Способ конструирования рекомбинантных бактерий, принадлежащих к роду pantoea, и способ продукции l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду pantoea

Способ конструирования рекомбинантных бактерий, принадлежащих к роду pantoea, и способ продукции l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду pantoea

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу конструирования рекомбинантной бактерии, принадлежащей к роду Pantoea, и к способу получения L-аминокислот с использованием этой бактерии.

Описание предшествующего уровня техники

Обычно увеличение активности генных продуктов, участвующих в биосинтезе L-аминокислот или нуклеиновых кислот, является общепринятым способом, используемым для увеличения продукции L-аминокислот или нуклеиновых кислот. Это увеличение часто достигалось путем создания мутантных штаммов, устойчивых к целевым веществам или их аналогам, путем усиления экспрессии генов биосинтеза, путем устранения чувствительности ферментов биосинтеза к ингибированию связи конечными продуктами или промежуточными продуктами биосинтеза по типу обратной, и путем создания бактериальных штаммов, дефицитных по генам, использующим предшественников целевого вещества для других путей, или путем создания бактериальных штаммов, дефицитных по генам, ответственным за деградацию целевого вещества.

Эти манипуляции обычно приводят к получению штаммов, которые неспособны расти, растут только со значительно сниженной скоростью или нуждаются в дополнительных питательных веществах, таких как аминокислоты, для своего роста. Например, усиление экспрессии некоторых генов может стать чрезмерным и может привести к значительному ингибированию роста бактерии и как результат к снижению способности бактерии к продукции целевого вещества.

Одним из подходов, позволяющих избегать вышеописанные трудности, является оптимизация экспрессии генов, которые кодируют белки, участвующие в распределении потоков углерода, азота или фосфора или в выведении целевого продукта из бактериальной клетки.

Было описано получение библиотеки синтетических промоторов различной силы для Lactococcus lactis (Jensen P.R., and Hammer K., Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, No.1. 82-87 Biotechnol. Bioeng., 1998, 58, 2-3, 191-5). Библиотека состоит из 38 химически синтезированных промоторных фрагментов ДНК, которые обладают рандомизированными спейсерами между консенсусными последовательностями в позициях с -35-го по -15-тый нуклеотиды. Для оценки силы полученных промоторов, олигонуклеотиды из библиотеки были клонированы в экспрессирующий вектор рАК80, который содержит β-галактозидазу. Было установлено, что большинство искусственных промоторов очень слабые (менее 500) и только три из них имели силу около 2000 относительных единиц. Однако практическое применение для этой библиотеки синтетических промоторов не было раскрыто.

Способ получения коринеформных бактерий, обладающих улучшенной продуктивностью аминокислот или нуклеиновых кислот, путем введения мутации в последовательность промотора генов биосинтеза аминокислот или нуклеиновых кислот раскрыт в Европейской патентной заявке ЕР 1033407 А1. Для каждого из следующих генов использовали до 8 различных вариантов мутантных промоторов: ген глутаматдегидрогеназы (gdh), ген цитратсинтазы (gltA), ген изоцитратдегидрогеназы (icd), ген пируватдегидрогеназы (pdhA) и ген аргининсукцинатсинтазы (argG). Несостоятельность этой техники, описанная в Европейской патентной заявке ЕР 1033407 А1, заключается в том, что каждый из описанных мутантных штаммов приготавливался отдельно, то есть один за другим. Также увеличение продуктивности L-аминокислоты во всех случаях, раскрытых в этой Европейской патентной заявке, достигался путем увеличения активности определенных ферментов, использующих ограниченное количество различных промоторов для генов, кодирующих эти ферменты. Этот подход является обычным для уровня техники приготовления бактерий-продуцентов аминокислот и бактерий-продуцентов нуклеиновых кислот и не направлен на оптимизацию или тонкую настройку промоторной активности генов, необходимых для продукции L-аминокислот или нуклеиновых кислот.

Способ создания библиотеки искусственных промоторов был раскрыт в заявке PCT WO 03089605. Этот способ включает: а) получение ДНК-кассеты для вставки, которая включает первый сайт рекомбиназы, второй сайт рекомбиназы и селективный маркерный ген, расположенный между этими сайтами; в) получение первого олигонуклеотида, который включает: i) первый фрагмент нуклеиновой кислоты, который гомологичен области, предшествующей по направлению транскрипции интересующему гену на хромосоме (upstream-область), и ii) второй фрагмент нуклеиновой кислоты, который гомологичен 5'-концу вставочной ДНК- кассеты; с) получение второго олигонуклеотида, который включает: i) третий фрагмент нуклеиновой кислоты, гомологичный 3'-концу указанной вставочной ДНК- кассеты, ii) предшественник промотора, который включает консенсусную область из 35-ти нуклеотидов (от -35-ти до -30-ти нуклеотидов), линкерную последовательность, и консенсусную область из 10-ти нуклеотидов (от-12-ти до -7-и нуклеотидов), причем линкерная последовательность включает от 14-х до 20-ти нуклеотидов и фланкируется областью из 35-ти и областью из 10-ти нуклеотидов, причем указанный предшественник промотора модифицирован таким образом, что включает по крайней мере одну измененную нуклеотидную позицию промоторного предшественника, при этом область из 35-ти и 10-ти нуклеотидов каждая включает от 4-х до 6-ти консервативных нуклеотидов промотора, и iii) четвертый фрагмент нуклеиновой кислоты, который гомологичен области, расположенной дальше по отношению к точке инициации транскрипции промотора (downstream-область); и d) смешивания первого и второго олигонуклеотидов в реакции амплификации со вставочной ДНК-кассетой для получения библиотеки двухцепочечных амплифицированных продуктов, содержащих искусственные промоторы.

В качестве способа встраивания фрагментов ДНК в хромосому бактерий семейства Enterobacteriaceae уже известны температуро-чувствительная плазмида или метод Mu-интеграции (Microbiol Res. 2006 Mar 29, J Bacteriol. 1981 Jan; 145(1):358-68).

Однако в настоящее время нет сообщений, описывающих использование Red-зависимой интеграции для встраивания целевых фрагментов ДНК в бактерии, принадлежащие к роду Pantoea. Также в настоящее время нет сообщений, описывающих оптимизацию экспрессии гена для продукции полезного метаболита, например, для продукции L-аминокислоты, путем ферментации бактерии, принадлежащей к роду Pantoea, которая модифицирована таким образом, что в ней оптимизирована экспрессия целевого гена.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление способа конструирования рекомбинантной бактерии, включающего:

a) получение экзогенного фрагмента ДНК, который имеет в своем составе по крайней мере 2 сайта, как минимум по 30 п.о. в длину каждый, идентичных сайтам, расположенным в целевом гене на хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Pantoea,

b) введение указанного линейного фрагмента ДНК в бактерию, принадлежащую к роду Pantoea, причем указанная бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продуктам генов gam, bet и exo из фага лямбда и

c) отбор рекомбинантной бактерии, в которой указанный целевой ген заменен на указанный линейный фрагмент ДНК или линейный фрагмент ДНК встроен в целевой ген.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, при этом указанная бактерия является бактерией Pantoea ananatis SC17(0).

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа конструирования библиотеки фрагментов ДНК в хромосоме бактерии, включающего:

a) введение набора фрагментов ДНК, которые частично идентичны целевому гену на хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Pantoea, в указанную бактерию, причем указанная бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продуктам генов gam, bet и exo фага лямбда и

b) отбор бактерии, в которой указанный целевой ген заменен на указанные фрагменты ДНК.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, причем указанные фрагменты ДНК содержат регуляторный элемент для экспрессии гена, выбранный из группы, состоящей их промотора, терминатора, сайта связывания рибосомы (RBS), оператора и их сочетания.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, причем указанный регуляторный элемент содержит рандомизированную последовательность.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа конструирования бактерии, принадлежащей к роду Pantoea, которая обладает оптимизированным уровнем экспрессии гена, кодирующего белок, участвующий в распределении потоков углерода, азота или фосфора или в выведении целевого вещества из указанной бактерии, включающий:

1) замену природных регуляторных элементов на библиотеку фрагментов ДНК, полученную способом, описанным выше, в хромосоме указанной бактерии и

2) отбор бактерии с указанным оптимизированным уровнем экспрессии указанного гена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, причем указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-аминокислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, причем указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-глицина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина и L-валина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, причем указанная бактерия является бактерией-продуцентом нуклеиновой кислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, причем указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из инозина, гуанозина, ксантозина и аденозина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, принадлежащей к роду Pantoea и полученной способом, описанным выше.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, причем оптимизированный уровень экспрессии гена достигается путем модификации области промотора указанного гена, состоящей из 35-ти пар оснований.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, причем указанным геном является ген yhfK.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, причем область из 35-ти пар оснований выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и их сочетания.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, включающего:

a) выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, и

b) выделение L-аминокислоты из культуральной жидкости. Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, причем указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-глицина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина и L-валина.

Подробное описание наилучшего способа осуществления изобретения

1. Способ согласно настоящему изобретению

Настоящее изобретение предоставляет способ конструирования рекомбинантной бактерии, принадлежащей к роду Pantoea. Конструирование такой рекомбинантной бактерии обычно достигается путем использования бактерии, которая модифицирована таким образом, что обладает устойчивостью к продуктам генов gam, bet и ехо из фага лямбда. Именно в процессе этого конструирования было установлено, что продукты генов gam, bet и ехо фага лямбда системы Red-зависимой интеграции являются токсичными для бактерии рода Pantoea. Эта проблема была решена путем выделения мутантного штамма, который устойчив к продуктам генов gam, bet и exo фага лямбда. Этот полученный мутантный штамм использовали в качестве реципиентного штамма для интеграции фрагментов ДНК с использованием системы Red-интеграции (см. ниже Пример 1).

Настоящее изобретение также предоставляет простой и прямой одноступенчатый способ получения бактерии-продуцента L-аминокислоты или бактерии-продуцента нуклеиновой кислоты, которая обладает оптимизированным уровнем экспрессии гена, участвующего в метаболизме и биосинтезе целевого вещества или в выведении целевого вещества из указанной бактерии, и, соответственно, влияет на продукцию L-аминокислоты и нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение также предоставляет бактерию-продуцент L-аминокислоты с оптимизированным уровнем экспрессии гена, который участвует в метаболизме и биосинтезе целевого вещества или в процессе выведения целевого вещества из указанной бактерии, а также предоставляет способ инактивации целевого гена на хромосоме, который не включен в открытые рамки считывания (ORF), генов или аллелей, которые необходимы для роста бактерий и продукции L-аминокислоты, продукции нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение также предоставляет способ получения L-аминокислот, таких как L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-цистеин, L-глутаминовая кислота, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин; и способ получения нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение было осуществлено благодаря использованию штамма, который был модифицирован таким образом, что является устойчивым к продукту генов gam, bet и ехо из фага лямбда (здесь и далее обозначаемые как "λ-Red-гены") в качестве штамма-реципиента фрагментов ДНК.

Штамм, который модифицирован таким образом, что является устойчивым к продукту λ-Red-генов (здесь и далее обозначаемый как λ-Red-устойчивый штамм), может быть получен следующим способом. Для получения λ-Red-устойчивого штамма, клетки штамма Р. ananatis SC17 (патент США 6596517) были электропорированы плазмидой, несущей λ-Red-гены. После культивирования в течение 18-ти часов было получено приблизительно 10⁵-10⁶ трансформантов, среди которых около 10-ти клонов имели большой размер, тогда как другие клоны были очень маленькими. После 18-ти часов культивирования большие клоны были приблизительно 2 мм в диаметре, маленькие колонии были приблизительно 0,2 мм в диаметре. В течение пролонгированного культивирования (до 24 часов), маленькие колонии больше не росли, тогда как большие продолжали расти. Штаммы P. ananatis с таким большим размером колонии являются устойчивыми к экспрессии всех трех Red-генов из фага лямбда (gam, bet и ехо). Предпочтительным для настоящего изобретения λ-Red-устойчивым штаммом является штамм Pantoea ananatis SC17(0) (VKPM B-9246).

λ-Red-устойчивый штамм может быть использован во многих разных методиках для генетической рекомбинации целевого гена, например, для инактивации гена, для интеграции гена.

Для получения рекомбинантного штамма могут быть выполнены следующие стадии:

a) приготовление экзогенного линейного фрагмента ДНК, содержащего по крайней мере 2 сайта длиной минимум по 30 п.о. каждый, идентичных сайтам, расположенным в целевом гене на хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Pantoea,

b) введение указанного линейного фрагмента ДНК в бактерию, принадлежащую к роду Pantoea, причем указанная бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продуктам генов gam, bet и ехо из фага лямбда, и

c) отбор рекомбинантной бактерии, в которой указанный целевой ген заменен на указанный линейный фрагмент ДНК или линейный фрагмент ДНК встроен в целевой ген.

Термин «целевой ген» означает локус на хромосоме указанного λ-Red-устойчивого штамма бактерии рода Pantoea, который должен быть модифицирован. Источником чужеродного фрагмента ДНК может быть организм, другой, чем λ-Red-устойчивый штамм, или это может быть λ-Red-устойчивый штамм.

Термин «рекомбинантная бактерия» означает бактерию рода Pantoea, в ген которой встраивается интегративная кассета или часть гена которой заменяется на интегративную кассету.

Термин «рекомбинантная бактерия» означает бактерию рода Pantoea, в которой указанный линейный фрагмент ДНК встроен в целевой ген на хромосоме или заменяет некоторую часть целевого гена.

Фрагмент ДНК согласно настоящему изобретению означает фрагмент ДНК, обладающий свободным 5'-концом и 3'-концом и означает, что он не является кольцевой ДНК. Линейный фрагмент ДНК, который является частично идентичным целевой области, может быть получен путем клонирования линейного фрагмента ДНК на хромосоме бактерии рода Pantoea или другой бактерии семейства Enterobacteriaceae. Линейный фрагмент ДНК может быть, к примеру, один раз клонирован в плазмиду из ДНК хромосомы для получения рекомбинантной плазмиды и затем извлечен из рекомбинантной плазмиды с помощью рестриктаз, или он может быть получен путем прямого амплифицирования целевого гена из геномной молекулы ДНК методом ПЦР.

Ген для встраивания может быть слитым геном, состоящим из двух или больше генов или из комплекса генов, содержащего два или более генов.

Для того чтобы отобрать необходимую рекомбинантную бактерию, в линейный фрагмент ДНК могут быть включены генетические маркеры для позитивной (например, гены устойчивости к антибиотикам) или для негативной (например, ген sacB) селекции. Согласно методу red-управляемой интеграции, интегрированный ген устойчивости к антибиотику может быть удален путем введения сайтов attL и attR, которые являются сайтами прикрепления фага лямбда и продукта ПЦР, и путем комбинирования системы вырезания, происходящей из фага лямбда с методом red-управляемой интеграции. Для удаления селективного маркера, в частности, может быть использована система int-xis (заявка РСТ WO 05/010175).

Для встраивания линейного фрагмента ДНК, содержащего необходимый ген, может быть использован ген, который участвует в метаболизме и биосинтезе целевого вещества или в процессе выведения целевого вещества из бактерии рода Pantoea. Примеры таких генов включают, но не ограничиваются только ими, гены гликолиза или ассимиляции азота, гены пентозного цикла, гены цикла Кребса и так далее. Более точно, примеры включают, но не ограничиваются только глутаматдегидрогеназой, глутаматсинтазой, глутаматсинтетазой, изоцитратдегидрогеназой, аконитатгидратазой, цитратсинтазой, фософенолпируваткарбоксилазой, пируватдегидрогеназой, пируваткиназой, фосфоенолпируватсинтазой, енолазой, фосфоглицеромутазой, фосфоглицераткиназой, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой, триозофосфатизомеразой, фруктозобифосфатальдолазой, фосфофруктокиназой, глюкозофосфатизомеразой, глутамин-оксоглутаратаминотрансферазой, изопропилмалатсинтазой и так далее. Бактериальные гены, включенные в биосинтез L-аминокислот, нуклеиновых кислот и их предшественников, могут также быть использованы. Фраза «ген, кодирующий белок, участвующий в выведении целевого вещества из бактерии» означает ген, кодирующий мембранный белок, который непосредственно экскретирует целевое вещество из бактериальной клетки, или ген, кодирующий белок, который активирует мембранный белок, который экскретирует целевое вещество.

Этот основной подход был использован для точной настройки экспрессии гена yfhK в штамме Pantoea ananatis для увеличения уровня продукции L-глутаминовой кислоты. Достигнутая оптимизация, скорее, чем максимизация экспрессии гена или оперона, является актуальной проблемой при конструировании различных бактериальных штаммов, способных продуцировать биологически активные метаболиты, особенно в случаях, когда низкие уровни экспрессии целевого гена являются недостаточными для достижения конечной цели. С другой стороны, сверхэкспрессия целевого гена может привести не только к нейтральному, но и к негативному действию. Кроме того, желаемый уровень этого ключевого гена остается неизвестным. Тонкая настройка является крайне желательной для обеспечения оптимизации и поэтому должно быть протестировано огромное количество вариантов. Обычный подход для проведения этого рода тонкой настройки включает молекулярное клонирование целевого гена в рекомбинантных плазмидах и размещение их под контролем различных промоторов, с последующей оценкой полученных рекомбинантных штаммов. После отбора лучших вариантов необходимо провести большую дополнительную работу, если желателен улучшенный штамм-продуцент.

Способ согласно настоящему изобретению включает конструирование библиотеки фрагментов ДНК в хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Pantoea, путем встраивания в хромосому указанной бактерии набора фрагментов ДНК, синтезированных in vitro, причем мутантная бактерия принадлежит к роду Pantoea и является устойчивой к продуктам генов gam, bet и ехо фага лямбда, и используется в качестве бактерии-реципиента. Предпочтительной мутантной бактерией, используемой в данном методе, является бактерия Pantoea ananatis SC17(0). Точнее, способ согласно настоящему изобретению включает конструирование библиотеки ДНК-фрагментов, которая содержит один или более регуляторных элементов для экспрессии гена, включая промоторы, сайты связывания рибосом (RBS) и операторы. Более точно, способ согласно настоящему изобретению включает конструирование библиотеки ДНК-фрагментов, которые содержат один или более регуляторных элементов, которые включают рандомизированную последовательность.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Некоторые штаммы Enterobacter agglomerans были недавно переклассифицированы в Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA, и т.д.

Фраза «набор фрагментов ДНК» означает смесь заново синтезированных фрагментов ДНК или смесь известных фрагментов ДНК, полученных из природных или мутированных микроорганизмов, библиотеки ДНК, GenBank и т.д. Набор ДНК-фрагментов может быть образован путем непосредственного смешивания заново синтезированных фрагментов ДНК с известными последовательностями, фрагментов ДНК, полученных из различных источников, указанных выше, или фрагментов ДНК, полученных путем химического синтеза, фрагментов ДНК, которые имеют область, содержащую рандомизированную последовательность.

Фраза «бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продукту гена» означает, что бактерия модифицирована таким образом, что способна расти и образовывать колонии в среде, в условиях, когда ген в бактерии экспрессируется.

Фраза «регуляторные элементы» обозначает нуклеотидные последовательности, расположенные перед, внутри и/или после кодирующей области, которые контролируют транскрипцию и/или экспрессию кодирующей области вместе с аппаратом биосинтеза белка. Эта фраза обычно используется при описании промоторов, сайтов связывания рибосом (RBS), операторов или других элементов генома и тех, которые влияют на уровень экспрессии генов.

Фраза «рандомизированная последовательность» означает, что в процессе обычного химического синтеза фрагмента ДНК, случайные нуклеотиды (обычно обозначаемые как N, где N - это аденин, гуанин, цитозин или тимин) встраиваются в определенные позиции фрагмента ДНК или в некоторую область фрагмента ДНК, имеющего случайные нуклеотидные последовательности, соответственно. Фрагменты ДНК содержат последовательности, названные «регуляторные элементы».

Способ согласно настоящему изобретению также включает получение бактерии-продуцента L-аминокислоты с оптимизированным уровнем экспрессии целевого гена, который кодирует белок, участвующий в метаболизме и биосинтезе целевого вещества, или в выведении целевого вещества из указанной бактерии и, как результат, влияет на продукцию L-аминокислоты. Способ согласно настоящему изобретению подразделяется на следующие этапы:

1) введение библиотеки искусственно созданных фрагментов ДНК, которые содержат регуляторные элементы для экспрессии указанного целевого гена, в хромосому указанной бактерии вместо природных регуляторных элементов указанного целевого гена, и

2) отбор бактерии с желаемым фенотипом.

Термин «экспрессия» в том значении, в котором он используется здесь, означает продукцию белкового продукта, кодируемого геном.

Фраза «оптимизированный уровень экспрессии» означает такую экспрессию целевого гена или нескольких генов, следствием которой является бактерия с желаемым фенотипом.

Фраза «желаемый фенотип» включает одну или более характеристик бактерии, которые являются объектами для улучшения. Предпочтительно, это может быть способность бактерии к продукции L-аминокислоты в большем количестве, чем родительский штамм; это может также быть способность расти на минимальной среде, которая не содержит добавок, которые обычно используются для комплементации ауксотрофности или другие необходимые для роста факторы или их сочетание.

Фраза «ген, кодирующий белок, участвующий в метаболизме или биосинтезе целевого вещества» означает ген, кодирующий белок, который вовлечен в метаболические пути углерода, азота или фосфора. Примеры таких генов включают, но не ограничиваются только ими, гены гликолиза или ассимиляции азота, гены пентозного цикла, гены цикла Кребса и т.д. Более точно, примеры включают, но не ограничиваются только глутаматдегидрогеназой, глутаминсинтетазой, глутаматсинтазой, изоцитратдегидрогеназой, аконитатгидратазой, ситратсинтазой, фосфоенолпируваткарбоксилазой, пируватдегидрогеназой, пируваткиназой, фосфоенолпируватсинтазой, енолазой, фосфоглицеромутазой, фосфоглицераткиназой, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой, триозофосфатизомеразой, фруктозобифосфатальдолазой, фосфофруктокиназой, глюкозофосфатизомеразой, глутамин-оксоглутаратаминотрансферазой, изопропилмалатсинтазой и т.д. Бактериальные гены, участвующие в биосинтезе L-аминокислот, нуклеиновых кислот и их предшественников могут также быть включены.

Фраза «ген, кодирующий белок, участвующий в выведении целевого вещества из бактерии» означает ген, кодирующий мембранный белок, который непосредственно выводит целевое вещество из бактериальной клетки, или ген, кодирующий белок, который активирует мембранный белок, который выводит целевое вещество.

Смесь фрагментов ДНК, содержащих регуляторные элементы, встраивается в хромосому бактерии вместо природного регуляторного элемента, приводя к возникновению популяции бактериальных клеток с различными уровнями экспрессии интересующих генов. Отбор бактерии с желаемым фенотипом может быть осуществлен путем прямой оценки количества наработанной L-аминокислоты в стандартной минимальной среде или другими методами, пригодными для установления характеристик, необходимых для желаемого фенотипа.

Термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» в том значении, в котором он используется здесь, означает бактерию, которая способна к продукции целевой L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в больших количествах, по сравнению с природным или родительским штаммом, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно, не менее чем 1.0 г/л.

Определение уровня ферментативной активности и отбор регуляторных элементов последовательностей, оптимальных для определенных условий, требует от специалиста глубоких знаний в данной области техники; отбор регуляторных элементов последовательностей, основанный на научном предположении или интуиции, может не привести к желаемому или оптимальному результату. Кроме того, приготовление даже ограниченного количества мутантов с различными уровнями ферментативной активности является трудоемким и требует больших затрат времени, так как такие мутанты обычно приготавливаются один за другим. Однако способ согласно настоящему изобретению преимущественно предлагает простую и прямую одноступенчатую процедуру интеграции природного или искусственного фрагмента ДНК в хромосому, генерирующую популяцию бактериальных клеток с широким спектром уровней экспрессии целевого гена. К примеру, рандомизация четырех нуклеотидов в определенной области химически синтезированного регуляторного элемента обеспечивает 4⁴, или 256 теоретически возможных вариантов этой области.

Кроме того, обычным является увеличение активности целевого фермента путем встраивания копии гена, кодирующего фермент, в плазмиду бактерии.

Однако уровень экспрессии гена, интегрированного в хромосому бактерии, и уровень экспрессии того же гена, встроенного в плазмиду, заселяющую бактерию, может быть не одним и тем же. Поэтому другим преимуществом метода, согласно настоящему изобретению, является то, что метод позволяет оценить и отобрать бактерию в условиях, оптимальных для экспрессии интересующего гена, с последующим прямым использованием бактерии для продукции L-аминокислоты без дополнительных манипуляций.

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобными им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области, Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть бактерией-продуцентом L-аминокислоты и нуклеиновой кислоты с оптимальным уровнем экспрессии гена, который кодирует белок, участвующий или в распределении углерода, азота и фосфора, или в выведении целевого вещества из указанной бактерии, при этом оптимизация экспрессии приводит к увеличенной продукции L-аминокислоты. Такая бактерия может быть получена методом согласно настоящему изобретению.

Более точно, бактерия согласно настоящему изобретению продуцирует L-аминокислоту, такую как L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-цистеин, L-глутаминовая кислота, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин. Также бактерия согласно настоящему изобретению включает бактерию-продуцент L-глутаминовой кислоты, имеющую оптимизированный уровень экспрессии гена, который влияет на продукцию L-глутаминовой кислоты. Кроме того, L-глутаминовая кислота играет значительную роль в биосинтезе L-лейцина, L-лизина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-аспартата, L-аланина, L-тирозина и L-фенилаланина в качестве донора аминогруппы. И бактерия согласно настоящему изобретению является бактерией-продуцентом L-лейцина с оптимизированным уровнем экспрессии гена, который влияет на продукцию L-лейцина.

Поэтому улучшенное снабжение азотом для гена, кодирующего аминотрансферазу, является полезным для продукции других аминокислот, таких как L-лейцин, L-лизин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-аспартат, L-аланин, L-тирозин и L-фенилаланин.

Примеры бактерий-продуцентов L-глутаминовой кислоты включают мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые дефицитны по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, и могут быть получены как описано выше. Такие штаммы включают штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6331419). Штамм Pantoea ananatis AJ13356 был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan, 19 февраля 1998 и получивший инвентарный номер FERM P-16645). Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM ВР-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 не имеет α-KGDH активности в результате инактивации гена αKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13356. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S pPHK и других доказательств. Несмотря на то что штамм АJ13356, был депонирован в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания он будет упоминаться как Pantoea ananatis.

Стратегия, описанная выше для получения L-глутаминовой кислоты, может быть использована для получения бактерии, продуцирующей другие L-аминокислоты.

Бактерия согласно настоящему изобретению является бактерией-продуцентом нуклеиновой кислоты, обладающей оптимизированным уровнем экспрессии гена, кодирующей белок, участвующий в распределении потоков углерода, азота или фосфора, или в выведении целевого вещества из указанной бактерии, которое приводит к увеличению продукции нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота выбирается из группы, состоящей из инозина, ксантозина, гуанозина и аденозина. Такая бактерия может быть получена способом согласно настоящему изобретению.

2. Способ получения L-аминокислоты

Способом получения L-аминокислоты является способ, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в культуральной жидкости и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости. Более точно, способ получения L-аминокислоты включает способ получения L-глутаминовой кислоты, который включает этапы выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-глутаминовой кислоты в культуральной жидкости и выделения и очистки L-глутаминовой кислоты из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им соединения.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, например при перемешивании культуральной жидкости на качалке, взбалтывании с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30°С до 38°С. pH среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. pH среды можно доводить аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1-го до 5-ти дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирован