Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк

Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США № 11/299254, зарегистрированной 8 декабря 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 11/234730, зарегистрированной 23 сентября 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 11/205646, зарегистрированной 17 августа 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 11/098303, зарегистрированной 4 апреля 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/923536, зарегистрированной 20 августа 2004 года, которая является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US04/16390, зарегистрированной 24 мая 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/826966, зарегистрированной 16 апреля 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/757803, зарегистрированной 14 января 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/720448, зарегистрированной 24 ноября 2003 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/693059, зарегистрированной 23 октября 2003 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/444853, зарегистрированной 23 мая 2003 года, которая является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US03/05346, зарегистрированной 20 февраля 2003 года, и частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US03/05028, зарегистрированной 20 февраля 2003 года, где в двух последних документах заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/358580, зарегистрированной 20 февраля 2002 года, предварительной заявки на патент США 60/363124, зарегистрированной 11 марта 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/386782, зарегистрированной 6 июня 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/406784, зарегистрированной 29 августа 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/408378, зарегистрированной 5 сентября 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/409293, зарегистрированной 9 сентября 2002 года, и предварительной заявки на патент США № 60/440129, зарегистрированной 15 января 2003 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US04/13456, зарегистрированной 30 апреля 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/780447, зарегистрированной 13 февраля 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/427160, зарегистрированной 30 апреля 2003 года, которая является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US02/15876, зарегистрированной 17 мая 2002 года, в которой заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/292217, зарегистрированной 18 мая 2001 года, предварительной заявки на патент США № 60/362016, зарегистрированной 6 марта 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/306883, зарегистрированной 20 июля 2001 года, и предварительной заявки на патент США № 60/311865, зарегистрированной 13 августа 2001 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением заявки на патент США № 10/727780, зарегистрированной 3 декабря 2003 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US05/04270, зарегистрированной 9 февраля 2005 года, в которой заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/543480, зарегистрированной 10 февраля 2004 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением заявки на патент США № 11/353630, зарегистрированной 14 февраля 2006 года, в которой заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/652787, зарегистрированной 14 февраля 2005 года, предварительной заявки на патент США № 60/678531, зарегистрированной 6 мая 2005 года, предварительной заявки на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 года, и предварительной заявки на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 года. В настоящей заявке утверждается полезность всех перечисленных заявок, которые в этой связи включены в качестве ссылок в материалы настоящей заявки полностью, включая имеющиеся в них чертежи и рисунки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям и способам исследования, диагностики и лечения признаков, заболеваний и состояний, которые являются ответом на модуляцию экспрессии генов и/или их активности. Настоящее изобретение также относится к соединениям, композициям и способам, относящимся к признакам, заболеваниям и состояниям, которые являются ответом на модуляцию экспрессии и/или активности генов, вовлекаемых в механизмы генной экспрессии или другие клеточные процессы, которые опосредуют поддержание или развитие таких признаков, заболеваний и состояний. Конкретно, настоящее изобретение относится к двухцепочечным молекулам нуклеиновой кислоты, включающим малые молекулы нуклеиновой кислоты, такие как короткие интерферирующие молекулы нуклеиновой кислоты (киНК), молекулы короткой интерферирующей РНК (киРНК), молекулы РНК двухцепочечной (дцРНК), молекулы микроРНК (миРНК) и молекулы короткой шпилечной РНК (кшРНК), которые способны быть посредниками в процессе интерференции РНК (РНКи), направленной против генной экспрессии, включая коктейли таких малых молекул нуклеиновой кислоты и липидные наночастичные композиции (ЛНЧ) на основе таких малых молекул нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение также относится к малым молекулам нуклеиновой кислоты, таким как киНК, киРНК и другие, которые способны ингибировать функцию молекул эндогенной РНК, таких как эндогенная микроРНК (миРНК) (например, ингибиторы миРНК) или эндогенная короткая интерферирующая РНК (киРНК) (например, ингибиторы киРНК), или которые могут ингибировать функцию RISC (например, ингибиторы RISC), с достижением модуляции генной экспрессии за счет создания препятствий осуществлению регуляторной функции в случае таких эндогенных РНК или белков, ассоциированных с такими эндогенными РНК (например, RISC), включая коктейли таких малых молекул нуклеиновой кислоты и липидных наночастичных композиций (ЛНЧ) на основе таких малых молекул нуклеиновой кислоты. Указанные малые молекулы нуклеиновой кислоты используются, например, при создании композиций, действующих в направлении предупреждения, ингибирования или снижения выраженности различных заболеваний, признаков и состояний, которые ассоциированы с экспрессией или активностью гена у субъекта или в организме.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже приводится обсуждение информации, относящейся к РНКи. Данное обсуждение приводится лишь для пояснения рассматриваемого изобретения. Соответственно, нижеследующее описание не является прямым указанием на то, что приведенная в нем информация отражает достигнутый уровень техники, предшествующий заявленному изобретению.

Интерференция РНК относится к процессу специфичного по последовательности посттранскрипционного молчания гена у животных, который сопряжен с участием в нем коротких интерферирующих молекул РНК (киРНК) (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13:139-141; и Strauss, 1999, Science, 286, 886). Соответствующий процесс в растениях (Heifetz et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/61631) известен как посттранскрипционное молчание гена, или молчание РНК, а также как процесс подавления гена, применительно к грибам. Процесс посттранскрипционного молчания гена, как считается, представляет собой эволюционно законсервативный механизм клеточной защиты, используемый организмом для предотвращения экспрессии чужеродных генов, и представляет собой общий механизм для различных представителей растительного и животного миров (Fire et al., 1999, Trend genet., 15, 358). Такой путь защиты от экспрессии чужеродного гена мог возникнуть в ответ на продукцию двухцепочечных РНК (дцРНК), в результате вирусной инфекции или в результате случайной интеграции транспозоновых элементов в геном организма-хозяина, по механизму клеточного ответа, направленного на специфическое разрушение гомологичной одноцепочечной РНК или вирусной геномной РНК. Наличие дцРНК в клетках запускает ответный процесс РНКи по механизму, который до сих пор полностью не изучен. Указанный механизм, по всей видимости, отличается от других известных механизмов, которые вовлекают рибонуклеазы, специфичные для двухцепочечной РНК, таких как реакция интерферона, которая является результатом дцРНК-опосредованной активации протеинкиназы PKR и 2',5'-олигоаденилатсинтетазы, приводящей к неспецифическому расщеплению мРНК рибонуклеазой L (см., например, патенты США №№ 6107094; 5898031; Clemens et al., 1997, J. Interferon & Сytokine Res., 17, 503-524; Adah et al., 2001, Curr. Med. Chem., 8, 1189).

Наличие длинных дцРНК в клетках стимулирует активность фермента рибонуклеазы III, известного как дайсер (Dicer) (Bass, 2000, Cell, 101, 235; Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293). Дайсер вовлекается в механизм процессинга дцРНК с образованием коротких участков дцРНК, известных как короткие интерферирующие РНК (киРНК) (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2000, Cell, 101, 235; Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363). Короткие интерферирующие РНК, возникающие в результате активности фермента дайсер, содержат в типичном случае от примерно от 21 до примерно 23 нуклеотидов в длину и включают дуплекс из примерно 19 пар оснований (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188). Дайсер также вовлекается в процесс удаления малых временных РНК длиной 21 и 22 нуклеотида (мвРНК) из молекулы РНК-предшественника с консервативной структурой, которая вовлекается в контроль трансляции (Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834). Реакция по типу РНКи также приводит к образованию эндонуклеазного комплекса, известного как РНК-индуцированный молчащий комплекс (RISC), который опосредует расщепление одноцепочечных РНК, содержащих последовательность, комплементарную к антисмысловой цепи дуплекса киРНК. Расщепление целевой РНК происходит в середине участка, комплементарного к антисмысловой цепи дуплекса киРНК (Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188).

Процесс РНКи исследовали на множестве различных систем. Файр с соавт. (Fire et al., 1998, Nature, 391, 806) первыми обнаружили РНКи в C. elegans. Бахрамиан и Зарби, а также Вианни и Гетц (Bahramian and Zarbi, 1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283 и Wianny and Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70) описали функционирующие в системах млекопитающих РНКи, опосредованные дцРНК. Хаммонд с соавт. (Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293) описали РНКи в клетках Drosophila, трансфицированных дцРНК. Элбашир с соавт. и Тушл с соавт. (Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494 и Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164) описали РНКи, индуцированную введением дуплексов синтетических 21-нуклеотидных РНК в культуры клеток млекопитающих, включающих эмбриональные клетки почки человека и клетки HeLa. Последние работы, проведенные на лизатах эмбриональных клеток Drosophila (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877 и Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164), позволили выявить ряд требований к длине киРНК, ее структуре, химическому составу и последовательности, которые являются обязательными для эффективного проявления активности РНКи. Данные исследования показали, что 21-нуклеотидные дуплексы киРНК в основном являются активными в том случае, когда они содержат 3'-концевые динуклеотидные выступающие фрагменты. Кроме того, полное замещение одной или обеих цепей киРНК 2'-дезокси- (2'-H) или 2'-О-метилнуклеотидами удаляет активность РНКи, тогда как, по результатам проведенных исследований, замещение 3'-концевых нуклеотидных выступающих фрагментов киРНК 2'-дезоксинуклеотидами (2'-H) не устраняет активность. Кроме того, было показано, что единичные ошибочные спаривания в последовательностях, расположенных в центре дуплекса киРНК, также удаляют активность РНКи. Дополнительно, проведенные исследования также показали, что положение сайта расщепления в целевой РНК определяется 5'-концом ведущей последовательности киРНК, а не 3'-концом указанной ведущей последовательности (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877). Результаты других исследований показали, что 5'-фосфат в комплементарной цепи-мишени дуплекса киРНК необходим для осуществления активности киРНК, а также продемонстрировали, что АТФ используется для поддержания 5'-фосфатного фрагмента в киРНК (Nykanen et al., 2001, Cell, 107, 309).

Проведенные исследования показали, что замещение 3'-концевых нуклеотидных выступающих сегментов 21-нуклеотидного дуплекса киРНК, содержащего динуклеотидные выступающие 3'-фрагменты с дезоксирибонуклеотидами, не оказывает неблагоприятного эффекта на активность РНКи. Было также показано, что замещение вплоть до четырех нуклеотидов на каждом конце киРНК дезоксирибонуклеотидами хорошо переносится, тогда как полное замещение дезоксирибонуклеотидами приводит к устранению активности РНКи (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877 и Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164). Кроме того, Элбашир с соавт. (Elbashir, et al., выше) также сообщили, что замещение киРНК 2'-O-метилнуклеотидами полностью подавляет активность РНКи. Ли с соавт. и Бич с соавт. (Li et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/44914 и Beach et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/68836) ранее предположили, что киРНК может включать модификации либо фосфатно-сахарного скелета, либо нуклеозида, которые включают по меньшей мере один гетероатом азота или серы, однако ни в одной из заявок не было установлено, в какой мере такие модификации могут быть толерантными для молекул киРНК, а также не было приведено каких-либо указаний или соответствующих примеров относительно таких модифицированных киРНК. Кройтцер с соавт. (Kreutzer et al., публикация на патент Канады № 2359180) также описали некоторые химические возможные для использования в конструкциях дцРНК модификации, которые могут противодействовать активации зависимой от двухцепочечной РНК протеинкиназы PKR, конкретно, за счет наличия 2'-амино- или 2'-О-метилнуклеотидов и нуклеотидов, содержащих 2'-О- или 4'-С-метиленовый мостик. Однако Крейцер с соавт. (Kreutzer et al.) также не привели какие-либо примеры или соответствующие руководства, позволяющие определить, до какой степени такие модификации будут толерантными для молекул дцРНК.

Парриш с соавт. (Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1077-1087) проанализировали некоторые химические модификации, введенные в unc-22 ген из C. elegans с использованием длинных (>25 нуклеотидов) транскриптов киРНК. Авторы описали введение тиофосфатных остатков в такие транскрипты киРНК путем встраивания тиофосфатных аналогов нуклеотидов с использованием Т7 и Т3 РНК-полимеразы и показали, что РНК с двумя модифицированными фосфоротиоатом основаниями характеризуются значительным снижением эффективности РНКи. Кроме того, Парриш с соавт. (Parrish et al.) сообщили, что фосфоротиоатная модификация более чем двух остатков очень сильно дестабилизирует РНК in vitro, так что при этом интерферирующая активность не может быть даже оценена (Id. at 1081). Авторы также проанализировали некоторые модификации в 2'-положении нуклеотидного сахара в длинных транскриптах киРНК и обнаружили, что замещение рибонуклеотидов дезоксинуклеотидами приводит к значительному снижению интерферирующей активности, особенно в случае замены уридина на тимидин и/или цитидина на дезоксицитидин. Кроме того, авторы проанализировали некоторые модификации оснований, включая замещения в смысловых и антисмысловых киРНК, урацила на 4-тиоурацил, 5-бромурацил, 5-йодурацил и 3-(аминоаллил)урацил и гуанозина на инозин. В то время как замещения 4-тиоурацилом и 5-бромурацилом были, по всей видимости, толерантными для исследованных молекул, Парриш (Parrish) сообщил, что введение инозина приводит к значительному снижению интерферирующей активности при его включении в любую цепь. Кроме того, Парриш (Parrish) сообщил также, что включение 5-йодурацила и 3'-(аминоаллил)урацила в антисмысловую цепь также приводит к значительному снижению активности РНКи.

Было описано использование более длинных фрагментов дцРНК. Так, например, Бич с соавт. (Beach et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/68836) описывают специфические методы снижения генной экспрессии с использованием дцРНК эндогенного происхождения. Тушл с соавт. (Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164) описывают систему РНКи в клетках Drosophila in vitro и использование специфических молекул киРНК для некоторых функциональных геномных и некоторых терапевтических направлений использования; хотя Тушл (Tuschl, 2001, Chem. Biochem., 2, 239-245) высказывает сомнение относительно того, что РНКи может использоваться для лечения генетически обусловленных заболеваний или вирусных инфекций в связи с опасностью активации интерферонового ответа. Ли с соавт. (Li et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/44914) описывают использование специфических длинных (141 п.о.-488 п.о.) молекул дцРНК, синтезированных энзиматически или экспрессированных на основе вектора, для снижения экспрессии некоторых целевых генов. Зерницка-Гетц с соавт. (Zernicka-Goetz et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/36646) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии определенных генов в клетках млекопитающих с использованием ряда длинных (550 п.о.-714 п.о.) молекул дцРНК, синтезированных энзиматически или экспрессированных на основе вектора. Файр с соавт. (Fire et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/32619) описывают некоторые способы введения ряда длинных молекул дцРНК в клетки с целью применения их для ингибирования экспрессии генов в нематодах. Плетинк с соавт. (Plaetinck et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/01846) описывают некоторые способы идентификации специфических генов, ответственных за определенный фенотип клетки, с использованием специфических длинных молекул дцРНК. Мелло с соавт. (Mello et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/29058) описывают идентификацию специфических генов, вовлекаемых в дцРНК-опосредованную РНКи. Пачук с соавт. (Pachuck et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/63364) описывают некоторые длинные (по меньшей мере содержащие 200 нуклеотидов) конструкции дцРНК. Дешам Дэпайет с соавт. (Deschamps Depaillette et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/07409) описывают специфические композиции, состоящие из некоторых молекул дцРНК, объединенных с некоторыми антивирусными агентами. Ватерхаус с соавт. (Waterhouse et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/53050 и 1998, PNAS, 95, 13959-13964) описывают некоторые способы снижения фенотипической экспрессии нуклеиновой кислоты в растительных клетках с использованием некоторых дцРНК. Дрисколл с соавт. (Driscoll et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/49844) описывают специфические конструкции экспрессии ДНК, которые при их использовании способствуют молчанию генов в целевых организмах.

В литературе имеются также другие публикации по различным системам РНКи и молчащим генам. Например, Парриш с соавт. (Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1077-1087) описывают специфические химически модифицированные конструкции дцРНК, действие которых направлено на unc-22 ген из C. elegans. Гроссниклаус (Grossniklaus, публикация по Международной заявке PCT № WO 01/38551) описывает некоторые способы регуляции экспрессии генов polycomb с использованием некоторых дцРНК. Чуриков с соавт. (Churikov et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/42443) описывают некоторые способы модификации генетических характеристик организмов с использованием некоторых дцРНК. Когони с соавт. (Cogoni et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/53475) описывают некоторые способы выделения молчащего гена из Neurospora и их использование. Рид с соавт. (Reed et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/68836) описывают некоторые способы достижения молчания генов в растениях. Хонер с соавт. (Honer et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/70944) описывают некоторые способы скрининга лекарственных препаратов с использованием трансгенных нематод на моделях болезни Паркинсона с использованием некоторых дцРНК. Дик с соавт. (Deak et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/72774) описывают некоторые генные продукты из клеток Drosophila, которые могут иметь отношение к РНКи в Drosophila. Арндт с соавт. (Arndt et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/92513) описывают некоторые способы воздействия на супрессию гена с использованием факторов, усиливающих РНКи. Тушл с соавт. (Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 02/44321) описывают некоторые синтетические конструкции киРНК. Пачук с соавт. (Pachuck et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/63364) и Сатишчандран с соавт. (Satishchandran et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/04313) описывают некоторые способы и композиции, используемые для ингибирования функций некоторых полинуклеотидных последовательностей, с использованием некоторых длинных (содержащих свыше 250 п.о.) дцРНК, экспрессированных на основе вектора. Эчевери с соавт. (Echeverri et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 02/38805) описывают некоторые гены из C. elegans, идентифицированные с помощью систем РНКи. Крейцер с соавт. (Kreutzer et al., публикации по Международным заявкам PCT № WO 02/055692, WO 02/055693 и EP 1144623 B1) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии гена с использованием дцРНК. Грахам с соавт. (Graham et al., публикации по Международным заявкам PCT №№ WO 99/49029 и WO 01/70949 и AU 4037501) описывают некоторые молекулы киРНК, экспрессированные на основе векторов. Фиэр с соавт. (Fire et al., US 6506559) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии гена in vitro с использованием некоторых длинных конструкций дцРНК (299 п.о.-1033 п.о.), которые опосредуют функцию РНКи. Мартини с соавт. (Martinez et al., 2002, Cell, 110, 563-574) описывают некоторые одноцепочечные конструкции киРНК, включающие некоторые 5'-фосфорилированные одноцепочечные киРНК, которые опосредуют интерферирующую активность РНК в клетках Hela. Харборт с соавт. (Harborth et al., 2003, Antisense & Nicleic Acid Drug Development, 13, 83-105) описывают некоторые химически и структурно модифицированные молекулы киРНК. (Chiu и Rana, 2003, RNA, 1034-1048) описывают некоторые химические и структурные модифицированные молекулы киРНК. Вулф с соавт. (Woolf et al., публикации по Международным заявкам PCT №№ WO 03/064626 и WO 03/064625) описывают некоторые химически модифицированные конструкции дцРНК. Хорнунг с соавт. (Hornuhg et al., 2005, Nature Medicine, 11, 263-270) описывают мощную, специфичную по последовательности индукцию IFN-альфа короткими интерферирующими РНК в плазмацитоидных дендритных клетках через TLR7. Дяджь с соавт. (Judge et al., 2005, Nature Biotechnology, Published online: 20 March 2005) описывают зависимую от последовательности стимуляцию врожденного и иммунного ответа у млекопитающих синтетическими киРНК. Йюки с соавт. (Yuki et al., публикации по Международным заявкам PCT №№ WO 05/049821 и WO 04/048566) описывают некоторые способы создания коротких последовательностей, интерферирующих РНК, и некоторые короткие последовательности РНК с оптимизированной активностью. Саиго с соавт. (Saigo et al., публикация по Международной заявке US 20040539332) описывают некоторые способы создания олиго- или полинуклеотидных последовательностей, включающих короткие последовательности интерферирующих РНК, для достижения интерференции РНК. Теи с соавт. (Tei et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 03/044188) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии гена-мишени, которые включают трансфекцию клетки, ткани или отдельного организма двухцепочечных полинуклеотидов, включающих ДНК и РНК, содержащих по существу идентичную нуклеотидную последовательность с наличием по меньшей мере частичной нуклеотидной последовательности гена-мишени.

Все авторы приведенных ниже патентных и научных публикаций (Mattick, 2005, Science, 309, 1527-1528; Claverue, 2005, Science, 309, 1529-1550; Sethupathy et al., 2006, RNA, 12, 192-197; и Czech, 2006, MEJM, 354, 11:1194-1195; Hutvagner et al., US 20050227256 и Tuschl et al., US 20050182005) описывают антисмысловые молекулы, которые могут ингибировать функцию миРНК через пространственное блокирование, и все указанные работы включены в настоящее описание полностью в качестве ссылок.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям и способам, используемым для модуляции экспрессии генов, таких как гены, ассоциированные с развитием или поддержанием состояния болезни, признаков и состояний, имеющих отношение к экспрессии или активности генов, за счет интерференции РНК (РНКи) с использованием коротких молекул интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК). Настоящее изобретение также относится к соединениям, композициям и способам, используемым для модуляции экспрессии и активности одного или нескольких генов, вовлекаемых в пути генной экспрессии и/или активности, по механизму интерференции РНК (РНКи) с использованием малых молекул нуклеиновой кислоты. В частности, настоящее изобретение охватывает малые молекулы нуклеиновой кислоты, такие как короткие молекулы интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), короткие молекулы интерферирующей РНК (киРНК), двухцепочечные молекулы РНК (дцРНК), молекулы микроРНК (миРНК) и короткие шпилечные молекулы РНК (кшРНК), и способы использования для модуляции экспрессии генов и/или других генов, вовлекаемых в пути генной экспрессии и/или активности.

Настоящее изобретение также относится к малым молекулам нуклеиновой кислоты, таким как киНК, киРНК, и к другим молекулам, которые могут ингибировать функции эндогенных молекул РНК, таких как эндогенные молекулы микроРНК (миРНК) (например, ингибиторы миРНК) или эндогенные короткие молекулы интерферирующих РНК (киРНК) (например, ингибиторы киРНК), или которые могут ингибировать функцию RISC (например, ингибиторы RISC) с целью модуляции генной экспрессии путем интерференции регуляторной функции таких эндогенных РНК или белков, ассоциированных с такими эндогенными РНК (например, RISC). Такие молекулы в целом в тексте настоящего описания обозначаются как ингибиторы РНКи.

КиНК или ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может представлять немодифицированную или химически модифицированную молекулу. КиНК или ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может быть синтезирован химически, может быть экспрессирован на основе вектора или может быть синтезирован энзиматически. Настоящее изобретение также охватывает различные химически модифицированные синтетические короткие молекулы интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способные модулировать экспрессию или активность гена-мишени в клетках за счет интерференции РНК (РНКи). Настоящее изобретение также охватывает различные химически модифицированные синтетические короткие молекулы нуклеиновой кислоты (киНК), способные модулировать активность РНКи в клетках путем взаимодействия миРНК, киРНК или RISC и в этой связи регуляцию или ингибирование интерференции РНК (РНКи), ингибирование трансляции или трансляционного молчания в клетке или организме. Использование химически модифицированных киНК и/или РНКи улучшает различные свойства нативных молекул киНК и/или ингибиторов РНКи за счет повышения их резистентности к деградации нуклеазами in vivo и/или в результате повышенного поглощения клетками. В отличие от полученных ранее результатов молекулы киНК согласно настоящему изобретению, содержащие множественные химические модификации, включая полностью модифицированные киНК, сохраняют свою РНКи активность. В этой связи авторы изобретения предлагают химически модифицированные киРНК (в целом обозначаемые в тексте как киНК), которые сохраняют или повышают активность нативных киРНК. Молекулы киНК согласно настоящему изобретению обеспечивают наличие полезных реагентов и способов для множества терапевтических, профилактических, ветеринарных, диагностических применений, для целевой валидации, для геномных исследований, генетической инженерии и для фармакогеномных вариантов использования.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются одна или несколько молекул киНК и/или ингибиторов РНКи и способы, которые независимо или в сочетании модулируют экспрессию генов-мишеней, кодирующих белки, такие как белки, которые ассоциированы с подержанием и/или развитием заболевания, признаков, расстройств и/или состояний, приведенных в настоящем описании или известных в данной области, таких как гены, кодирующие последовательности, включающие последовательности, имеющиеся в Генбанке (GenBank) с номерами доступа, приведенными в предварительных заявках на патенты США №№ 60/363124, USSN 10/923536 и PСТ/US03/05028, которые включены в настоящее описание в качестве «целевых» последовательностей/последовательностей мишеней. Приведенное ниже описание различных аспектов и вариантов настоящего изобретения дано в сочетании со ссылкой на репрезентативные целевые гены, обозначаемые в тексте описания как гены-мишени. Настоящее изобретение также относится к соединениям, композициям и способам, относящимся к признакам, заболеваниям и состояниям, которые являются реакцией на модуляцию экспрессии и/или активности генов, вовлекаемых в пути генной экспрессии или другие клеточные процессы, опосредующие поддержание или развитие таких признаков, заболеваний и состояний. Однако такая ссылка является лишь репрезентативной, и различные аспекты и варианты настоящего изобретения также имеют отношение к другим генам, которые экспрессируют альтернативные целевые гены, такие как мутантные целевые гены, сплайсинг-варианты целевых генов, варианты целевого гена, определяемые видовой спецификой или варьирующие от субъекта к субъекту, и другие целевые генные пути, приведенные в описании или известные в данной области. Дополнительные гены могут быть проанализированы применительно к их целевым сайтам с использованием способов согласно настоящему изобретению, приведенных для репрезентативных целевых генов и описанных последовательностей. Таким образом, модуляция и эффекты такой модуляции других генов могут быть осуществлены по приведенным способам. Иными словами, термины «мишень» и «ген-мишень» в контексте приведенного описания и применительно к цитированным материалам охватывает гены, ассоциированные с развитием и/или поддержанием заболевания, признаков и состояний, таких как гены, кодирующие полипептиды, регуляторные полинуклеотиды (например, миРНК и киРНК), мутантные гены и сплайсинг варианты генов, а также другие гены, вовлекаемые в пути генной экспрессии и/или активности. Таким образом, каждый из вариантов, приведенных в настоящем описании, со ссылкой на термин «мишень» применим во всех молекулах белков, пептидов, полипептидов и/или полинуклеотидов, для которых применим термин «мишень» в контексте, соответствующем настоящему описанию. В целом такие гены-мишени также в тексте настоящего описания могут обозначаться как «целевые» последовательности.

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей две или более разных молекул киНК и/или ингибиторов РНКи согласно настоящему изобретению (например, киНК, дуплекс, формирующий киНК, или многофункциональная киНК или их любое сочетание), воздействующих направленно на разные полинуклеотидные мишени, такие как разные участки целевой РНК или ДНК (например, два разных сайта-мишени, такие как приведенные в настоящем описании или любое сочетание мишеней или целевых путей), или как кодирующие, так и некодирующие мишени. Такое объединение молекул киНК может обеспечить повышенный терапевтический эффект.

В одном варианте настоящее изобретение относится к совокупности композиций, включающей две или более разных молекул киНК согласно настоящему изобретению (например, киНК, дуплекс, формирующий киНК, или многофункциональная киНК, или их любое сочетание), которые обладают специфичностью для разных полинуклеотидных мишеней, таких как разные участки целевой РНК или ДНК (например, два разных сайта-мишени согласно настоящему изобретению или любое сочетание мишеней или целевых путей), или как кодирующие, так и не кодирующие мишени, где указанное объединение включает молекулы киНК, воздействующие направлено на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более разных мишеней.

В связи с тем, что у разных организмов или разных субъектов имеется определенный потенциал вариабельности генома по последовательности, выбор молекул киНК для широкого спектра терапевтических применений будет вовлекать, в высокой степени, консервативные участки гена. В одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваются молекулы киНК и/или ингибиторы РНКи, которые направленно воздействуют на консервативные участки генома или участки, которые законсервированы применительно к разным мишеням. Молекулы киНК или ингибиторы РНКи разработаны таким образом, что воздействуют направленно на консервативные участки разных мишеней, позволяют достичь эффективного ингибирования экспрессии целевого гена в разных группах пациентов.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, такой как молекула киНК, где одна из цепей включает нуклеотидную последовательность, являющуюся комплементарной заданной нуклеотидной последовательности в целевой молекуле нуклеиновой кислоты или ее части. Заданная нуклеотидная последовательность может представлять собой нуклеотидную целевую последовательность, такую как последовательность, описанная в настоящем тексте или известная в данной области. В другом варианте осуществления настоящего изобретения заданная нуклеотидная последовательность представляет собой целевую последовательность или путь к целевой последовательности, известный в данной области.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии гена-мишени или которая направляет процесс расщепления целевой РНК, где указанная молекула киНК включает от примерно 15 до примерно 28 пар оснований.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК, где указанная молекула киНК включает от примерно 15 до примерно 28 пар оснований.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК (РНКи), где указанная двухцепочечная молекула киНК включает первую цепь и вторую цепь, где каждая из цепей молекулы киНК содержит в длину от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов (например, приблизительно 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28), где первая цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью к целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК, и где вторая цепь указанной молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к первой цепи. В одном конкретном варианте, например, каждая цепь молекулы киНК содержит от примерно 18 до примерно 27 нуклеотидов в длину.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК (РНКи), где указанная двухцепочечная молекула киНК включает первую цепь и вторую цепь, где каждая из цепей молекулы киНК содержит в длину от примерно 18 до примерно 23 нуклеотидов (например, приблизительно 18, 19, 20, 21, 22 или 23), где первая цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью к целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК, и где вторая цепь указанной молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к первой цепи.

В одном варианте настоящее изобретение относится к химически синтезированной двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК (РНКи), где каждая цепь молекулы киНК содержит в длину от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов и где одна цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, облад