Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Известен способ определения функциональной активности компонента С3 [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем внесение в лунки микропланшета комплемента морской свинки, служащего в качестве источника компонентов С1, С2 и С4 (присутствующий компонент С3 морской свинки не обнаруживается специфическими антителами против С3 человека) и анализируемой пробы, содержащей компонент С3 человека с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит связывание С3 на молекулах активатора - сорбированного иммуноглобулина. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 человека определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3, конъюгированных с ферментом.

Недостатком этого способа является трудность получения иммунохимически чистых препаратов иммуноглобулина G человека и плохое сохранение его активирующей способности при хранении, а также снижение чувствительности метода из-за присутствующего гетерологичного компонента С3 морской свинки.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента С3 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата дерината для использования в качестве активатора классического пути комплемента и заменой комплемента морской свинки гомологичным реагентом R3 - сыворотки крови человека, лишенной активности С3.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесения в лунки микропланшета реагента R3 (сыворотки человека, лишенной активности компонента С3 с сохранением активностей остальных компонентов комплемента, получаемой, например, обработкой ее в течение 18 ч при 4°С раствором KBr [2]) и анализируемой пробы, содержащей компонент С3 с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит ковалентное связывание С3 на молекулах сорбированного дерината. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3 - фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Тем самым достигается определение функциональной активности С3 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R3, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности компонента С3, обладающих высокой чувствительностью и отсутствием необходимости использования трудно выделяемого и плохо сохраняющего свою активирующую способность препарата иммуноглобулинов.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата компонента С3. Растворяют аптечный препарат дерината в вероналовом буферном растворе, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS²⁺), в концентрациях 10-150 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Содержимое лунок выливают, отмывают планшет тем же буфером, затем осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора VBS²⁺, содержащего 10 мкл реагента R3 (сыворотки крови человека, лишенной активности компонента С3), и анализируемую пробу, содержащую компонент С3 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, (ЗФР-Т) и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера с ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 5-10 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата С2 рассчитывают по стандартной кривой (см. чертеж).

Пример 2. Приготовление R3. К 10 мл охлажденной до 4°С свежей сыворотки крови человека при непрерывном помешивании медленно приливают 10 мл насыщенного при 4°С раствора KBr. Смесь инкубируют 18 ч при 4°С, затем диализуют 18 ч против изотонического фосфатного буфера, рН 7,2, разливают по пробиркам и хранят при -50°С. В качестве реагента R3 используют препарат, разбавленный вероналовым буфером в соотношении 2:3.

Пример 3. Набор для определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R3, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С3.

Из приведенных на чертеже результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента С2 с коэффициентом корреляции R²=0,992, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента С3 описанным способом с использованием описанного набора. Предложенный способ позволяет определять активность С3 в концентрациях от 7 нг/мл до 1000 нг/мл, что выгодно отличает его от чувствительности прототипа, позволяющего определять активность С3, начиная с концентрации 50 нг/мл.

Источники информации

1. Козлов Л.В., Романов С.В., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека по классическому пути. 2005.

Патент РФ 2251397. Бюл.№13. 10.05.2005.

2. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5. Биоорганическая химия. 1982. Т.8. №5. С.652-659.

1. Способ определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора классического пути комплемента, внесение в лунки микропанели анализируемой пробы, содержащей компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, и раствора, содержащего компоненты С1, С2 и С4, инкубацию, выливание содержимого лунок, внесение конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека, а затем, после инкубации и удаления инкубационного раствора, внесение субстратного буфера, проведение расчета активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора классического пути комплемента используют деринат, а в качестве раствора, содержащего компоненты С1, С2 и С4, реагент R3, представляющий собой сыворотку крови человека, лишенную активности С3.

2. Набор для определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R3, представляющий собой сыворотку крови человека, лишенную активности С3, и субстратный буфер.