативного гидролиза.

На фиг.5 приведены фотографические снимки иммуноокрашивания ткани мозга, пораженного болезнью Альцгеймера, с применением ЕМ2, ЕМ3, ЕМ5 и комбинаций ЕМ5 с каждым указанным вариантом. Окрашенные структуры помечены как V (сосуды), DP (диффузные бляшки) и NP (нейритные бляшки). Фотографические снимки соответствуют

- (А) и (В): Последовательным серийным срезам одной и той же зоны затылочной части коры головного мозга после иммуноокрашивания с ЕМ5 (А) и ЕМ3 (В) в качестве первого антитела, с применением нитросинего тетразолиевого (NBT) в качестве хромогенного вещества.

- (С): Микрофотографии при большом увеличении с технологией двойного иммуноокрашивания с применением ЕМ3 (хромогенное вещество: NBT) и ЕМ5 (хромогенное вещество: DAB) в качестве первых антител.

(D) и (Е): Последовательным серийным срезам одной и той же области затылочной части коры головного мозга, после иммуноокрашивания с либо ЕМ5 (D), либо с ЕМ2 (Е).

- (F): Микрофотографии при большом увеличении с технологией двойного иммуноокрашивания с применением ЕМ2 (хромогенное вещество: нитросиний тетразолиевый, NBT) и ЕМ5 (хромогенное вещество: диаминобензидин, DAB).

На фиг.6 приведены графики, полученные после масс-спектрометрического исследования MALDI-TOF форм β-амилоидного пептида различной длины. В каждом случае на оси ординат указана интенсивность, выраженная в процентах (% Int.), соответствующая каждому из пиков различных масс (Mas.), выведенному из соотношения масса/заряд (m/z). Верхний график, отмеченный буквой А и маркированный «Ctrl.» справа, был получен для раствора, который содержал пептиды, включающие в себя аминокислоты β-амилоидного пептида с 12 по 29 (Pep. Аβ. 12-29), с 1 по 40 (Pep. Аβ. 1-40) и с 1 по 42 (Pep. Аβ 1-42). Нижний график, отмеченный буквой В и маркированный «ЕМ5+РМ» справа, был получен после концентрирования пептидов из содержащего их раствора с применением антитела ЕМ5, ковалентно связанного с магнитными частицами, и разделения комплексов, образовавшихся при наложении магнитного поля. На чертеже справа внизу изображен участок связывания антитела с каждым из рассматриваемых пептидов.

На фиг.7 приведен график, полученный в результате масс-спектрометрического исследования MALDI-TOF образца мочи здорового человека, к которому были добавлены дополнительные количества пептидов, содержащие аминокислоты β-амилоидного пептида с 12 по 28 (пик, маркированный как Pep. 12-28), с 1 по 40 (пик, маркированный как Pep. 1-40) и 1-42 (пик, маркированный Pep. 1-42), после чего образец был обработан антителом ЕМ5, ковалентно связанным с магнитными частицами, и образовавшиеся комплексы были разделены под действием магнитного поля. Ордината отображает интенсивность в процентах (% Int.), соответствующую каждому из пиков различных масс (Ms.), выведенному из соотношения масса/заряд (m/z). Указаны пики, соответствующие каждой из форм β-амилоидного пептида, добавленной к образцу мочи.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как уже отмечалось, в данном изобретении описано моноклональное антитело ЕМ5, которое распознает в β-амилоидном пептиде эпитоп, соответствующий последовательности:

Val-His-His-Gln-Lys (SEQ ID NO:3)

Эта последовательность соответствует последовательности остатков 12-16 β-амилоидного пептида человека. Следовательно, есть основания предполагать, что указанное антитело будет связываться с изоформами β-амилоидного пептида, которые содержат указанную последовательность, без распознавания тех форм, которые ее не содержат, например, так называемого пептида р3 (Aβ_17-42) и других форм с укороченным N-концом (Aβ_17-x). В характеристике моноклонального антитела, которое подробно описано в приведенных ниже примерах, показано, что ЕМ5 связывается с любым пептидом, содержащим остатки 12-16, последовательности человеческого Аβ, даже несмотря на то, что он имеет модификации вне этого участка, и оно не распознает пептиды, у которых нет указанного участка. Если данный участок модифицирован, как в случае с пептидом Aβ_1-28 (грызун), у которого заменена аминокислота в положении 13, так же как и в положении 5 и 10, то данный пептид больше не распознается ЕМ5.

Более того, исследования показали, что антитело способно связываться с изоформами пептида Аβ, содержащими остатки 12-16, независимо от того, находятся ли они в растворимой форме, агрегированной форме или денатурированы (в SDS). В частности, тесты, описанные в представленных ниже примерах, показывают, что антитело согласно изобретению связывается как с изоформами β-амилоидного пептида, которые агрегируют, образуя часть бляшек, присутствующих в образцах ткани мозга, так и с изоформами β-амилоидного пептида, которые находятся в растворе, включая и случаи, когда раствор представляет собой образец биологической жидкости, такой как моча. Поэтому другой аспект изобретения связан с композицией, которая содержит антитело согласно изобретению или по меньшей мере один его фрагмент, способный связываться с последовательностью SEQ ID NO:3, объединенной с веществом, которое позволяет его детектировать и/или концентрировать, и связан с его применением в диагностике болезни Альцгеймера.

Когда антитело согласно изобретению или его фрагмент объединено с веществом, позволяющим его детектировать, детекция присутствия изоформ β-амилоидного пептида, которые связались с антителом или его фрагментом, и/или их количественная оценка становится возможной посредством детекции и/или количественной оценки антитела или его фрагмента, связавшегося с изоформами β-амилоидного пептида, которые содержат специфическую последовательность, распознаваемую антителом согласно изобретению. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения вещество, с которым связывается антитело или его фрагмент, способный связываться с SEQ ID NO:3, объединено со вторым антителом, способным связываться с моноклональным антителом согласно изобретению, второе антитело связано с ферментом, способным катализировать превращение данного вещества в другое, которое обладает характеристиками, которые способствуют детекции его присутствия. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения второе антитело, связанное с ферментом, является частью системы Envision от Dako Laboratories, вещество, превращение которого катализируется ферментом, является хромогенным веществом, и фермент, который катализирует реакцию, является либо щелочной фосфатазой (в том случае, когда в качестве хромогенного вещества используется нитросиний тетразолиевый), либо пероксидазой хрена (в том случае, когда в качестве хромогенного вещества используется диаминобензидин).

В другом варианте антитело согласно изобретению или его фрагмент связан с веществом или частицей, которая способствует концентрированию изоформ β-амилоидного пептида, которые связались с указанным антителом или его фрагментом. Этот вариант осуществления является предпочтительным, если композиция согласно изобретению используется для детекции и/или количественной оценки изоформ β-амилоидного пептида, которые присутствуют в растворе, особенно в растворе, в котором их концентрация низка, например, в крови или плазме, моче или спинномозговой жидкости. Вещество или частица должны быть такими, чтобы можно было легко разделить комплекс антиген-антитело в указанном растворе, например, при помощи иммунопреципитации. Предпочтительными примерами указанных ча