Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса болезни найроби овец методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции

Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса болезни найроби овец методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики.

Болезнь Найроби овец (далее - БНО) - зооантропонозная трансмиссивная болезнь овец и коз, проявляющаяся рецидивирующей лихорадкой, геморрагическим гастроэнтеритом, гломерулонефритом, слизисто-гнойными выделениями из носа и диареей; характеризуется уровнем смертности, который может варьировать между 40 и 90%.

Болезнь постоянно регистрируется в Кении, Танзании и Мозамбике и в Индии. Согласно данным МЭБ вспышки БНО были зарегистрированы также на Ближнем Востоке (Кувейт, 1995 г.) и в Европе (Греция, 2003 г.). Источником инфекции являются больные овцы и козы, а также скрытые вирусоносители.

Клинические симптомы сходны у овец и коз, хотя овцы более восприимчивы к инфекции.

Человек обычно заражается БНО при укусе инфицированными иксодовыми клещами, естественная восприимчивость людей высокая. После переболевания остается длительный иммунитет, повторные заболевания редки. В странах Африки мужчины заболевают чаще в связи с тем, что в этих местностях они, как правило, занимаются разведением животных. Инкубационный период длится 4-5 суток, основными клиническими симптомами являются: повышение температуры тела до 39-40°С с 2-3-суточными перерывами, озноб, боли в мышцах и суставах, кровавая диарея. В период разгара болезни на туловище и конечностях появляется сыпь. Описано бессимптомное течение болезни у человека.

Во время вспышки БНО при проведении противоэпизоотических мероприятий необходимо проведение быстрых и точных экспертизных исследований, позволяющих в кратчайшие сроки идентифицировать возбудитель.

Известны методы для диагностики инфекции, такие как реакция нейтрализации, иммуноферментный анализ, которые характеризуются высокой чувствительностью и широко применяются [1, 2]. Главным недостатком данных методов является длительность проведения анализа, а тот факт, что реакция нейтрализации дает перекрестные реакции с родственными буньявирусами, исключает возможность проверки подлинности результатов анализа.

Все исследования генома вируса БНО проведены сотрудниками Отдела вирусных и риккетсийных заболеваний Центра контроля и предотвращения болезней (Атланта, шт. Джорджия, США) [3, 4]. Ими были определены нуклеотидные последовательности S- и L-сегментов штаммов "NSD 708" и "Ganjam", проведен филогенетический анализ среди родственных найровирусов и разработаны методики амплификации различных участков генома вируса БНО. Однако одна половина сконструированных этими учеными олигонуклеотидных праймеров является штаммоспецифичными, а другая - родоспецифичными. Таким образом, данные праймеры не позволяют решить задачу выявления генома любого штамма вируса БНО из патологического материала и достоверной дифференциации его от других вирусов методом ПЦР.

Целью данного изобретения является разработка способа выявления геномной РНК вируса БНО с помощью гнездового варианта ОТ-ПЦР с использованием двух синтезированных пар олигонуклеотидных праймеров, комплементарных к консервативной области гена нуклеокапсидного белка N.

С помощью первой (внешней) пары праймеров можно амплифицировать фрагмент ДНК размером 690 пар нуклеотидов (далее - п.н.), являющийся мишенью для отжига второй (внутренней) пары праймеров, позволяющих синтезировать фрагмент размером 360 п.н. Использование двух пар праймеров позволяет добиться высокой специфичности и чувствительности реакции.

Поставленная цель достигается способом для обнаружения вируса БНО в образцах крови, пробах органов латентно инфицированных, больных или павших животных и/или в инфицированных культурах клеток, при котором вначале проводят синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК, а затем ее амплификацию. Данная процедура осуществляется с помощью 3-х наборов, составляющих тест-систему:

1. набор для выделения нуклеиновых кислот, включающий нуклеосорбент, лизирующий буфер с гуанидинтиоционатом и 2 раствора для последовательной отмывки сорбента;

2. набор для постановки ПЦР, включающий реакционную смесь для постановки ПЦР и 2 пары специфических олигонуклеотидных праймеров;

3. набор для проведения электрофореза, включающий агарозу и буфер для электрофореза с бромистым этидием.

Синтез кДНК проводят при температуре 50°С в течение 30 мин с праймером NSD R₁, а затем терминируют реакцию 5-минутным прогреванием реакционной смеси при температуре 94°С.

Полученную кДНК используют для проведения 1-го раунда ПЦР с участием внешней пары праймеров - NSD F₁ и NSD R₁. Полученные в 1-ом раунде фрагменты ДНК размером 930 п.н. используют в качестве матрицы для проведения 2-го раунда ПЦР с использованием внутренней пары праймеров NSD F₂ и NSD R₂. Нуклеотидный состав используемых праймеров следующий:

NSD F₁ 5' -TAT GCT TCT GCC TTG GTT G - 3'

NSD R₁ 5' - АТС CGA TTG GCA GTG AAG - 3'

NSD F₂ 5' - AGA GCA CAT TGA CTG GGC - 3'

NSD R₂ 5' - GCC TTC CAA AGC CAG TAG - 3'

Температурные режимы для проведения обоих раундов ПЦР одинаковы и включают следующие этапы: 2 мин предварительной денатурации при 94°С, 35 циклов амплификации (94°С - 30 сек, 61°С - 30 сек, 72°С - 30 сек), 1 цикл достройки цепей (94°С - 2 мин, 72°С - 5 мин).

После постановки ОТ-ПЦР проводят разделение продуктов путем горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Учет результатов реакции проводят только по 2-ому раунду ПЦР.

Техническим результатом изобретения является повышение степени специфичности и чувствительности, а также сокращение времени проведения диагностической работы по обнаружению вируса в пробах органов и крови от больных животных.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных праймеров (NSD F₁, NSD R₁, NSD F₂, NSD R₂) проводят гнездовую ОТ-ПЦР, позволяющую выявить геном вируса БНО. При наличии в исследуемых образцах РНК вируса БНО, во втором раунде ПНР синтезируется фрагмент ДНК размером 360 п.н. Использование двух пар праймеров позволяет увеличить специфичность и чувствительность метода.

Существенным отличием данных праймеров является то, что они:

1) комплементарны консервативной области гена нуклеокапсидного белка N вируса БНО и некомплементарны к - либо участкам геномов других вирусов;

2) фланкируют на кДНК, полученной на матрице вирусной РНК, фрагмент размером 970 п.н. (праймеры NSD F₁, NSD R₁) а внутри него - фрагмент размером 360 п.н. (праймеры NSD F₂, NSD R₂).

Изобретение иллюстрируется несколькими примерами.

Пример 1. Набор №1 используют для выделения РНК вируса БНО из крови, проб органов, культурального вируссодержащего материала.

Исследуемый материал (кровь, суспензия вируса, 10%-ная суспензия органов) в объеме 100-200 микролитров (далее - мкл) вносят в 1,5 см³ пробирки, в которые предварительно внесено 600 мкл лизирующего буфера на основе гуанидинтиоционата. Пробирки перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 8-10 мин. Затем добавляют 40 мкл нуклеосорбента, инкубируют при комнатной температуре 10 мин, периодически перемешивая смесь. После инкубации пробирки центрифугируют 30 сек при 8-13 тыс.об/мин, надосадочную жидкость отбрасывают. Добавляют 300 мкл отмывочного буфера, тщательно ресуспендируют сорбент, центрифугируют 30 сек при 8-13 тыс об/мин, удаляют надосадочную жидкость. Дважды промывают сорбент 75%-ным этиловым спиртом и далее подсушивают 10 мин при температуре 56°С. К осадку добавляют 50 мкл элюирующего буфера, перемешивают и инкубируют 10 мин при температуре 56°С. Центифугируют пробирки в течение 1 мин при 13 тыс.об/мин и переносят надосадочную жидкость в новые пробирки. Супернатант используют в дальнейшем для синтеза кДНК.

Пример 2. Синтез и амплификация участка кДНК вируса БНО с применением набора №2 для проведения гнездовой ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами.

Расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров.

С помощью программы "BioEdit 7.0" выравнены нуклеотидные последовательности S-сегмента генома штаммов "NSD 708" и "Ganjam G619" вируса болезни Найроби овец. Проанализировав построенный элайнмент, внутри гена нуклеокапсидного белка N найден консервативный участок, расположенный между 238 и 1169 нуклеотидами (5'→3'). С помощью программы "Oligo 4.0" подобраны 2 пары праймеров - NSD F₁ (238-256 нуклеотидные позиции) и NSD R₁ (1152-1169), фланкирующих фрагмент размером 930 пар оснований, а также 2 пары праймеров - NSD F₂ (642-659) и NSD R₂ (984-1001), фланкирующих фрагмент размером 690 пар оснований.

С использованием программы "Oligo 4.0" описаны основные свойства рассчитанных праймеров, определившие возможность их использования в ПЦР. Данные свойства приведены в таблице.

Таблица
Свойства праймеров, рассчитанные с помощью программы "Oligo 4.0"
Название праймера	Температура плавления,1 °С	ΔG гибридизации праймера на матрицу, kcal/mol	ΔG образования шпилечной структуры, kcal/mol	Эффективность отжига праймера на матрицу (Priming efficiency number)2
NSD F1	61,5	-35,9	1,4	392
NSD R1	60,4	-34,7	1,4	384
NSD F2	60,1	-34	1,4	429
NSD R2	60	-35,3	1	373
Примечания.
1Температура плавления рассчитана по алгоритму Nearest neighbor method.
2Priming efficiency number - это величина, определяющая эффективность отжига данного праймера на заданный участок матрицы, рассчитывается по уникальному алгоритму, разработанному создателями программы "Oligo". Минимальное значение Priming efficiency number, при котором праймер в ходе ПЦР эффективно отжигается на специфический участок матрицы, -210.

Тест-система апробирована на различных штаммах вируса БНО. В качестве отрицательных контролей использованы штаммы родственных буньявирусов: лихорадки долины Рифт (ЛДР), Конго-Крымской геморрагической лихорадки (ККГЛ) и Акабане.

Для получения кДНК готовят и маркируют 0,6 см³ пробирки на N-количество образцов, включая отрицательные контроли. В пробирки вносят по 15 мкл реакционной смеси, включающей буфер для ревертазы, 10 пкмоль праймера NSD R₁, 2,5 ммоль каждого dNTP, 20 ед. MMLV-ревертазы; поверх смеси наслаивают 1 каплю (40-45 мкл) минерального масла. Далее под масло вносят 5 мкл исследуемой РНК и помещают пробирки в амплификатор со следующим температурным режимом:

50°С	30 мин	1 цикл
94°С	5 мин

После инкубации реакционную смесь используют как препарат кДНК. Для проведения 1-го раунда ПЦР приготавливают реакционную смесь объемом 25 мкл, включающую по 10 пкмоль праймеров NSD F₁ и NSD R₁, 2,5 ммоль каждого dNTP, буфер для Taq-полимеразы с 15 мM MgCl₂, 1 ед. Taq-полимеразы. Эту смесь вносят в заранее промаркированные пробирки, наслаивают сверху каплю минерального масла и под масло вносят 5 мкл кДНК. Пробирки помещают в амплификатор со следующим температурным режимом:

94°С	2 мин	1 цикл
94°С	30 сек	35 циклов
61°С	30 сек
72°С	30 сек
94°С	2 мин	1 цикл
72°С	5 мин

После завершения программы приступают к выполнению 2-го раунда ПЦР. Для этого переносят 5 мкл смеси из пробирок, в которых проводили 1-й раунд, в новые пробирки с 20 мкл реакционной смеси, включающей 10 пкмоль праймеров NSD F₂ и NSD R₂, 2,5 ммоль каждого dNTP, буфер для Taq-полимеразы с 15 мM MgCl₂, 1 ед. Taq-полимеразы; сверху наслаивают 1 каплю минерального масла. Пробирки загружают в амплификатор с температурным режимом, аналогичным температурному режиму для проведения 1-го раунда ПЦР.

Пример 3. Определения размера продуктов ПЦР с применением набора №3 для проведения электрофореза.

Продукты 2-го раунда ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ом агарозном геле в стандартном трис-боратном буфере.

15 мкл продукта ПЦР (уже содержащего буфер для внесения в гель) вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 15 мин). Результат электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 260 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результат считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента 360 пар оснований.

С применением тест-системы и рассчитанных праймеров выявлялись все исследуемые образцы вируса БНО. Отрицательные контроли не амплифицировались.

Пример 4. Определение чувствительности и специфичности ПЦР на основе синтетических олигонуклеотидных праймеров, на ген белка N.

Результаты проведения ПЦР с праймерами, комплементарными гену белка N вируса БНО.
Наименование препаратов	Титр вируса ТЦД50/мл	Шифр	Ожидаемый результат	Фактический результат
Вирус БНО штамм "ММ"	6,0	1	+	+
Вирус БНО штамм "ММ/К-05	5,8	2	+	+
Вирус БНО штамм "ММ/К-05	1,8	3	+	+
вирус ЛДР штамм "ВНИИВВиМ1974"	6,5	4	-	-
Вирус Акабане штамм "В8935"	4,75	5	-	-
вирус ККГЛ (положительный контроль из набора "АмплиСенс ККГЛ" производства ФГУН Ц ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора для выявления генома вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР)	5,0	6

Тест-система и синтетические олигонуклеотидные праймеры были проверены на специфичность и чувствительность. Установлено, что тест-система не амплифицирует кДНК других вирусов.

Таким образом, предлагаемая тест-система позволяет достичь высокого уровня чувствительности с помощью двух пар праймеров, позволяющих получить во 2-ом раунде ПЦР фрагмент размером 360 п.н.

Источники информации

1. Davies F.G. Nairobi sheep disease // Parassitologia. - 1997. - V.39 - №2 - C.95-98.

2. Davies F.G, Mungai J.N., Taylor M. The laboratory diagnosis of Nairobi sheep disease // Trop. Anim. Health. Prod. - 1977. - V.9 - №2 - С.75-80.

3. Marczinke В.I., Nichol. S.T. Nairobi sheep disease virus, an important tick-borne pathogen of sheep and goats in Africa, is also present in Asia // Virology. - 2002. - V.303. - №1 - С.146-151.

4. Terpstra C. Physical and biological properties of Nairobi sheep disease virus // Vet. Microbiol. - 1983. - V.8 - №6 - С.531-541.

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные консервативной области S-сегмента генома вируса болезни Найроби овец, используемые для выявления к ДНК вируса болезни Найроби овец, имеющие следующий нуклеотидный состав:NSD F₁ 5'-TATGCTTCTGCCTTGGTTG-3'NSD R₁ 5'-ATCCGATTGGCAGTGAAG-3'NSD F₂ 5'-AGAGCACATTGACTGGGC-3'NSD R₂ 5'-GCCTTCCAAAGCCAGTAG-3'.

2. Способ выявления вируса болезни Найроби овец, включающий выделение РНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров, амплификацию РНК вируса, оценку проведения реакции гель-электрофорезом в агарозе, отличающийся тем, что синтез к ДНК проводят при температуре 50°С в течение 30 мин с праймером NSD R₁, а затем терминируют реакцию 5-минутным прогреванием реакционной смеси при температуре 94°С, затем полученную к ДНК используют для проведения 1-го раунда ПЦР с участием внешней пары праймеров NSD F₁ и NSD R₁ по п.1, а полученные в 1-м раунде фрагменты ДНК используют в качестве матрицы для проведения 2-го раунда ПЦР с использованием внутренней пары праймеров NSD F₂ и NSD R₂ по п.1, при этом температурный режим ПЦР одинаков для 1-го и 2-го раундов и включает следующие этапы: 2 мин предварительной денатурации при 94°С, 35 циклов амплификации (94°С - 30 с, 61°С - 30 с, 72°С - 30 с), 1 цикл достройки цепей (94°С - 2 мин, 72°С - 5 мин), далее после 2-го раунда ПЦР проводят учет результатов реакции, при этом результат реакции считается положительным, если размер фрагмента соответствует 360 пар нуклеотидов.

3. Тест-система для обнаружения ДНК вируса болезни Найроби овец, включающая пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Taq-полимеразу, ПЦР-смесь для постановки реакции, положительный и отрицательный контроли, отличающаяся тем, что содержит три набора: 1) набор для выделения нуклеиновых кислот, включающий нуклеосорбент с лизирующим буфером на основе гуанидинтиоционата и 2 раствора для последовательной промывки сорбента; 2) набор для постановки ПЦР, содержащий реакционную смесь для постановки ПЦР и синтетические олигонуклеотидные праймеры по п.1; 3) набор для проведения электрофореза, включающий агарозу и буфер для электрофореза с бромистым этидием.