Растения огурца, устойчивые к заболеваниям

Растения огурца, устойчивые к заболеваниям

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области растений, устойчивых к заболеваниям, и к разведению растений, более подробно, к разведению растений огурца, устойчивых к мучнистой росе и к клостеровирусу.

Уровень техники изобретения

Коммерческое производство огурцов (Cucumis sativus) может нести убытки из-за ряда их заболеваний. Вирусы желтухи вызывают одно из таких заболеваний и могут быть причиной значительного экономического ущерба выращивания огурцов. Семейство клостеровирусов (Closteroviridae), которое образует самую высокую таксонометрическую группу вирусов желтухи, поражающих огурец, включает более 30 извитых и нитевидных вирусов растений, переносимых насекомыми. Семейство состоит из трех родов, из которых род Crinivirus, переносимый белокрылкой, включает виды, к которым особенно чувствительны огурцы. Данный род включает, среди прочих, виды вируса болезни желтой задержки роста огурца (CYSDV), вируса инфекционной желтухи салата (LIYV), вируса псевдожелтухи свеклы (BPYV). Наибольшую угрозу для производителей огурцов представляют CYSDV и BPYV. Вирусы обычно находятся в насекомом-переносчике инфекции и переносятся на растение путем питательной активности насекомых.

Следовательно, клостеровирус огурцов можно контролировать посредством применения инсектицидов. Однако, предпочтительно, контроль клостеровируса в агрокультуре и овощеводстве достигается благодаря получению устойчивых к вирусу культиваров растений-хозяев. В настоящее время по меньшей мере два локуса количественных признаков, или QTL, в геноме устойчивых вариантов огурца распознаются как связанные с устойчивостью к клостеровирусу (см. WO 02/22836). Соответствующая интрогрессия генетического материала, связанного с устойчивостью к клостеровирусу, в линиях растений-потомков может отслеживаться путем обнаружения специфических маркеров, связанных с такими QTL. Следовательно, знание о QTL может иметь значение для разведения культиваров, устойчивых к клостеровирусам.

Другим важным заболеванием, которое отрицательно влияет на коммерческое производство огурцов, является мучнистая роса огурцов (PM). РМ огурцов может быть вызвана грибами S.fuliginea и E.cichoracearum. Заболевание является широко распространенным и может встречаться круглогодично. Симптомы начинаются с маленьких пятен тонкой белой грибковой нити на поверхности инфицированных листьев, которые затем могут увеличиваться и в конечном счете покрывать стебли и листву белой мучнистой массой спор и гиф. Тяжелая инфекция приводит к обесцвечиванию и потере листьев и сопутствующему уменьшению числа и размера плодов. Хотя ряд фунгицидов является эффективным против мучнистой плесени, обнаруживается устойчивость гриба против химикатов.

У различных штаммов огурцов был показан некоторый уровень устойчивости к мучнистой росе. Такие штаммы включают, например, образец PI 197088 дикого индийского огурца и образцы PI 200815, PI 200818, так же, как и культивары Natsufushinari и Asomidori (Morishita и др., 2003). Также известны другие гены, связанные с устойчивостью к РМ (Fanourakis, 1984; Fujieda и Akiya, 1962; Kooistra, 1968, 1971; Shanmugasundarum и др., 1971, 1972), включая pm-1 и pm-2 в Natsufushinari, pm-3 в PI 200815 и PI 200818 и "pm-h" в культигене Wis. SMR 18 (ген "pm-h" является без ограничения к локусу pm выявляемым pm-h далее в настоящем документе). Хотя доступны несколько коммерческих сортов огурцов с частичной устойчивостью к РМ, большинство коммерческих производителей до сих пор полагаются на лиственные фунгициды. Частично это связано с тем фактом, что устойчивость к РМ сложно привнести в линии, у которых показаны другие типы устойчивости. Например, селекционеры столкнулись с таким недостатком, как чувствительность к клостеровирусу, и наоборот, у линий, имеющих устойчивые к РМ аллели, хотя прежде они не были чувствительны. Фактически эксперименты по скрещиванию пока не дали линий огурцов, у которых показана устойчивость как к РМ, так и к клостеровирусу. На сегодняшний день эффективные рекомбинанты с двойной устойчивостью не получены. Это удивительно, поскольку объединение различных признаков в один геном может быть достигнуто относительно простыми селекционными процедурами.

Целью настоящего изобретения является получение растений огурца, у которых показана устойчивость к вирусам семейства клостеровирусов, которые поражают огурец, в частности BPYV и CYSDV, и растение у которого, кроме того, показана устойчивость к мучнистой росе огурца, вызываемой грибами S.fuliginea и/или E.cichoracearum.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторами настоящего изобретения был обнаружен ряд растений огурца, у которых показана устойчивость как к CYSDV, так и к РМ. Кроме того, ими было обнаружено, что указанные растения огурца с двойной устойчивостью включают два локуса количественных признаков (QTL), связанных с устойчивостью к мучнистой росе (обнаруженные в настоящем документе как pm-l и pm-h), и один большой QTL, связанный с устойчивостью к клостеровирусу (обозначенный в настоящем документе как QTL-1). Наиболее важно, что авторы изобретения обнаружили, что все QTL локализованы в одной генетической группе сцепления. Таким образом, авторы настоящего изобретения преимущественно обнаружили, что в данных растениях гены устойчивости к клостеровирусу и мучнистой росе находятся на одной хромосоме. Такие растения являются крайне эффективными для селекции растений.

Кроме того, авторы изобретения обнаружили возможный механизм, в отсутствие которого не могли быть получены растения огурца с двойной устойчивостью (с помощью экспериментов по скрещиванию). Не привязываясь к какой-либо теории, полагают, что интрогрессия генетического элемента, незаменимого для устойчивости к одному заболеванию, приводила к потере генетического элемента, важного для устойчивости к другому заболеванию. Благодаря данному открытию авторы изобретения разработали схемы селекции, с помощью которых можно решить данную проблему, получая при этом требуемые растения с двойной устойчивостью.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к растению вида Cucumis sativus, растению, у которого показана устойчивость к клостеровирусам огурцов, а также устойчивость к мучнистой росе огурцов.

В предпочтительном варианте осуществления такого растения по изобретению геномный(ые) регион(ы), ответственный(ые) за устойчивость к клостеровирусу (QTL-1), и геномный(ые) регион(ы), ответственный(ые) за устойчивость к мучнистой росе огурцов (pm-h и/или pm-l), находятся на одной хромосоме. В еще более предпочтительном варианте осуществления такого растения присутствуют оба pm-h и pm-l, а QTL-1 расположен между pm-h и pm-l.

В другом варианте осуществления растения по изобретению присутствие QTL-1 выявляют на наличие по меньшей мере одного фланкирующего маркера, выбранного из группы, состоящей из маркеров E16/M50-244, E16/M50-188, и E11/M48-251, как описано более подробно в документе WO 02/22836, ссылка на который приводится в данном контексте.

В другом варианте осуществления растения по изобретению присутствие QTL, обозначенного pm-h, выявляют по наличию последовательности нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере одну мутацию, происходящую в результате однонуклеотидного полиморфизма (SNP), связанного с устойчивостью к мучнистой росе в указанном растении, где указанный по меньшей мере один однонуклеотидный полиморфизм (SNP) выбран из SNP1 и SNP2, как показано в таблице 2 далее.

В другом варианте осуществления растения по изобретению присутствие QTL, обозначенного pm-h, выявляют по наличию последовательности нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере одну мутацию, происходящую в результате однонуклеотидного полиморфизма (SNP), обозначаемого как SNP 3 в таблице 3 далее, связанного с устойчивостью к мучнистой росе в указанном растении или включающего по меньшей мере одну мутацию, обозначаемую как 5-bp, вставка 5'-AATTT-3' в таблице 3 далее, связанную с устойчивостью к мучнистой росе в указанном растении.

Таким образом, изобретение предпочтительно относится к растению, которое устойчиво к клостеровирусу огурца и мучнистой росе огурца, где указанное растение представляет собой растение вида Cucumis sativus, причем указанное растение содержит на одной хромосоме по меньшей мере один хромосомальный регион, который придает устойчивость к клостеровирусу и по меньшей мере один хромосомальный регион, который придает устойчивость к мучнистой росе, где указанный по меньшей мере один регион, который придает устойчивость к клостеровирусу, связан по меньшей мере с одним маркером, выбранным из группы, состоящей из маркеров E16/M50-244, E16/M50-188 и E11/M48-251, и

где указанный по меньшей мере один хромосомальный регион, который придает устойчивость к мучнистой росе, связан с по меньшей мере одним маркером, выбранным из группы, состоящей из:

маркера однонуклеотидного полиморфизма 39T→G в SEQ ID NO:1,

маркера однонуклеотидного полиморфизма 29G→A в SEQ ID NO:2,

маркера однонуклеотидного полиморфизма 193C→T в SEQ ID NO:3,

мутации вставки 5'-AATTT-3' в позиции 221 в SEQ ID NO:4 и

маркеров E16/M50-F-194, E11/M48-F-251, E23/M38-M001, E23/M40-M003, E24/M46-M002, E24/M46-M003, E12/M91-M003, E26/M43-M003, E14/M59-F-134 и E14/M59-F-200.

Растение по изобретению может по желанию содержать второй QTL, связанный с устойчивостью к клостеровирусу (QTL-2, описанный в WO 02/22836, ссылка в настоящем описании дана для более подробной информации о локализации и характеристиках данного QTL). Показано, что QTL расположен на отдельной хромосоме.

В другом аспекте изобретение относится к части растения огурца по изобретению, как описано выше. Предпочтительно, указанная часть растения выбрана из пыльцы, семязачатков, листьев, корней, кончиков корней, пыльников, цветов, плодов, стеблей, отростков, прививочных черенков, корневых побегов, семян, протопластов и каллий, и наиболее предпочтительно, из семени.

В другом аспекте изобретение относится к семени F1, полученному путем скрещивания растения огурца по изобретению с двойной устойчивостью (устойчивость к клостеровирусу плюс устойчивость к РМ [включая РМ-лист (pm-l) и РМ-гипокотиль (pm-h) устойчивый фенотип]), как описано ранее, со вторым растением огурца или другим видом растения, предпочтительно, из ряда огурцов, которое включает желаемые с коммерческой точки зрения характеристики. Предпочтительно, указанное второе растение огурца включает по меньшей мере pm-h в виде рецессивного гена. Указанное второе растение огурца представляет собой в данном случае по меньшей мере гетерозиготу, предпочтительно, гомозиготу по рецессивному pm-h признаку. В другом предпочтительном варианте осуществления указанное второе растение огурца является чувствительным к клостеровирусу и, более предпочтительно, является инбредным растением.

В другом аспекте изобретение относится к гибридному растению, полученному путем выращивания семени F1 по изобретению, как описано ранее.

В другом аспекте изобретение относится к части гибридного растения по изобретению, как описано ранее. Предпочтительно, указанная часть растения выбрана из пыльцы, семязачатков, листьев, корней, кончиков корней, пыльников, цветов, плодов, стеблей, отростков, прививочных черенков, корневых побегов, семян, протопластов и каллий и, предпочтительно, указанная часть растения представляет собой плоды.

Как указано выше, интрогрессия генетического элемента, незаменимого для устойчивости к РМ или к клостеровирусу, путем скрещивания растений, каждое из которых устойчиво только к одному заболеванию, как считают, приводит к потере генетического элемента, незаменимого для устойчивости к другому заболеванию. С помощью настоящего открытия авторы изобретения разработали схемы селекции, с помощью которых данная проблема может быть решена с получением при этом требуемых растений с двойной устойчивостью. Авторы настоящего изобретения раскрыли, что для эффективного создания растения огурца с двойной устойчивостью из гибрида между растением родительской линии огурца, устойчивой к клостеровирусу, где указанная устойчивость обусловлена QTL-1, и растением линии огурца, устойчивой к РМ, где указанная устойчивость обусловлена pm-h и pm-l, процесс скрещивания должен включать стадию разрешения образования рекомбинантов (т.е. допускать осуществление актов гомологичной рекомбинации в одной хромосоме) с последующей стадией отбора растений, имеющих QTL-1 и pm-l или QTL-1 и pm-h в одной хромосоме. Предпочтительно, указанная стадия отбора включает отбор растений, имеющих QTL-1 и pm-l и pm-h в одной хромосоме. Еще более предпочтительно, QTL-1 вводят в геномный регион между регионами, содержащими pm-h и pm-l, так что фактически QTL-1 для клостеровируса размещен между двумя QTL устойчивости к РМ.

Присутствие любого QTL, описанного в настоящем документе, связанного с устойчивостью к РМ или к клостеровирусу, может быть выявлено путем обнаружения одного или нескольких генетических маркеров, связанных с соответствующим QTL на хромосоме растения, генетических маркеров нарушения равновесия связи с соответствующим QTL на хромосоме растения или их комбинации.

Подходящий способ выявления присутствия и/или расположения указанных QTL в указанных растениях включает применение AFLP маркеров, характеризующих указанные QTL. Предпочтительно, указанная стадия отбора растений, имеющих QTL-1 и pm-l и pm-h в одной хромосоме, включает обнаружение по меньшей мере одного AFLP маркера, характеризующего локус количественного признака QTL-1, связанный с устойчивостью к клостеровирусу на той же хромосоме, которая содержит локус количественного признака (QTL) для pm-l или, альтернативно, на той же хромосоме, которая содержит локус количественного признака (QTL) для pm-h, связанного с устойчивостью к РМ, предпочтительно, на той же хромосоме, которая содержит локусы количественных признаков pm-h и pm-l, и в этом случае указанный маркер QTL-1 расположен в хромосомальном регионе между QTL pm-h и QTL pm-l. Таким образам, процесс отбора может включать обнаружение одного или нескольких маркеров, выбранных из группы маркеров, состоящих из маркеров таблицы 2, 3 и 4.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу отбора растения вида Cucumis sativus, у которого показана устойчивость к клостеровирусу огурцов и к мучнистой росе огурцов, включающий обнаружение в указанном растении присутствия на одной хромосоме QTL-1 и по меньшей мере одного из QTL pm-l и pm-h.

В одном из вариантов осуществления данного способа способ включает стадии:

а) предоставления образца геномной ДНК из растения огурца, указанный образец содержит фрагменты геномной ДНК достаточной длины;

b) проведение реакции очистки для отбора фрагментов, которые содержат по меньшей мере первый QTL или молекулярный маркер, связанный с этим, из группы, состоящей из QTL-1, pm-l и pm-h;

с) выполнение реакции амплификации нкулеиновых кислот на указанных выбранных фрагментах для обнаружения фрагментов, которые включают по меньшей мере второй QTL или молекулярный маркер, связанный с этим, из группы, состоящей из QTL-1, pm-l и pm-h, и

d) обнаружение в продукте реакции стадии с) амплифицированного фрагмента ДНК, имеющего прогнозированную длину или прогнозированную последовательностью нуклеиновой кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления указанная стадия b) включает применение по меньшей мере одного набора праймеров для определения молекулярного маркера для указанного первого QTL или применение по меньшей мере одного зонда для нуклеиновой кислоты с основной последовательностью, которая, по существу, комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, определяющей указанный маркер, и зонда для нуклеиновой кислоты, который специфически гибридизуется в жестких условиях гибридизации с последовательностью нуклеиновых кислот, определяющей указанный маркер(ы).

В другом предпочтительном варианте осуществления указанная стадия с) включает применение по меньшей мере одного набора праймеров для определения указанного второго QTL или применение по меньшей мере одного набора праймеров, которые специфически гибридизируются в жестких условиях с последовательностью нуклеиновых кислот молекулярного маркера указанного второго QTL.

В другом варианте осуществления способ по изобретению имеет стадию обнаружения в указанном растении присутствия указанных QTL на одной хромосоме осуществляют с применением техник гибридизации in situ или техник амплификации in situ. В свою очередь, в данных способах подходящим образом используют зонды и праймеры для определения молекулярного маркера для указанных QTL или те, которые специфически гибридизируются в жестких условиях с последовательностью нуклеиновых кислот молекулярного маркера для указанной QTL.

В аспектах изобретения молекулярные маркеры представляют собой, предпочтительно, SNP, маркеры мутации вставки или маркеры AFLP, более предпочтительно, маркеры, выбранные из группы, состоящей из маркеров, перечисленных в таблицах 2-4, и маркеры из ссылок литературы, специально приводимых в настоящем документе.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения растения вида Cucumis sativus, у растения которого показана устойчивость к клостеровирусу огурцов и к мучнистой росе огурцов, включающему стадии:

а) отбора первого растения огурца, которое включает хромосомальный регион, который придает устойчивость к клостеровирусу огурца, путем обнаружения в геноме указанного растения присутствия по меньшей мере одного маркера, связанного с QTL, придающим устойчивость к клостеровирусу огурцов, показанным маркерами E16/M50-244, E16/M50-188 и E11/M48-251;

b) отбора второго растения огурца, которое включает по меньшей мере один хромосомальный регион, который придает устойчивость к мучнистой росе, путем обнаружения в геноме указанного растения присутствия по меньшей мере одного маркера, связанного с первым QTL, придающим устойчивость к мучнистой росе, показанным следующими маркерами:

- маркер однонуклеотидного полиморфизма 39T→G в SEQ ID NO:1,

- маркер однонуклеотидного полиморфизма 29G→A в SEQ ID NO:2 и

- маркеры E16/M50-F-194, E11/M48-F-251, E23/M38-M001; или

путем обнаружения в геноме указанного растения присутствия по меньшей мере одного маркера, связанного со вторым QTL, придающим устойчивость к мучнистой росе, показанным следующими маркерами:

- маркер однонуклеотидного полиморфизма 193C→T в SEQ ID NO:3,

- мутация вставки 5'-AATTT-3' в позиции 221 в SEQ ID NO:4 и

- маркеры E23/M40-M003, E24/M46-M002, E24/M46-M003, E12/M91-M003, E26/M43-M003, E14/M59-F-134 и E14/M59-F-200;

с) скрещивания указанных растений из стадии а) и стадии b) для получения F1 семян;

d) выращивания некоторого количества семян F1 в растения F1, создание следующей популяции потомков из указанных растений F1 путем скрещивания или самоопыления и

e) отбора из числа следующих растений-потомков растения, которое включает по меньшей мере один маркер, связанный с QTL, придающим устойчивость к клостеровирусу огурца, как определено на стадии а), и по меньшей мере один маркер, связанный с QTL, придающим устойчивость к мучнистой росе огурца, как определено на стадии b).

Специалисту в данной области понятно, что указанная следующая популяция потомков должна быть достаточного размера, который позволяет обнаружить присутствие растений в указанной следующей популяции потомков, которые перенесли по меньшей мере два акта гомологичной рекомбинации на одной хромосоме. В целом, популяция из примерно 1000 растений должна быть достаточной. Преимуществом техники селекции с предлагаемым маркером является то, что в популяции таких размеров можно легко провести отбор на присутствие интересующих генотипов, которые могут не выявляться фенотипически.

В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению стадия отбора второго растения огурца на стадии b) включает отбор второго растения огурца, имеющего только один из указанных, первый или второй, QTL, придающий устойчивость к мучнистой росе огурца, и где указанный способ дополнительно включает стадию:

f) отбора третьего растения огурца, имеющего другой, чем указанные первый или второй, QTL, придающие устойчивость к мучнистой росе огурца (т.е. QTL, который не представлен в указанном втором растении огурца);

g) скрещивания растений F1, полученных на стадии е), с указанным третьим растением огурца для получения последующих растений-потомков и

h) отбора из числа растений-потомков растения, которое включает QTL, придающий устойчивость к клостеровирусу огурца, как определено на стадии а), и оба QTL, придающие устойчивость к мучнистой росе огурца, как определено на стадии b).

В предпочтительном варианте осуществления выбирают растения, которые включают оба локуса pm-h и pm-l, придающих устойчивость к мучнистой росе, и в которых локус, придающий устойчивость к клостеровирусу, характеризующийся QTL-1, расположен между локусами pm-h и pm-l, придающими устойчивость к мучнистой росе.

Таким образом, в другом предпочтительном варианте осуществления способа получения растения вида Cucumis sativus, у которых показана устойчивость к клостеровирусу и к мучнистой росе огурца, стадия отбора растения огурца, которое содержит хромосомальный регион, который придает устойчивость к мучнистой росе огурца, как определено на стадиях b), e), f) или h), включает:

- обнаружение присутствия в геноме указанного растения по меньшей мере одного маркера, связанного с первым QTL, придающим устойчивость к мучнистой росе огурцов, показанным SNP маркером 39Т→G в SEQ ID NO:1, SNP маркером 29G→A в SEQ ID NO:2 и маркерами E16/M50-F-194, E11/M48-F-251, E23/M38-M001; и

- обнаружение в геноме указанного растения присутствия по меньшей мере одного маркера, связанного со вторым QTL, придающим устойчивость к мучнистой росе огурцов, показанным SNP маркером 193C→T в SEQ ID NO:3, мутацией вставки 5'-AATTT-3' в позиции 221 в SEQ ID NO:4 и маркерами E23/M40-M003, E24/M46-M002, E24/M46-M003, E12/M91-M003, E26/M43-M003, E14/M59-F-134 и E14/M59-F-200.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа получения растения вида Cucumis sativus, у которого показана устойчивость к клостеровирусу и к мучнистой росе огурца, по меньшей мере одна из стадий a), b), e), f) или h) включает стадию получения образца геномной ДНК из указанного растения и обнаружения в указанном образце геномной ДНК указанного по меньшей мере одного маркера.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления стадия е) включает обнаружение в геноме растений по меньшей мере одного маркера, связанного с QTL-1, и по меньшей мере одного маркера, связанного с pm-h и pm-l, предпочтительно, обнаружение в геноме растений и на одной хромосоме по меньшей мере одного маркера, связанного с QTL-1, по меньшей мере одного маркера, связанного с pm-h, и по меньшей мере одного маркера, связанного с pm-l, предпочтительно, содержание маркеров, выбраных из группы маркеров, перечисленных в таблицах 2, 3 и 4.

В другом предпочтительном варианте осуществления стадию е) осуществляют способом по изобретению для отбора растения вида Cucumis sativus с двойной устойчивостью, как описано выше.

Следует понимать, что способ, описанный в стадиях с)-е), в котором происходит по меньшей мере два акта гомологичной рекомбинации в одной хромосоме при однократном скрещивании с продукцией F1 с двойной устойчивостью, может быть осуществлен при многократных генерациях таких, так что предлагаемые (по меньшей мере два) акта гомологичной рекомбинации и, таким образом, образование растения с двойной устойчивостью реализуется в F2, F3, F4, F5 или в любой последующей генерации. Такие вариации входят в рамки настоящего изобретения и могут быть легко осуществлены специалистом в данной области.

В альтернативном способе получения растения вида Cucumis sativus, которое устойчиво к клостеровирусу и к мучнистой росе огурца, способ может включать стадии:

а) отбора первого растения вида Cucumis sativus с устойчивостью к клостеровирусу и к мучнистой росе огурца осуществлением способа по изобретению;

b) инбридинга указанного растения с получением линии растений, гомозиготной по указанным QTL;

с) скрещивания указанных растений стадии а) и стадии b) с получением семян F1;

d) выращивания семян F1 в растения F1.

В другом аспекте изобретение относится к растениям, полученным способами по изобретению, или к их частям.

Настоящее изобретение делает возможным очень быстрый скрининг растений-потомков с целью отбора растений, способных к двойной устойчивости. Например, среди растений-потомков можно обнаружить растения, которые имеют по меньшей мере один из pm-h маркеров, по меньшей мере один из pm-l маркеров и по меньшей мере один из QTL-1 маркеров. Эти растения, возможно, приобрели желаемую интрогрессию. Скрининг дополнительных маркеров может повысить уровень достоверности прогноза того, что растение-потомок имеет двойную устойчивость. После обнаружения растений с по меньшей мере одним маркером каждого из трех QTL растение может быть отобрано и использовано в программах разведения или в дополнительных экспериментах по определению характеристик.

Преимуществом растений по настоящему изобретению, в котором признаки расположены на одной и той же хромосоме, является то, что они предоставляют улучшенные возможности для более свободного перемещения генов, которые контролируют обе формы устойчивости, в другие (гибридные) растения при использовании обычного разведения, хотя если признаки были расположены на отдельных хромосомах, то было бы намного сложнее получить гибриды, содержащие сочетание обоих признаков путем применения техник обычного разведения.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигурах 1-6 показаны возможные сценарии рекомбинации, в которых устойчивость к мучнистой росе (pm) и к клостеровирусу (QTL-1) двух отдельных растений объединяют в одном растении-потомке. Следует учитывать, что различные родители, указанные как имеющие локусы множественной устойчивости, сами могут быть результатом скрещиваний или самоопыления. Таким образом, растение, имеющее оба QTL, pm-l и pm-h, может быть получено скрещиванием растений, имеющих один QTL.

На фигуре 7 показано расположение различных генов устойчивости к мучнистой росе (pm) из Cucumis sativus NPI и генов устойчивости к клостеровирусу (QTL-1) из C.sativus Khira в одной группе сцепления. В настоящем документе Pm-leaf является эквивалентом pm-l и Pm hypo является эквивалентом pm-h.

На фигуре 8 показана последовательность ДНК в районе SNP и маркеры вставки, которые показаны с помощью соответствующих SEQ ID в таблицах 2 и 3.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Термин "огурец", использованный в настоящем документе, относится к растению, или его части, вида Cucumis sativus, включающему, без ограничения, растения, обычно обозначаемые как огурец (Cucumber), американский корнишон (American gherkin), кассабанана (Cassabanana), зеленец (Cuke), корнишон (Gherkin), парниковый огурец (Hothouse cucumber), огурец-лимон (Lemon cucumber), огурец Mandera (Mandera cucumber), корнишон (Pickling cucumber), змеевидный огурец (Serpent cucumber), салатный огурец (Slicing cucumber), змеевидный огурец (Snake cucumber) и огурец вестиндский (West Indian gherkin).

Использованный в настоящем документе термин "часть растения" обозначает часть растения, включая единичные клетки и клеточные ткани, такие как растительные клетки, которые являются интактными в растениях, скопления клеток и культуры клеток, из которых могут быть регенерированы растения. Примеры частей растения включают, без ограничения, единичные клетки и ткани из пыльцы, семязачатков, листьев, эмбрионов, корней, кончиков корней, пыльников, цветов, плодов, боковых побегов; так же, как и пыльцу, семязачатки, листья, эмбрионы, корни, отростки корней, пыльники, цветы, стебли отростков, побеги, корневые побеги, семена, протопласты и каллии и т.п.

Термин "клостеровирус", использованный в настоящем документе, относится к вирусу семейства Closteriviridae, включающему, но ими не ограничивающийся, вирусы, обычно называемые вирусом болезни желтой задержки роста огурца (CYSDV), вирусом инфекционной желтухи салата (LIYV), вирусом псевдожелтухи свеклы (BPYV; также известный под синонимами вирус хлоротической пятнистости огурца (CCSV), вирусом желтухи огурца, вирусом желтухи мускатной дыни или вирус паллидоза клубники), предпочтительно, BPYV и CYSDV, наиболее предпочтительно, CYSDV. Предпочтительно в отношении растений огурца термин "клостеровирус" относится к роду особо важного для растений огурцов, т.е. Criniviideae.

Термин "мучнистая роса", использованный в настоящем документе, относится к грибковому заболеванию, вызываемому в огурце (Cucumis sativus L.) грибом Sphaerotheca fuliginea (также известным как Podosphaera xanthii и S.cucurbitae), и/или грибом Erysiphe cichoracearum (также известным как Golovinomyces cichoracearum), и/или грибом Leveillula taurica (также известным как Oidiopsis taurica, Erysiphe taurica, Ovulariopsis cynarea, Leveillula solanacearum).

Термин "QTL" используют в настоящем документе в его принятом в данной области значении хромосомального региона, содержащего аллели (например, в форме генов или регуляторных последовательностей), связанные с экспрессией постоянно представленного (количественного) фенотипического признака.

Термин "QTL устойчивости к заболеванию" относится к региону, расположенному на конкретной хромосоме, который связан по меньшей мере с одним из генов, который кодирует устойчивость, или по меньшей мере с регуляторным регионом, т.е. регионом хромосомы, который контролирует экспрессию одного или нескольких генов, связанных с устойчивостью. Для рассмотрения QTL, связанных с устойчивостью, в настоящем документе используют более короткий эквивалент "локус, придающий устойчивость". QTL могут быть установлены путем выявления их генетической локализации в геноме специфического образца Cucumis sativus, используя один или несколько молекулярных генетических маркеров. Один или несколько маркеров, в свою очередь, выявляют специфический локус. Расстояния между локусами обычно измеряют за счет частоты кроссинговера между локусами на той же самой хромосоме. Чем более отдаленными являются два локуса, тем более вероятен между ними кроссинговер. И напротив, если два локуса находятся рядом друг с другом, то кроссинговер (между ними) менее вероятен. Как правило, один сантиморган (функция карт Косамби (сМ)) приблизительно эквивалентна 1% рекомбинации между локусами (маркерами) (Lui, 1997). Когда QTL может быть показан множественными маркерами, то генетическое расстояние между маркерами концевых точек указывает размер QTL.

Термин "хромосома" используют в настоящем документе в его принятом в данной области значении самореплицирующейся генетической структуры в клеточном ядре, содержащей клеточную ДНК и несущей в своей нуклеотидной последовательности линейный набор генов.

Использованный в настоящем документе термин "группа сцепления" относится ко всем генам или генетическим признакам, которые расположены на одной и той же хромосоме. Внутри группы сцепления те локусы, которые достаточно близки друг к другу, будут образовывать сцепление при генетических скрещиваниях. Поскольку вероятность кроссинговера повышается при физической отдаленности генов на хромосоме, то гены, чье расположение значительно удалено друг от друга внутри группы сцепления, могут не проявлять какого-либо сцепления в прямых генетических тестах. Термин "группа сцепления" используют, главным образом, в отношении генетических локусов, у которых наблюдается сцепленное поведение в генетических системах, где хромосомальные распределения еще не были сделаны. Таким образом, в настоящем контексте термин "группа сцепления" является синонимом (физический объект) хромосомы.

Использованный в настоящем документе термин "аллель (аллели)" означает любую одну или несколько из альтернативных форм гена и относится по меньшей мере к одному признаку или характеристике. В диплоидной клетке два аллеля данного гена занимают соответствующие локусы на паре гомологичных хромосом. Поскольку настоящее изобретение относится к QTL, т.е. геномным регионам, которые могут включать один или несколько генов или регуляторных последовательностей, то в ряде случаев более точно говорить о "гаплотипе" (т.е. аллеле хромосомального сегмента) вместо аллеля, однако в таких случаях следует понимать, что термин "аллель" включает термин "гаплотип".

В настоящем документе "геном" обозначает единицу наследственности, состоящую из последовательности ДНК, которая занимает специфическое положение на хромосоме и которая содержит генетическое указание для конкретной характеристики или признака организма.

В настоящем документе "локусом" обозначают позицию, которую занимает данный ген или регуляторная последовательность на хромосоме данного вида.

"Гомологичная рекомбинация" представляет собой обмен ("кроссинговер") фрагментами ДНК между двумя молекулами ДНК или хроматидами парных хромосом в регионе идентичных нуклеотидных последовательностей. Под "актом рекомбинации" в настоящем документе следует понимать мейотический кроссинговер.

Использованный в настоящем документе термин "молекулярный маркер" относится к индикатору, который используют в способах визуализации различий в характеристиках последовательностей нуклеиновых кислот. Примерами таких индикаторов являются маркеры полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP), маркеры полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (AFLP), однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), мутации вставки, микросателлитные маркеры (SSR), маркеры амплифицированного региона с охарактеризованной последовательностью (SCAR), маркеры расщепленной амплифицированной полиморфной последовательности (CAPS) или изоферментные маркеры или комбинации маркеров, описанных в настоящем документе, которые определяют специфическое генетическое или хромосомальное расположение. "Молекулярный маркер, связанный с QTL", как определено в настоящем документе, может, таким образом, относится к SNP, мутациям вставки, а также к более привычным AFLP маркерам или к любому другому типу маркера, применяемому в данной области. В контексте AFLP маркеров, упомянутых в настоящем документе, маркеры показывают специфическую последовательность ДНК огурца, фланкированную двумя AFLP-праймерами, такие праймеры состоят из "центральных праймеров" Е и М, соответствующих сайтам рестрикции ферментов EcoRI и MseI, (Vos et al., 1995; Bai et al. 2003), за которыми следуют 2 или 3 дополнительных селективных основания в качестве индикаторных, каждое сопровождается двухзначным кодом, идентифицирующим селективные нуклеотиды, с помощью которых увеличивается "центральный праймер" (коды указаны в таблице 1).

E16/M50-244 представляет собой маркер, полученный с использованием праймеров амплификации EcoRI + CC и MseI + CAT, для получения фрагмента, имеющего общую длину 244 п.о. Длина фрагмента может зависеть от способа, использованного для обнаружения фрагмента, и представляет собой приближенное значение его истинной длины плюс или минус несколько оснований. При определении маркера, как предусмотрено в настоящем документе, должна быть сделана ссылка на положение на хромосоме этого маркера относительно других маркеров в карте сцепления. Таким образом, маркер E16/M50-244 определяют с помощью последовательности его праймеров и с помощью его длины в качестве продукта амплификации и с помощью его положения относительно E14/M59-F-200 и/или E23/M38-M003 или, как предусмотрено в настоящем документе, с помощью его положения относительно других маркеров, как показано в пронумерованном списке, с соответствующим расстоянием в cM в матриксе, в таблице 4. Однако следует принимать во внимание, что скрещивания растений могут приводить к потере определенных маркеров, так что отсутствие определенного маркера не исключает присутствия генетического элемента, который придает устойчивость к заболеванию и с которым связан указанный маркер.

Таблица 1Коды праймеров, которые обычно применяют в AFLP анализах и которые использовали в настоящем документе (источник: Keygene, Wageningen, The Netherlands)
Код праймера	Увеличение	Код праймера	Увеличение	Код праймера	Увеличение	Код праймера	Увеличение
01	A	32	AAC	53	CCG	74	GGT
02	С	33	AAG	54	CCT	75	GTA
03	G	34	AAT	55	CGA	76	GTC
04	Т	35	АСА	56	CGC	77	GTG
11	AA	36	ACC	57	CGG	78	GTT
12	AC	37	ACG