Лечение заболеваний кишечника

Лечение заболеваний кишечника

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения патологических состояний кишечника посредством применения технологии PHKi путем интраректального введения. Композиции согласно изобретению содержат молекулы коротких интерферирующих нуклеиновых кислот (siHK) и близких соединений, включая, но не ограничиваясь ими, короткие интерферирующие РНК (siPHK). В частности, композиции согласно изобретению можно использовать для лечения патологических состояний кишечника, включая гиперпролиферативные заболевания, в частности злокачественную опухоль ободочной и прямой кишки; аутоиммунные и воспалительные заболевания кишечника (IBD), в частности болезнь Крона; колит, в частности язвенный колит; синдром раздраженного кишечника; инфекционные заболевания кишечника, такие как псевдомембранозный колит, амебиаз или туберкулез кишечника; полипы ободочной кишки; дивертикулы; запор; непроходимость кишечника; синдромы нарушения всасывания; заболевания прямой кишки и диарею.

В некоторых вариантах осуществления заболевания кишечника, развитие которых вызвано повышенными концентрациями интерлейкина-12 (IL-12), цитокина, принимающего участие в иммунной ответной реакции Т-клеток-хелперов типа 1 (Th1), предназначаются для лечения с использованием данного подхода: например, это аутоиммунные заболевания и IBD. Обеспечиваются композиции и способы, включающие siPHK и близкие соединения с направленным действием на субъединицу IL12-р40 и/или субъединицу IL12-р35 для лечения заболеваний, связанных со сверхэкспрессией IL-12, в частности болезни Крона.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

PHKi в качестве инструмента для модуляции экспрессии гена

РНК-интерференция относится к процессу специфичного в отношении последовательности посттрансляционного «сайленсинга» генов, опосредуемого двухцепочечной РНК (dsPHK). После открытия этого феномена у растений в начале 1990 годов Andy Fire и Craig Mello показали, что dsPHK специфически и селективно подавляют экспрессию генов, причем очень эффективным образом у Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998). Последовательность первой цепи (смысловой РНК) совпадала с соответствующей областью матричной РНК-мишени (мРНК). Вторая цепь (антисмысловая РНК) была комплементарной мРНК. Полученные dsPHK оказались на несколько порядков более эффективными по сравнению с соответствующими молекулами одноцепочечной РНК (в частности, антисмысловой РНК).

Процесс PHKi начинается, когда фермент DICER сталкивается с dsPHK и «нарезает» ее на кусочки, называемые короткими интерферирующими РНК, или siPHK. Данный белок относится к семейству нуклеаз, РНК-азе III. Комплекс белков собирает данные siPHK и использует их код в качестве проводника для поиска и разрушения любой РНК в клетке с парной последовательностью, такой как мРНК-мишень (см. Boscher & Labouesse, 2000; и Akashi et al., 2001).

При попытке применить PHKi для «нокаута» гена было установлено, что клетки млекопитающих выработали различные защитные механизмы против вирусных инфекций, которые могут стать препятствием для применения данного подхода. Действительно, присутствие вирусной dsPHK в очень низких концентрациях «запускает» ответную выработку интерферона, приводя к общей неспецифической супрессии трансляции, что, в свою очередь, «запускает» апоптоз (Williams, 1997, Gil & Esteban, 2000).

В 2000 г. сообщалось, что dsPHK специфически ингибирует три гена в мышиных ооцитах и эмбрионах на ранних стадиях развития. Остановку трансляции и, таким образом, ответной реакции PKR не наблюдали, поскольку эмбрионы продолжали развиваться (Wianny & Zerniska-Goetz, 2000). В исследованиях, проведенных Ribopharma AG (Kulmbac, Германия), было показано функциональное значение PHKi в клетках млекопитающих с использованием коротких (из 20-24 пар нуклеотидов) dsPHK для «выключения» генов в человеческих клетках без инициации ответа в острой фазе. В аналогичных опытах, проведенных другими исследовательскими группами, эти результаты были подтверждены (Elbashir et al., 2001; Caplen et al., 2001). При тестировании в различных нормальных и опухолевых человеческих и мышиных клеточных линиях было показано, что короткие РНК-«шпильки» (shPHK) могут приводить к «сайленсингу» генов так же эффективно, как и их противоположности siPHK (Paddison et al., 2002). Недавно было показано, что другая группа коротких РНК (из 21-25 пар нуклеотидов) опосредует даун-регуляцию экспрессии гена. Данные РНК, короткие, временно регулируемые РНК (stPHK), регулируют время экспрессии гена в развитии в Caenorhabditis elegans (см. обзор Banerjee & Slack, 2002 и Grosshans & Slack, 2002).

Ученые использовали PHKi в различных системах, включая Caenorhabditis elegans, дрозофил, трипаносом и других беспозвоночных. Недавно несколько групп показали наличие специфической супрессии биосинтеза белка в различных клеточных линиях млекопитающих (в частности, в клетках HeLa), демонстрируя тем самым, что PHKi является широко применимым способом для «сайленсинга» генов в условиях in vitro. Основываясь на данных результатах, PHKi быстро превратилась в хорошо признанный инструмент для установления (идентификации и регистрации) функций генов. Использование в PHKi коротких олигонуклеотидов dsPHK будет способствовать пониманию функции генов, которые секвенированы только частично.

Недавно Krutzfeldt и коллеги показали, что группа специально созданных генно-инженерных соединений, названных «антагомирами», может эффективно подвергать «сайленсингу» действие микроРНК (miPHK), не кодирующих структуры РНК, которые регулируют экспрессию генов (Krutzfeldt et al., 2005).

Приведенное выше представляет обсуждение уровня техники, относящегося к PHKi. Обсуждение приводится только для понимания изобретения, описание которого следует, и не для признания того, что любая из описанных работ представляет предшествующий уровень техники по отношению к заявленному изобретению.

Интерлейкин-12 и болезнь Крона

Интерлейкин-12 (IL-12) представляет собой гетеродимерный гликопротеин массой 70 кДа (IL12-р70), состоящий из субъединицы с молекулярной массой 40 кДа (обозначаемой IL12-р40) и субъединицы с молекулярной массой 35 кДа (обозначаемой IL12-р35), связанных дисульфидными связями, которые имеют важное значение для проявления биологической активности IL-12.

IL-12 является ключевым цитокином, который регулирует опосредуемые клетками иммунные ответы и воспалительные реакции с участием Т-клеток-хелперов (Th1) (Gately et al., 1998; Trinchieri, 1998). Способность IL-12 эффективно стимулировать развитие Th1-клеток делает его идеальной мишенью при лечении опосредуемых Th1-клетками заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания и воспалительные заболевания кишечника (IBD).

Одним конкретным IBD является болезнь Крона, патологическое состояние, характеризующееся повышенной продукцией IL-12 в антиген-представляющих клетках ткани кишечника и интерферона-γ и фактора-α некроза опухолей (TNF-α) лимфоцитами и макрофагами кишечника (Fais et al., 1994; Fuss et al., 1996; Monteleone et al., 1997; Parronchi et al., 1997; Plevy et al., 1997).

Болезнь Крона вызывает воспаление в тонком кишечнике. Воспаление может привести к возникновению боли и может вызвать частое освобождение кишечника, приводя к развитию диареи. Наиболее распространенными симптомами болезни Крона является боль в брюшной области и диарея, хотя также может иметь место кровотечение из прямой кишки, потеря массы тела и лихорадка. Кровотечение может быть сильным и длительным, приводя к анемии. У детей, страдающих болезнью Крона, может наблюдаться замедленное развитие и задержка роста.

Большинство людей вначале подвергается лечению лекарственными средствами, содержащими мезаламин, соединение, которое оказывает помощь в борьбе с воспалением. Сульфасалазин представляет собой наиболее часто применяемый препарат из данных лекарственных средств. Пациентов, которым он не помогает или которые его не переносят, можно перевести на другие, содержащие мезаламин лекарственные средства, обычно известные как средства 5-ASA, такие как азакол, дипентий или пентаза. Возможные побочные эффекты от препаратов на основе мезаламина включают тошноту, рвоту, диарею и головную боль. Некоторые пациенты для снятия воспаления принимают кортикостероиды. Данные лекарственные средства являются наиболее эффективными для лечения болезни Крона в активной стадии, но они могут вызывать серьезные побочные эффекты, включая развитие более высокой чувствительности к инфекции. Также для лечения болезни Крона применяют лекарственные средства, которые подавляют иммунную систему. Чаще всего назначают 6-меркаптопурин и близкое лекарственное средство, азатиоприн. Иммуносупрессоры функционируют посредством блокирования иммунной реакции, участвующей в развитии воспаления. Подобные лекарственные средства могут вызвать побочные эффекты, такие как тошнота, рвота и диарея, и могут привести к снижению устойчивости человека к инфекции. Оперативное вмешательство по поводу удаления части кишечника может привести к ослаблению болезни Крона, но не к его вылечиванию. В результате проявления побочных эффектов и отсутствия эффективности имеющихся средств лечения болезни Крона исследователи продолжают поиск более эффективных способов лечения.

Было показано, что при ингибировании IL-12 подавляется развитие и клиническое прогрессирование заболевания на многих экспериментальных моделях аутоиммунных и хронических воспалительных заболеваний (Caspi, 1998). Данные модели включают экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ), экспериментальный аутоиммунный увеит (EAU), индуцированный коллагеном артрит (CIA), аутоиммунный нефрит, инсулинзависимый сахарный диабет (IDDM) и различные модели IBD (Vandenbroeck et al., 2004). На данных моделях выясняли роль эндогенного IL-12 при использовании нокаутных мышей в отношении гена IL-12р40 или при введении антител против IL-12.

В частности, направленное действие антител против IL-12 представляет собой эффективный способ лечения воспаления кишечника на моделях болезни Крона на животных (Mannon et al., 2004). Так, у мышей с колитом, индуцированным тринитробензолом сульфонатом, имело место опосредуемое Th1-клетками воспаление кишечника, для которого характерна очень высокая продукция IL-12, интерферона-γ и фактора-α некроза опухолей (TNF-α). У мышей введение моноклональных антител против IL-12 приводило к вылечиванию развившегося колита, а при назначении во время индукции колита предупреждало развитие воспаления (Neurath et al., 1995).

С помощью антител против IL-12 можно также профилактировать или лечить спонтанный колит на моделях опосредуемого Th1-клетками воспаления, таких как мыши со сверхэкспрессией человеческого гена CD3ε и мыши с дефицитом интерлейкина-10 (Davidson et al., 1998; Simpson et al., 1998).

Результаты ранних испытаний фазы 2 обеспечивают некоторые доказательства того, что лечение моноклональными антителами против р40 IL-12 может стимулировать клиническую ответную реакцию и ремиссию у пациентов с активной формой болезни Крона (Mannon et al., 2004). Такое лечение связано со снижением уровня опосредуемых Th1-клетками цитокинов воспаления в месте заболевания.

Результаты, полученные ранее на животных моделях, а также данные клинических испытаний антител против IL-12 у пациентов с болезнью Крона (Mannon et al., 2004) подчеркивают важность IL-12 в качестве мишени для будущих способов лечения болезни Крона.

Модуляция концентраций IL-12 с помощью siPHK

Направленное действие siPHK на экспрессию IL-12 уже применяли для получения модифицированных дендритных клеток (DC), которые можно использовать в различных терапевтических способах в условиях in vitro, ex vivo и in vivo для модуляции активности Т-клеток, и, таким образом, их применяли в терапевтических подходах для лечения иммунных нарушений у млекопитающих (WO 2003/104456; Hill et al., 2003). При направленном действии siPHK на экспрессию IL-12 в зрелых DC была показана критическая роль IL-12 для секреции интерферона-γ (IFN-γ) в природных клетках-киллерах, стимулированной зрелыми DC (Borg et al., 2004). Кроме того, с удивлением было установлено, что ингибиторы IL-12 р35, включая siPHK, блокируют дифференциацию преадипоцитов в адипоциты и накопление триглицеридов в адипоцитах (WO 2003/104495).

Направленные на р40 IL-12 siPHK можно эффективно доставлять, при инкапсулировании в липосомы, в брюшную полость мышей для модуляции местной или системной воспалительной реакции после индукции эндотоксином (Flynn et al., 2004). Однако, для сведения, отсутствуют ранее полученные доказательства наличия интраректального введения siPHK для даун-регуляции гена IL-12 или любого другого гена, принимающего участие в развитии патологических состояний кишечника. Заявители разработали способы снижения экспрессии IL-12 в условиях in vivo для лечения заболеваний кишечника и разработали способы доставки siPHK в кишечник при интраректальном введении.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения патологических состояний кишечника посредством применения технологии PHKi путем интраректального введения. Композиции согласно изобретению содержат молекулы коротких интерферирующих нуклеиновых кислот (siHK) и близкие соединения, включая, но не ограничиваясь ими, siPHK. В частности, композиции согласно изобретению можно использовать в получении лекарственного препарата для лечения патологических состояний кишечника, включающих: гиперпролиферативные заболевания, в частности злокачественную опухоль ободочной и прямой кишки; аутоиммунные и воспалительные заболевания кишечника (IBD), в частности болезнь Крона; колит, в частности язвенный колит; синдром раздраженного кишечника; инфекционные заболевания кишечника, такие как псевдомембранозный колит, амебиаз или туберкулез кишечника; полипы ободочной кишки; дивертикулы; запор; непроходимость кишечника; синдромы нарушения всасывания; заболевания прямой кишки и диарею. Настоящее изобретение включает композиции и способы применения siHK, в том числе, но не ограничиваясь ими, короткие интерферирующие РНК (siHK), двухцепочечные РНК (dsPHK), микро-РНК (miPHK), антагомиры и короткие РНК-«шпильки» (shPHK), способные опосредовать РНК-интерференцию.

Способы согласно изобретению включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества одной или более siHK согласно изобретению для лечения заболевания кишечника. В предпочтительных вариантах осуществления способы согласно изобретению включают интраректальное введение терапевтической siHK.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к siHK или аналогичным, синтезированным химическим путем молекулам, действие которых направлено на интерференцию экспрессии мРНК субъединиц р35 или р40 цитокина IL-12, и что, в конечном итоге, модулирует количество продуцированного белка. Композиции и способы, включающие указанную выше siPHK и близкие соединения, предназначены для лечения заболеваний, связанных со сверхэкспрессией IL-12, таких как аутоиммунные заболевания и воспалительные заболевания кишечника (IBD), в частности болезнь Крона.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. Олигонуклеотидные последовательности молекул siPHK, действие которых направлено на субъединицы р35 и р40 IL-12, входящие в настоящее изобретение. Последовательности SEQ ID No, приведенные на фигуре, относятся к смысловой цепи (5'→3'); как правило, siPHK вводят в виде dsPHK так, что они будут включать смысловую цепь и комплементарную ей цепь.

Фигура 2. Влияние siPHK на экспрессию субъединицы р35 IL-12 в системе in vitro. В результате обработки siPHK снижается уровень транскриптов гена р35 IL-12. РНК получали из клеток SW480, обработанных siPHK в течение различных периодов времени. Пробы анализировали ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров. Значения показывают средние уровни экспрессии различных транскриптов, нормализованные к 18S, в качестве гена «домашнего хозяйства».

Фигура 3. Влияние siPHK на экспрессию субъединицы р40 IL-12 в системе in vitro. А: обработка siPHK приводит к снижению уровня транскриптов гена р40 IL-12 в человеческих клетках. РНК получали из клеток SW480, обработанных siPHK с последовательностями SEQ ID 67 и SEQ ID 79 в течение различного периода времени при дозе обработки, составляющей 200 нМ. Значения показывают средние уровни экспрессии различных транскриптов, нормализованные к 18S, в качестве гена «домашнего хозяйства». Значения представляют среднее значение процента нормализованных уровней мРНК при интерференции siPHK по сравнению с экспрессией контрольного гена и их средние значения стандартного отклонения среднего (SEM). В: обработка siPHK приводит к снижению уровня транскриптов гена р40 IL-12 в мышиных клетках. РНК получали из клеток С2С12, обработанных siPHK с последовательностями SEQ ID 86 и SEQ ID 87 в течение различного периода времени при дозе обработки, составляющей 100 нМ. Действие SEQ ID 86, которая является гомологичной к человеческой последовательности SEQ ID 67, направлено на субъединицу р40 мышиного IL-12. Кроме того, при наличии действия против субъединицы р40 мышиного IL-12 SEQ ID 87 представляет siPHK с наиболее высокими баллами у мышей и не имеет гомологичного siPHK-дуплекса у человека. Молекулы siPHK с последовательностями SEQ ID 86 и SEQ ID 87 представляют собой описанные ниже с 2 выступающими тимидиновыми нуклеотидными 3'-концами. Значения представляют среднее значение процента нормализованных уровней мРНК по сравнению с 18S при интереференции siPHK по сравнению с экспрессией контрольного гена и их средние значения стандартного отклонения среднего (SEM).

Фигура 4. Обработка siPHK приводит к снижению уровня транскриптов гена GFP в тонком кишечнике. Отобранную в среду ОСТ ткань исследовали микроскопией и оценивали фотопрограммой. Данные показывают обработку однократной дозой (мыши 2-3) и обработку двукратными дозами (мыши 4-5) siPHK. Значения показывают уровень экспрессии на 25 показательных снимках на мышь, относящихся к контрольным, не обработанным мышам. Представлены стандартные отклонения данных.

Фигура 5. Обработка siPHK приводит к снижению уровня транскриптов гена GFP в тонком кишечнике. Отобранную в РНК ткань затем исследовали, анализировали ОТ-ПЦР. Данные показывают обработку однократной дозой (мыши 2-3) и обработку двукратными дозами (мыши 4-5) siPHK. Представлены стандартные отклонения данных.

Фигура 6. Обработка siPHK приводит к снижению уровня транскриптов гена GFP в толстом кишечнике. Отобранную в среду ОСТ ткань исследовали микроскопией и оценивали фотопрограммой. Данные показывают обработку однократной дозой (мыши 2-3) и обработку двукратными дозами (мыши 4-5) siPHK. Значения показывают уровень экспрессии на 25 показательных снимках на мышь, относящихся к контрольным, не обработанным мышам. Представлены стандартные отклонения данных.

Фигура 7. Обработка siPHK приводит к снижению уровня транскриптов гена GFP в толстом кишечнике. Отобранную в РНК ткань затем исследовали, анализировали ОТ-ПЦР. Данные показывают обработку однократной дозой (мыши 2-3) и обработку двукратными дозами (мыши 4-5) siPHK. Представлены стандартные отклонения данных.

Фигура 8. Данные по пробам, отобранным в среду ОСТ.

Фигура 9. Данные по пробам, отобранным затем в РНК.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения патологических состояний кишечника посредством применения технологии PHKi путем интраректального введения. Композиции согласно изобретению содержат молекулы короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (siHK), которая модулирует экспрессию генов-мишеней, связанных с развитием патологических состояний стенки кишечника.

Способы согласно изобретению включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества одной или более siHK согласно изобретению.

Конструирование siPHK

Ген, на который направлено действие siHK согласно изобретению, означает ситуацию, когда, например, siHK избирательно снижает или подавляет экспрессию гена. Альтернативно, действие siHK направлено на ген, когда siHK гибридизуется в сильных условиях с транскриптом гена. siHK можно тестировать в условиях in vitro или in vivo на ее способность направленно воздействовать на ген.

В 1999 Tuschl et al. установили эффект «сайленсинга» siPHK, показав, что их эффективность является функцией длины дуплекса, длины выступающих 3'-концов и последовательности данных выступающих концов.

Выбор правильной гомологичной области в гене-мишени имеет большое значение для точного «сайленсинга». Короткий фрагмент последовательности гена-мишени (например, длиной 19-40 нуклеотидов) выбран в качестве последовательности siHK согласно изобретению. В одном варианте осуществления siHK представляет siHK. В таких вариантах осуществления короткий фрагмент последовательности гена-мишени представляет фрагмент мРНК гена-мишени. В предпочтительных вариантах осуществления критерии для выбора фрагмента последовательности из мРНК гена-мишени для возможной молекулы-кандидата siPHK включают: 1) последовательность из мРНК гена-мишени, длина которой составляет, по меньшей мере, 50-100 нуклеотидов от 5'- или 3'-конца нативной молекулы мРНК; 2) последовательность из мРНК гена-мишени, которая имеет соотношение G/C в пределах 30% до 70%, наиболее предпочтительно составляет примерно 50%; 3) последовательность из мРНК гена-мишени, которая не содержит повторяющихся последовательностей (например, ААА, ССС, GGG, ТТТ, АААА, СССС, GGGG, ТТТТ); 4) последовательность из мРНК гена-мишени, которая является доступной в мРНК, и 5) последовательность из мРНК гена-мишени, которая является уникальной для гена-мишени. Фрагмент последовательности из мРНК гена-мишени может соответствовать одному или более указанному выше критерию. В предпочтительных вариантах осуществления siPHK имеет соотношение G/C ниже 60% и/или в ней отсутствуют повторяющиеся последовательности.

На практике интересующий ген вводят в виде нуклеотидной последовательности в прогностическую программу, в которой предусмотрены все вариабельные величины, описанные выше, в целях конструирования оптимальных олигонуклеотидов. С помощью данной программы сканируется нуклеотидная последовательность любой мРНК в отношении областей, чувствительных к направленному воздействию siPHK. Результатом данного анализа является оценка в баллах олигонуклеотидов возможной siPHK. Молекулы с наиболее высокими баллами используют для конструирования олигоуклеотидов двухцепочечной РНК (как правило, длиной 21 пара нуклеотидов, хотя возможны также другие длины), которые обычно получают химическим синтезом. Заявители планируют подвергнуть тестированию несколько химических модификаций, которые хорошо известны в данной области. Данные модификации направлены на повышение стабильности или доступности олигонуклеотидов dsPHK.

Затем олигонуклеотиды-кандидаты можно «просеять» в отношении наличия межвидовой консервативности последовательности для облегчения перехода от испытаний на животных к клиническим испытаниям у людей.

В дополнение к siHK, которая является строго комплементарной к области-мишени, можно использовать вырожденные последовательности siHK для направленного воздействия на гомологичные области. В заявке WO 2005/045037 описывается конструирование молекул siHK с направленным действием на такие гомологичные последовательности, например, при включении необычных пар оснований, например ошибочно спаренных и/или неоднозначных пар оснований, которые могут обеспечить дополнительные последовательности-мишени. В тех случаях, когда ошибочно спаренные основания идентифицированы, можно использовать необычные пары оснований (например, ошибочно спаренные и/или неоднозначные пары оснований) для получения молекул siHK с направленным действием на последовательность более чем одного гена. В не ограничивающем примере необычные пары оснований, такие как пары оснований UU и СС, используют для получения молекул siHK, которые способны направленно воздействовать на последовательности различных мишеней, которые разделяют гомологию последовательностей. При этом одно преимущество применения siHK согласно изобретению заключается в том, что можно сконструировать одну siHK с включением последовательности нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной нуклеотидной последовательности, которая консервативна для гомологичных генов. В данном подходе одну siHK можно использовать для подавления экспрессии более чем одного гена вместо применения более чем одной молекулы siHK с направленным действием на различные гены.

Идентичность последовательности можно рассчитать с помощью алгоритмов сравнения и сопоставления, известных в данной области (см. Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991 и цитированные там источники) и рассчитать различие в процентах между нуклеотидными последовательностями, например, при использовании алгоритма Smith-Waterman в качестве инструмента в программном обеспечении BESTFIT с использованием недостаточных параметров (например, University of Wisconsin Genetic Computing Group). Предпочтительной является идентичность последовательности, составляющая более чем 90%, 95% или 99% между siHK и участком гена-мишени. Альтернативно комплементарность между siHK и молекулой нативной РНК можно определить функционально гибридизацией, а также функционально по ее способности снижать или ингибировать экспрессию гена-мишени. Способность siHK воздействовать на экспрессию гена можно определить эмпирически в условиях in vivo и in vitro.

Предпочтительными молекулами siHK согласно изобретению являются двухцепочечные. В одном варианте осуществления двухцепочечные молекулы siHK содержат «тупые» концы. В другом варианте осуществления двухцепочечные молекулы siHK содержат выступающие нуклеотиды (например, «выступы» из 1-5 нуклеотидов, предпочтительно «выступы» из 2 нуклеотидов). В конкретном варианте осуществления выступающие нуклеотиды являются выступающими 3'-концами. В другом конкретном варианте осуществления выступающие нуклеотиды являются выступающими 5'-концами. Частью «выступа» может быть любой тип нуклеотидов. В одном варианте осуществления выступающие нуклеотид или нуклеотиды представляют рибонуклеиновые кислоты. В другом варианте осуществления выступающие нуклеотид или нуклеотиды представляют дезоксирибонуклеиновые кислоты. В предпочтительном варианте осуществления выступающие нуклеотид или нуклеотиды представляют тимидиновые нуклеотиды. В еще одном варианте осуществления выступающие нуклеотид или нуклеотиды являются модифицированными или неклассическими нуклеотидами. Выступающие нуклеотид или нуклеотиды могут представлять неклассические межнуклеотидные связи (например, иные, чем фосфодиэфирные связи).

Синтез siHK-дуплексов

siHK можно синтезировать любым методом, известным в данной области. Предпочтительно РНК синтезируют химическим путем с использованием соответствующим образом защищенных рибонуклеозидных фосфорамидитов и обычного ДНК/РНК синтезатора. Дополнительно siPHK можно получить от поставщиков промышленно доступных РНК олигосинтеза, включая, но не ограничиваясь ими, Proligo (Hamburg, Германия), Dharmacon Research (Lafayette, CO, США), Glen Research (Sterling, VA, США), ChemGenes (Ashland, MA, США) и Cruachem (Glasgow, Великобритания), Qiagen (Германия), Ambion (США) и Invitrogen (Шотландия). Альтернативно, молекулы siHK согласно изобретению можно экспрессировать в клетках при трансфекции клеток векторами, содержащими обратную комплементарную к siHK последовательность под контролем промотора. После экспрессии siHK можно выделить из клетки при использовании методов, известных в данной области.

При работе с одноцепочечными молекулами РНК необходима стадия отжига. Для отжига РНК по 30 мкл 50 мМ раствора каждого олигонуклеотида РНК объединяют в 100 мМ ацетате калия, 30 мМ HEPES-KOH рН 7,4, 2 мМ ацетате магния. Затем раствор инкубируют в течение 1 мин при 90°С, центрифугируют в течение 15 сек и инкубируют в течение 1 ч при 37°С.

В тех вариантах осуществления, в которых siPHK представляет короткую РНК-«шпильку» (shPHK), две молекулы siPHK можно соединить линкерным участком (например, нуклеотидным линкером или ненуклеотидным линкером).

Химическая модификация siHK

siHK согласно изобретению могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов и/или нефосфодиэфирных связей. С помощью химических модификаций, известных в данной области, можно повысить стабильность, доступность и/или поглощение клетками siHK. Специалистам в данной области знакомы другие типы химических модификаций, которые можно включить в молекулы РНК (см. публикации международных заявок WO 2003/070744 и WO 2005/045037, в которых приводится обзор типов модификаций).

В одном варианте осуществления модификации можно использовать для обеспечения повышенной устойчивости к деградации или повышенного поглощения. Примеры таких модификаций включают фосфоротиоатные межнуклеотидные связи, 2'-О-метилрибонуклеотиды (особенно в смысловой цепи двухцепочечной siPHK), 2'-дезоксифторрибонуклеотиды, 2'-дезоксирибонуклеотиды, нуклеотиды с «универсальным основанием», 5-С-метилнуклеотиды и включение остатка инвертированного дезоксинуклеотида без основания (в основном см. GB 2406568).

В другом варианте осуществления модификации можно использовать для повышения стабильности siPHK или повышения эффективности направленного действия. Модификации включают химическое поперечное сшивание двух комплементарных цепей siPHK, химическую модификацию 3'- или 5'-конца цепи siPHK, модификации сахара, модификации азотистого основания и/или модификации остова, 2'-фторсодержащие модифицированные рибонуклеотиды и 2'-дезоксирибонуклеотиды (в основном см. публикацию международной заявки WO 2004/029212).

В другом варианте осуществления модификации можно использовать для повышения или снижения аффинности для комплементарных нуклеотидов в мРНК-мишени и/или в комплементарной цепи siHK (в основном см. публикацию международной заявки WO 2005/044976). Например, немодифицированный пиримидиновый нуклеотид можно заменить на 2-тио-, 5-алкинил-, 5-метил- или 5-пропинилпиримидин. Дополнительно немодифицированный пурин можно заменить на 7-деза-, 7-алкил- или 7-алкенилпурин.

В другом варианте осуществления в тех случаях, когда siHK представляет двухцепочечную siPHK, выступающие 3'-концевые нуклеотиды можно заменить на дезоксирибонуклеотиды (в основном см. Elbashir et al., 2001).

Тестирование siPHK-дуплексов в условиях in vitro

Для проверки специфичности интерференции siPHK использовали клеточные культуры, экспрессирующие гены-мишени.

В случае субъединиц р35 и р40 IL-12 использованные для опытов клетки представляли собой человеческие клетки SW480 и мышиные мышечные клетки С2С12. После инкубации клеток с соответствующими siPHK-дуплексами определяли уровни экспрессии р35 и р40. Для связывания «нокаута» под действием siPHK со специфическими фенотипами культивируемых клеток необходимо показать уменьшение концентрации белка-мишени или, по меньшей мере, показать снижение уровня мРНК-мишени.

Концентрации мРНК гена-мишени можно количественно определить ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР). Кроме того, уровни белка можно определить различными методами, хорошо известными в данной области, такими как вестерн-блоттинг с использованием специфических антител против различных мишеней, что позволяет провести непосредственный мониторинг снижения уровня белка-мишени.

siPHK вводят в клетки методом трансфекции, хорошо известного в данной области. Единичную трансфекцию siPHK-дуплексом можно осуществить, например, при использовании катионного липида, такого как реагент липофектамин 2000 (Invitrogen), с последующим тестированием эффективности «сайленсинга» через 24, 48 и 72 ч после трансфекции.

Типичный протокол трансфекции можно осуществить следующим образом: в одной лунке 6-луночного планшета проводят трансфекцию с использованием 100 нМ siPHK для мышиных клеток С2С12 или 200 нМ siPHK для человеческих клеток SW480 в качестве конечной концентрации. Согласно протоколу с использованием реагента липофектамина 2000 за сутки до проведения трансфекции высевают 2-4×10⁵ клеток на лунку в 3 мл соответствующей культуральной среды, содержащей DMEM, 10% сыворотки, антибиотики и глутамин, и инкубируют клетки в обычных условиях культивирования (при 37°С и 5% СО₂). В день проведения трансфекции клетки должны иметь слияние, составляющее 30-50%. Разводят 12,5 мкл 20 мкМ siPHK-дуплекса (соответствует конечной концентрации 100 нМ) или 25 мкл 20 мкМ siPHK-дуплекса (соответствует конечной концентрации 200 нМ) в 250 мкл DMEM и перемешивают. Также 6 мкл липофектамина 2000 разводят в 250 мкл DMEM и перемешивают. Через 5 мин инкубации при комнатной температуре разведенный олигомер (siPHK-дуплекс) и разведенный липофектамин объединяют для образования комплекса во время инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем комплекс наносят по каплям на клетки с 2 мл свежей культуральной среды с низким содержанием антибиотиков и осторожно перемешивают раскачиванием планшета назад и вперед для обеспечения равномерного распределения комплекса для трансфекции. Инкубируют клетки в обычных для них условиях культивирования и через сутки комплекс удаляют и вносят новую порцию полной культуральной среды. В целях мониторинга «сайленсинга» генов клетки собирают через 24, 48 и 72 ч после трансфекции.

Эффективность трансфекции может зависеть от типа клеток и также от номера пассажа и слияния клеток. Также критическими факторами являются время и характер образования комплекса siPHK-липосома (например, переворачивание по сравнению с обработкой на вортексе). Низкая эффективность трансфекции является наиболее частой причиной отсутствия успеха в «сайлесинге». Высокая степень трансфекции не является тривиальным вопросом, и для ее достижения необходимо тщательно проверить каждую новую клеточную линию, предназначенную для применения. Эффективность трансфекции можно тестировать при трансфекции генов-репортеров, например, с помощью экспрессирующей плазмиды EGFP под контролем CMV (например, от Clontech) или экспрессирующей плазмиды B-Gal и затем на следующие сутки оценить результаты фазово-контрастной и/или флуоресцентной микроскопией.

В зависимости от количества и периода полураспада (или оборота) белка-мишени наличие «нокаутного» фенотипа может стать очевидным через 1-3 суток или даже позже. В тех случаях, когда не наблюдают проявления фенотипа, можно фиксировать истощение белка иммунофлуоресценцией или вестерн-блоттингом.

После трансфекции общую фракцию РНК, экстрагированную из клеток, предварительно обрабатывают ДНК-азой I и используют для обратной транскрипции с применением произвольного праймера. Амплифицированную ПЦР с помощью пары специфических праймеров, включающих, по меньшей мере, одно экзон-экзонное сочленение используют в качестве контроля для амплификации пре-мРНК. Также в качестве контроля необходима постановка ОТ-ПЦР мРНК, не являющейся мишенью. Эффективное истощение мРНК при еще не детектируемом уменьшении концентрации белка-мишени может указывать на то, что в клетке может находиться большой запас стабильного белка. Альтернативно, амплификацию ОТ-ПЦР можно использовать для более точного тестирования снижения или исчезновения мРНК. С помощью ОТ-ПЦР количественно определяют первоначальное количество матрицы наиболее специфическим, чувствительным и воспроизводимым способом. При постановке ОТ-ПЦР определяют флуоресценцию, испускаемую во время реакции, в качестве показателя продукции ампликона во время каждого цикла ПЦР, в световом циклическом аппарате. Данный сигнал усиливается в прямой зависимости от количества продукта ПЦР в реакции. При регистрации количества эмиссии флуоресценции в каждом цикле является возможным прослеживать реакцию ПЦР во время экспоненциальной фазы, когда первое значительное увеличение количества продукта ПЦР коррелирует с первоначальным количеством матрицы-мишени.

Для подтверждения характера интерференции различным образом экспрессируемых генов IL-р35 и р40 к клеточных культурах проводят количественную ОТ-ПЦР. Для постановки количественной ОТ-ПЦР используют примерно 500 нг общей фракции РНК для обратной транскрипции с последующей амплификацией ПЦР со специфическими для каждого гена праймерами в реакции. Условия ПЦР представляют на первоначальной стадии следующее: 30 сек при 95°С, затем 40 циклов по 5 сек при 95°С, 10 сек при 62°С и 15 сек при 72°С. Количественное определение 18S мРНК используют в виде гена «домашнего хозяйства» в качестве контроля для нормализации данных. Сравнительный анализ относительной экспрессии гена является наилучшим, когда экспрессия выбранного эндогенного/внутреннего контроля я