Лекарственное средство на основе дииндолилметана (dim) с повышенной биодоступностью и его использование в лечении гиперпластических и воспалительных заболеваний человека

Лекарственное средство на основе дииндолилметана (dim) с повышенной биодоступностью и его использование в лечении гиперпластических и воспалительных заболеваний человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицины и химико-фармацевтической промышленности.

В настоящее время в медицинской практике широкое распространение получили средства на основе индольных соединений, выделенных из семейства крестоцветных (Cruciferous), к которому относятся все виды кочанной капусты, брюссельская, цветная капуста и брокколи, а также их синтетические аналоги. Интерес к соединениям данной группы вызван, в частности, их антиканцерогенными и антиэстрогенными свойствами, в связи с чем они могут быть использованы при лечении заболеваний органов женской репродуктивной системы и некоторых гормональных патологий, сопровождающихся гиперпластическими процессами. К числу наиболее распространенных заболеваний данной категории относятся мастопатии, миомы матки, эндометриоз, аденомиоз, дисплазии шейки матки различной этиологии, а также гиперплазии щитовидной железы.

В структуре онкологической заболеваемости у женщин опухоли репродуктивных органов занимают первое место, и в среднем заболеваемость увеличивается на 1% в год. В структуре смертности они стоят на втором месте, при этом "темп прироста" по показателям смертности остается самым высоким (28%). По данным экспертов ВОЗ в настоящее время каждый год во всем мире регистрируется около миллиона новых случаев рака молочной железы (РМЖ), одна треть из которых заканчивается смертельным исходом. По оценкам ряда исследователей, в следующем десятилетии 5 млн женщин во всем мире будут страдать от данной злокачественной опухоли.

Известно, что ткани репродуктивных органов подвергаются непрерывному воздействию множества различных факторов, стимулирующих их к активному делению (пролиферации) и индуцирующих запуск специфических сигнальных каскадов. Среди них можно выделить три основных внутриклеточных механизма, приводящих к активации клеточной пролиферации: 1) гормональный (или эстроген-зависимый); 2) индуцируемый ростовыми факторами и 3) активируемый провоспалительными цитокинами.

Участие эстрогенов в развитии неопластических процессов в гормон-зависимых тканях (эпителий молочных желез, эндометрий и шейка матки) в настоящее время считается общепризнанным и рассматривается как один из ведущих этиологических факторов их возникновения.

Как известно, в тканях женской репродуктивной системы ежемесячно происходят колебания митотической клеточной активности, регулируемые ритмическими изменениями уровня половых гормонов. В первой (т.н. пролиферативной) фазе менструального цикла секретируемый яичниками эстроген индуцирует пролиферацию клеток эндометрия, гибнущих во время менструации. Аналогично, каждый менструальный цикл эстроген стимулирует пролиферацию внутреннего слоя эпителиальных клеток протоков молочных желез, которые впоследствии также подвергаются апоптозу. Всего в течение приблизительно 40-летнего репродуктивного периода в организме женщины осуществляется несколько сотен подобных циклов.

Попадая в клетку, эстроген (Е) активирует эстрогеновый рецептор (ER), находящийся в цитоплазме в неактивном состоянии. Взаимодействие гормона с рецептором активирует последний и способствует его проникновению в ядро. Попав в ядро, гормон-рецепторный комплекс стимулирует экспрессию т.н. эстроген-зависимых генов, среди которых большая часть прямо или опосредованно контролирует клеточную пролиферацию, а также повышает чувствительность клеток к факторам, активирующим гиперпластические процессы. Это гены, кодирующие рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), фактор роста кератиноцитов (KGF), регуляторы клеточного цикла - белки-циклины и циклин-зависимые киназы (CDK), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и множество других белков.

Регулярно повторяющиеся циклы эстроген-индуцированного клеточного деления могут двояко влиять на развитие опухолевого процесса в гормон-зависимых тканях. Во-первых, пролиферировать под действием эстрогенов могут уже малигнизированные (подвергнувшиеся действию внешнего канцерогена или имеющие набор герминальных мутаций) клетки, пролиферация которых приводит к формированию "опухолевого клона". Однако чаще всего имеет место другая ситуация. Периодически повторяющиеся циклы клеточного деления неизбежно повышают частоту появления новых, спонтанных мутаций (особенно с увеличением возраста женщины, а также при наличии других факторов риска). При условии накопления от 3 до 7 подобных генетических ошибок, не ликвидированных иммунной и/или репаративными клеточными системами, эстроген-зависимая пролиферация трансформированных клеток также приведет к образованию опухоли. При этом инициатор опухолевого процесса, в его традиционном понимании, во втором случае отсутствует.

В случае если в организме женщины имеется повышенное содержание одного из производных эстрогенов, а именно 16α-гидроксиэстрона, патологические пролиферативные процессы в гормон-зависимых тканях многократно усиливаются (Clemons M, Goss P. (2001) Estrogen and risk of breast cancer, N Engl J Med, 344 (4), 276-285). Именно поэтому повышенное содержание 16α-гидроксиэстрона рассматривается в настоящее время как фактор риска развития рака молочной железы.

Однако патологическая клеточная пролиферация может протекать и по эстроген-независимому механизму. В этом случае включаются сигнальные каскады, стимулируемые полипептидными ростовыми факторами и цитокинами.

Основным полипептидным фактором, стимулирующим рост клеток молочной железы, является эпидермальный фактор роста (EGF). Фактор EGF через последовательность сигнальных белков активирует ядерный фактор транскрипции NF-κВ - стимулятор экспрессии большого числа генов, ответственных за клеточную выживаемость и пролиферацию. Среди них - гены, кодирующие рецептор EGF (EGFR), фактор роста кератиноцитов (KGF), регуляторы клеточного цикла - циклин-зависимые киназы, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и многие другие белки.

Цитокиновый путь регуляции клеточного роста связан с фактором некроза опухоли TNF-α. В больших концентрациях этот цитокин активирует проапоптотические рецептор-опосредованные сигнальные каскады, т.е. останавливает процессы клеточного деления и вызывает физиологическую гибель клеток. Однако в малых дозах он же действует как фактор выживания и пролиферации клеток. При этом повышается активность циклооксигеназы-2 (СОХ-2) - основного фермента, участвующего в биосинтезе простагландинов и стимулирующего экспрессию фактора NF-κВ, который, как мы уже говорили, включает экспрессию генов, стимулирующих клеточное деление.

Таким образом, в настоящее время достаточно хорошо изучены патогенетические механизмы развития гиперпластических процессов в молочной железе. Очевидно, что, блокируя основные каналы проведения сигналов, стимулирующих пролиферацию клеток молочной железы, мы можем рассчитывать на успех в профилактике и лечении возникающих на этой основе патологических состояний. Другими словами, фармакологическая коррекция гиперпролиферативных заболеваний органов репродуктивной системы должна осуществляться на всех этапах и по отношению ко всем сигнальным каскадам, опосредующим ключевые патофизиологические функции.

Многолетние поиски природных соединений, блокирующих развитие гиперпластических процессов в гормон-зависимых тканях наконец увенчались успехом. Одно из таких соединений - содержащийся в овощах семейства крестоцветных (различных видах капусты) фитонутриент индол-3-карбинол (I3C). Противоопухолевая защита, оказываемая I3C, обусловлена широким спектром его биологических активностей. Один из механизмов противоопухолевого действия I3C заключается во взаимодействии данного вещества с арилкарбоновыми рецепторами (AhR), блокирующем связывание AhR с канцерогенами. Таким образом, I3C - это природный лиганд AhR. При активации AhR в результате его взаимодействия с I3C образованный лиганд-рецепторный комплекс проникает в ядро и способствует усилению экспрессии CYP1A1 - изоформы цитохрома Р-450, гидроксилирующей эстрон (метаболит эстрогена) во 2-м положении с образованием 2-гидроксиэстрона (2-ОНЕ1). Установлено, что данный метаболит обладает выраженной антипролиферативной (антиэстрогенной) активностью (Hong СВ, Kirn НА, Firestone GL, Bjeldanes LF (2002) 3,3'-Diindolyl-methane (DIM) induces a G(1) cell cycle arrest in human breast cancer cells that is accompanied by Sp1-mediated activation of p21(WAF1/CIP1) expression, Carcinogenesis, 23, 1297-1305). Изофермент CYP1A1 является индуцибельной формой и активируется в ответ на пищевые ингредиенты и сигаретный дым. В отсутствие I3C рецептор AhR активируется канцерогенными ариловыми углеводородами, поступающими в организм из окружающей среды или с продуктами питания (особенно с консервированной пищей), что способствует экспрессии CYPB1 - изоформы цитохрома Р-450, гидроксилирующей эстрон по 16α- и 4-положениям с образованием, соответственно, 16α-гидроксиэстрона (16α-ОНЕ1) и 4-гидроксиэстрона (4-ОНЕ1) (Smigel K (1998). Breast cancer prevention trial shows major benefit, some risk. J Nati Cancer Inst (Bethesda), 90, 647-648). Показано, что основной образующийся при этом метаболит 16α-ОНЕ1 способен ковалентно связываться с эстрогеновыми рецепторами, ядерными белками-гистонами и с ДНК, в результате чего происходит пролонгирование эстрогенной активности (эстроген-зависимого пролиферативного сигнала), а также инициация генотоксических повреждений ДНК. Таким образом, данные гидроксипроизводные эстрона являются сильнейшими канцерогенами для клеток-мишеней.

Таким образом, эстрадиол может превращаться в две метаболические формы - гидроксипроизводные эстрона - 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1, образующиеся посредством катализа разными изоферментами цитохрома Р-450 и обладающие абсолютно противоположными биологическими свойствами. 2-ОНЕ1 не влияет на пролиферацию клеток, в то время как 16α-ОНЕ1, наоборот, стимулирует клеточный рост и является агонистом эстрогена. Изучение функций этих двух метаболитов позволило выявить однозначную связь между уровнем 16α-ОНЕ1 и риском развития опухолей в эстроген-зависимых тканях. В то же время при повышении уровня 2-ОНЕ1 наблюдалась тенденция к гибели опухолевых клеток и профилактике их дальнейшего образования.

Многочисленные клинические исследования показали, что для поддержания нормального гормонального баланса как у пре-, так и у постменопаузальных женщин необходимо, чтобы концентрация 2-ОНЕ1 превышала концентрацию 16α-ОНЕ1 как минимум в два раза. При понижении данного соотношения статистически значимо возрастает риск возникновения РМЖ (Leong H, Firestone GL, Bjeldanes LF (2002). Cytostatic effects of 3,3'-diindolylmethane in human endometrial cancer cells result from an estrogen receptor-mediated increase in transforming growth factor-alpha expression, Carcinogenesis (bond), 22, 1809-1817; Patent WO 9203973 (1992). Onset of antiestrogen resistence in breast cancer).

В рандомизированных клинических исследованиях, проведенных в конце 90-х гг., было установлено, что у постменопаузальных женщин с диагнозом РМЖ отмечалось пониженное соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 по сравнению с соответствующим контролем. Более того, было показано, что пациенты с III и IV стадиями РМЖ имели более низкие соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1, чем пациенты с I и II стадиями заболевания (Huang CS, Chem HD, Chang KJ et al. (1999) Breast cancer risk associated with genotype polymorphism of the estrogen-metabolizing genes CYP17, CYP1A1, and COMT: a multigenic study on cancer susceptibility, Cancer Res, 59(19), 4870-4875).

Поскольку индол-3-карбинол непосредственно влияет на уровень 2-гидроксизстрона и 16α-гидроксиэстрона, измерение соотношения данных метаболитов может служить надежным маркером эффективности его действия. Стабильное превышение 2-гидроксиэстрона более чем в 2 раза на протяжении 1-3 месяцев на фоне приема I3С - показатель адекватной коррекции гормонального фона и терапевтической эффективности данного соединения.

Препараты на основе индол-3-карбинола в виде биологически активных добавок широко используются в США для коррекции дисгормональных нарушений. Первое клиническое исследование на эту тему ставило своей целью проверку гипотезы о возможности использования I3С для стимуляции образования производного эстрогена - 2-гидроксиэстрона (2-ОНЕ1) (Bradlow et al. (1994) Long-responses of women to indol-3-carbinol. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 7, 591-595). Авторы пришли к заключению о том, что I3С является эффективным средством для коррекции метаболизма эстрогенов.

В 1997 г. 60 женщин-волонтеров, проживающих в США, приняли участие в рандомизированных клинических исследованиях. Все участники были разделены на три группы: 1) контрольная группа, получавшая плацебо; 2) группа, получавшая низкие дозы I3С (50, 100 и 200 мг в день), и 3) группа, получавшая высокие дозы I3C (300 и 400 мг в день) в течение 4 недель. У всех женщин определяли соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 как биомаркер эффективности проводимой терапии. Результаты проведенных исследований позволили авторам сделать два важных вывода:

1. Ни в одном случае не отмечалось никаких побочных эффектов.

2. Минимальная суточная доза I3C, при которой наблюдалось изменение соотношения метаболитов эстрогена, составила 300 мг, на основании чего авторы рекомендуют для профилактики рака груди дозы I3C - 300-400 мг/сутки.

Годом позже Фондом профилактической онкологии были проведены клинические исследования, посвященные этому же вопросу. Женщины-волонтеры в возрасте от 35 до 47 лет в течение 2-х месяцев принимали I3С в дозе 400 мг в день. Измерение уровня 2-гидроксиэстрона (2-ОНЕ1) показало значительное увеличение данного метаболита в результате приема I3C, что свидетельствует о высокой терапевтической эффективности данного препарата в отношении коррекции гормонального фона.

В ходе многочисленных экспериментальных исследований была доказана универсальность противоопухолевой активности I3C, обусловленная способностью данного соединения блокировать все основные пути трансдукции внутриклеточных сигналов, стимулирующих клеточный рост, в том числе эстроген-независимые пролиферативные пути, активируемые ростовыми факторами и цитокинами.

Ростовые факторы, к каковым относятся эпидермальный фактор роста (EGF), фибробластический фактор роста (FGF), фактор роста кератиноцитов (KGF или FGF-7), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I) и др., в отсутствие какого-либо препятствия активируют специфические рецепторы, обладающие тирозинкиназной активностью. Лиганд-индуцируемая димеризация рецепторов активирует каскад цитоплазматических сигнальных киназ (MAPK, Akt), протоонкогенов (fos, ras), активаторов транскрипции (NF-κВ), что приводит к экспрессии лиганд-индуцируемых генов, среди которых - упоминавшиеся выше ростовые факторы и их рецепторы; киназы; факторы, стимулирующие образование новых сосудов; белки теплового шока; а также другие необходимые для опухолевого метаболизма белки.

Индол-3-карбинол, проникая в клетку, препятствует фосфорилированию тирозиновых остатков киназ, что мешает каскадной передаче пролиферативных сигналов с поверхности к ядру клетки (Chinni SR, Sarkar FH. (2002) Akt inactivation is a key event in indole-3-carbmol-induced apoptosis in PC-3 cells, Clin Cancer Research, 8, 1228-1236). Кроме того, он ингибирует ядерный фактор транскрипции NF-κВ, который является основным активатором транскрипции большого числа генов, вовлеченных в пролиферацию и воспаление (Brignall MS (2001) Prevention and treatment of cancer with indole-3-carbinol, AltemMedRev, 6(6), 580-589).

Есть данные, что I3C-опосредованное подавление пролиферативной активности опухолевых клеток сопровождается ингибированием активности белков-регуляторов клеточного цикла - циклинов D1 и Е и циклин-зависимых киназ (CDK2, CDK4 и CDK6), а также стимуляцией образования супрессоров опухолевого роста - белков р15, р21 и р27. При этом происходит остановка клеточного цикла в фазе G1 (Aggarwal BB, Ichikawa H. (2005) Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle, 4(9), 1201-1215; Cover CM, Hsieh SJ, Tran SH et al. (1998) Indole-3-carbinol inhibits the expression of cyclin-dependent kinase-6 and induces a G1 cell cycle arrest of human breast cancer cells independent of estrogen receptor signaling. Biol Chem, 273(7), 3838-3847; Garcia HH, Brar GA, Nguyen DH et al. (2005) Indole-3-carbinol (I3C) inhibits cyclin-dependent kinase-2 function in human breast cancer cells by regulating the size distribution, associated cyclin E forms, and subcellular localization of the CDK2 protein complex. JBiolChem, 280(10), 8756-8764; Kim YS, Milner JA. (2005) Targets for indole-3-carbinol in cancer prevention, J Nutr Biochem, 16(2), 65-73; Matsuzaki Y, Koyama M, Hitomi Т et al. (2004) Indole-3-carbinol activates the cyclin-dependent kinase inhibitor p15(INK4b) gene, FEBS Lett, 576(1-2), 137-140).

Еще одной уникальной особенностью I3C является его способность избирательно индуцировать в опухолевых клетках процессы программируемой клеточной гибели - апоптоза (Powles TJ. (1997) Efficacy of tamoxifen as treatment of breast cancer. Semin Oncol, 24(1), S1-48-54. При этом одновременно с проявлением апоптотической активности I3C наблюдается ингибирование активности антиапоптотических белков - Bcl-2, Bcl-xL, сурвивина, IAP (inhibitor-of-apoptosis protein), XIAP (X chromosome-linked IAP) и FLIP (Fas-associated death domain protein-like interleukin-1-beta-converting enzyme inhibitory protein).

Кроме того, есть данные, указывающие на антиоксидантные свойства I3C, а также на его способность подавлять ангиогенные, инвазивные и миграционные процессы при канцерогенезе в молочных железах (McCarty MF, Block KI. (2005) Multifocal angiostatic therapy: an update. Integral Cancer Ther, 4, 301-314; Meng Q, Goldberg ID, Rosen EM, Fan S. (2000) Inhibitory effects of Indole-3-carbinol on invasion and migration in human breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat, 63(2), 147-152; Wu HT, Lin SH, Chen YH. (2005) Inhibition of cell proliferation and in vitro markers of angiogenesis by indole-3-carbinol, a major indole metabolite present in cruciferous vegetables. JAgric Food Chem, 53(13), 5164-5169).

Таким образом, I3C является универсальным корректором патологических пролиферативных процессов в органах женской репродуктивной системы. Универсальность противоопухолевого действия I3C обусловлена способностью данного соединения блокировать все основные (гормон-зависимые и гормон-независимые) пути трансдукции внутриклеточных сигналов, стимулирующих клеточный рост, а также индуцировать избирательный апоптоз (программированную клеточную гибель) опухолевых клеток. I3C является поистине уникальным соединением, поскольку способен подавлять развитие опухолевого процесса практически на всех его уровнях: субмолекулярном (активация опухоль-супрессорных генов и супрессия генов, стимулирующих онкогенез), молекулярном (блокировка пролиферативных сигналов на всем их протяжении - от рецепторов до ядерных белков и ДНК) и надмолекулярном (торможение процессов клеточной миграции и инвазии).

Перечисленные фармакологические свойства индол-3-карбинола позволяют считать данное вещество весьма перспективным кандидатом для создания на его основе лекарственных средств. Однако I3C является очень нестабильным соединением и при попадании в кислую среду желудка очень быстро превращается в несколько олигомерных производных, основным из которых является его димерная форма - 3,3'-дииндолилметан (ДИМ, DIM) (Arneson DW, Hurwitz A, McMahon LM et al. (1999) Presence of 3,3'-diindolylmethane in human plasma after oral administration of indole-3-carbinol [abstract 2833], Proc Am Assoc Cancer Res 40, 429; Grose KR et al. (1992) Oligomerization of indole-3-carbinol in aqueous acid. Chem Res Toxicol, 5, 188-193). Именно поэтому, несмотря на многочисленные эффекты I3C in vivo, до настоящего времени нет полной ясности в отношении их истинного источника, т.е. по-прежнему открытым остается вопрос, связаны ли биологические свойства I3C непосредственно с его собственным действием на клеточные мишени или это результат активности продуктов конденсации и окисления индол-3-карбинола, в частности дииндолилметана (ДИМ, DIM).

В то же время известно, что клинический эффект, оказываемый I3C при тех или иных патологиях, существенно зависит от индивидуальных особенностей метаболизма принимающих данный препарат пациентов, в частности от способности конвертировать I3C в различные его производные, между которыми в свою очередь возможны синергетические и/или антагонистические взаимодействия (Dalessandri KM, Firestone GL et al. (2004) Pilot study: effect of 3-Diindolylmethane supplements on urinary hormone metabolites in postmenopausal women with a history of early-stage breast cancer. Nutrition and cancer, 50(2), 161-167). Одновременно с этим есть экспериментальные данные, указывающие на самостоятельную биологическую активность I3C, независимую от биологической активности образующихся в результате его олигомеризации метаболитов (Anderton MJ, Manson MM, Verschoyle RD et al. (2004) Pharmacokinetics and tissue disposition of indole-3-carbinol and its acid condensation products after oral administration to mice. Clin Cancer Research, 10, 5233-5241; Hsu JC, Zhang J, Dev A et al. (2005) Indole-3-carbinol inhibition of androgen receptor expression and downregulation of androgen responsiveness in human prostate cancer cells. Carcinogenesis, 26(11), 1896-1904).

Как уже упоминалось, индол-3-карбинол претерпевает многочисленные превращения, в частности, кислая среда желудка способствует образованию различных производных, окончательная биологическая активность которых до настоящего времени не определена (Anderton M., Manson M. et al. (2004) Pharmacokinetics and tissue disposition of indole-3-carbinol and its acid condensation products after oral administration to mice, Clin Cancer Research, 10, 5233-5241). Этот процесс плохо предсказуем и протекает очень индивидуально у каждого пациента. Возможно, именно этим объясняется выраженный разброс в клинической эффективности препаратов на основе индол-3-карбинола при лечении заболеваний гормон-чувствительных органов.

Вероятно, столь существенные различия в результатах лечения индол-3-карбинолом могут объясняться индивидуальными особенностями метаболизма этого вещества у пациентов.

Одним из производных индол-3-карбинола, образующимся при его олигомеризации, является дииндолилметан (DIM). Это соединение обладает практическими всеми биологическими эффектами, присущими индол-3-карбинолу, в том числе и способностью позитивно влиять на изменения в соотношении метаболитов эстрогенов (Michnovicz JJ and Bradlow HL. (1991) Altered estrogen metabolism and excretion in humans following consumption of indole-3-carbinol. Nutr Cancer, 16, 59-66; Aggarwal BB, Ichikava H. (2005) Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle, 4(9), 1201-1215). При этом DIM не подвергается метаболическим превращениям в организме человека и является стабильным химическим соединением (Anderton М, Manson M et al. (2004) Physiological modeling of formulated and crystalline diindolylmetane pharmacokinetics following oral administration in mice. Drug metabolism and Disposition, 32, 6, 632-638). Эти отличия индол-3-карбинола от дииндолилметана делают использование DIMa более предпочтительным в фармацевтических композициях с другими фармакологически активными субстанциями при лечении гиперпластических и пролиферативных заболеваний.

Дииндолилметан может использоваться при различных воспалительных заболеваниях (WO 2006105196, опубл. 2006-10-05).

Установлено, что дииндолилметан способен индуцировать проапоптотическую гибель клеток с нарушенным метаболизмом. В частности, DIM активирует один из ключевых ферментов апоптоза, каспазу-8, вызывая гибель трансформированных клеток рака кишечника (Kim EJ, Park SY et al. (2007) Activation of caspase-8 contributes to Diindolylmethane-induced apoptosis in colon cancer cells, J of Nutrition, 137, 31-36). Мы предположили, что способность DIM активировать механизмы апоптоза может распространяться и на клетки, инфицированные внутриклеточными микроорганизмами. В частности, Clamydia Trachomatis. Хламидийная инфекция имеет весьма широкое распространение и, по мнению многих авторов, является одной из основных причин женского бесплодия. Традиционным методом лечения хламидийных цервицитов является терапия антибиотиками. Однако почти в 30-40% после завершения курса лечения не удается добиться полной иррадикации возбудителя, что приводит к рецидивированиию заболевания. Дело в том, что жизненный цикл Clamydia Trachomatis состоит из различных стадий, одна из которых «тельца включения» обладает устойчивостью к антибиотикам. Этот факт объясняет недостаточную эффективность терапии антибиотиками.

Первая убедительная попытка описать клинические эффекты при использовании дииндолилметана была предпринята на примере модифицированного DIM с повышенной биодоступностью на основе пегилированного витамина Е (TPGS) (Anderton MJ, Manson MM et al. (2004) Phsiological modeling of formulated and crystalline Diindolylmethane pharmacokinetics following oral administration in mice. Drug metabolism and Disposition, 32, 6, 632-638), известного своей способностью увеличивать водную растворимость различных соединений (Соnstantinides РР, Tustian A, Kessler DR. (2004) Tocol emulsions for drug solubilization and parenteral delivery, Adv Drug Deliv Rev, 56, 1243-1255) и усиливать их биологическую доступность при пероральном введении (Wu SH, Hopkins WK. (1999) Characteristics of d-α-tocopheryl PEG 1000 succinate for applications as an absorption enhancer in drug delivery systems, Pharm Technol, 23. 52-68).

На основе этой технологии американская компания Bioresponse производит препарат, известный под названием BR-DIM. Изучение фармакокинетики этого препарата на здоровых волонтерах показало, что при разовой дозировке 50 мг в крови пациентов не удается обнаружить DIM. При дозировании 100 и 200 мг максимальная концентрация DIM в плазме составляла соответственно 32 нг/мл и 104 нг/мл. Дальнейшее увеличение дозы препарата не приводило к увеличению концентрации DIM в плазме волонтеров (Reed GA, Sunega JM, Sullivan DK et al. (2008) Single-dose pharmacokinetics and tolerability of absoption-enhanced 3,3-diindolylmethane in healthy subjects. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 17(10), 2619-2624). Концентрация 104 нг/мл примерно соответствует 0,5 мкм DIM. Эта концентрация находится на нижней границе концентраций DIM, при которой in vitro регистрируются биологические эффекты (Rahman KM, Li Y et al. (2006) Gene expression profiling revealed as target of diindolylmethane-induced cell growth inhibition and apoptosis in breast cancer cells. Cancer Res 66(9), 4952-4959; Fan S, Meng Q et al. (2009) Low concentration of diindolylmethane, a metabolite of indole-3-carbinol, protect against oxidative stress in a BRCA1-dependent manner. Cancer Res 69(15), 6083-6091).

Исследователями предпринимались попытки создания форм с повышенной абсорбцией дииндолилметана.

В частности, известен патент США 6689387, опубликованный 10.02.2004, описывающий микрочастицы I3C или 3,3'-дииндолилметана в крахмальной матрице, в том числе в виде твердых лекарственных форм для орального введения. Данные формы содержат 30-70% крахмала, что, повышая растворимость активного вещества, не обеспечивает достаточной стабильности в процессе хранения.

Известны формуляции DIM на основе пегилированного витамина Е, описанные в патенте Zeligs et al, US patent 6.416.793. Однако использование композиций на основе TPGS позволило добиться только очень небольшого (не более чем в 1,5-2 раза) увеличения биологической доступности DIM, его аналогов и производных, что не позволяет в полной мере использовать терапевтический потенциал этих соединений. Кроме того, технология изготовления препарата предполагает использование распылительной сушки, что является весьма энергоемким процессом и удорожает его производство.

Наиболее близким аналогом (прототипом) данного изобретения является решение, описанное в международной заявке WО 2009032699, касающееся фармацевтических композиций на основе антипролиферативной комбинации дииндолилметана (DIM), полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и фолиевой кислоты. Недостатком данных композиций является недостаточная стабильность, так как при хранении наблюдается выпадение основного вещества в виде мелких кристаллов. Кроме того, в условиях дефицита омега-3 жирных кислот у большинства населения, эффекты от использования выделенных ПНЖК могут проявиться как чрезмерные. Включение фолиевой кислоты по последним данным нежелательно для детей с воспалительными заболеваниями аутоиммунного типа.

Следует отметить, что индольные производные доказали свою эффективность в педиатрической практике (Wiatrak BJ. (2003) Overview of recurrent respiratory papillomatosis, Curr Opm Otolaryngol Head Neck Surg, 11, (6), 433-441; Auborn KJ. (2002) Therapy for recurrent respiratory papillomatosis. Antiviral therapy, 7(1), 1-9). В частности, индол-3-карбинол и дииндолилметан широко используются при лечении детского респираторного папилломатоза гортани. При использовании твердых лекарственных форм возникают трудности с дозированием препарата. Клиническая практика нуждается в жидких лекарственных формах, которые позволят точно дозировать препарат из расчета 1 мг на 1 кг веса.

Задачей изобретения является следующее:

1) разработать лекарственные формы на основе дииндолилметана, эффективные при лечении хронических воспалительных и гиперпластических процессов, обладающие максимальной биодоступностью и обеспечивающие достижение концентрации активного вещества в крови пациентов, существенно превышающей 200 нг в мл крови;

2) разработать жидкую лекарственную форму дииндолилметана, удобную для дозирования препарата в педиатрической практике.

Задача решается новой лекарственной формой 3,3'-дииндолилметана.

Новая форма представляет собой раствор, содержащий активное начало - 3,3'-дииндолилметан, и носитель из рыбьего жира и, по меньшей мере, один полисорбат при следующем содержании компонентов в мас.%:

3,3'-дииндолилметан	1-20
рыбий жир	10-20
полисорбат	остальное

Максимальная биодоступность и стабильность при хранении достигается за счет подобранного носителя из рыбьего жира и полисорбатов, взятых в определенных количествах.

Полисорбаты - это поверхносто-активные вещества (ПАВ), которые являются эмульгаторами и солюбилизаторами (растворителями) жиров, как правило, для средств на водной основе. Номера полисорбатов (20, 40, 60, 80) связаны с типом жирных кислот, соединенных с частью молекул (кислот из кокосового масла - полисорбат 20, пальмового - полисорбаты 40 и 60, оливкового - полисорбат 80). Согласно изобретению могут использоваться любые полисорбаты или их смеси. Предпочтительно использование полисорбата 80 или полисорбата 20.

В рыбьем жире полиненасыщенные жирные кислоты, имеющие способность к конкурентному с арахидоновой кислотой биосинтезу преимущественно вазодилатирующих простагландинов и лейкотриенов, обладающих меньшей тромбогенной активностью /ЭПК и ДГК/, находятся в недостаточной концентрации для проявления собственно терапевтического эффекта, поэтому использование их в качестве носителя приводит к повышению биодоступности ДИМ, но не приводит к нежелательным эффектам.

Раствор может быть расфасован во флаконы темного стекла. Также раствор может быть помещен в капсулы. Традиционно лекарственные формы на основе масел фасуют в мягкие желатиновые капсулы. Однако такие капсулы пропускают воздух, ДИМ постепенно окисляется, что может сопровождаться снижением концентрации основного вещества. Именно поэтому предпочтительно использование твердых желатиновых капсул, покрытых гидроксипропилметилцеллюлозой или ее фталатом. Например, могут быть использованы капсулы Licaps, разработанные компанией Capsulgel. В эти капсулы можно фасовать растворы под аргоном с последующей запайкой капсул с помощью лазера.

Предлагается также применение лекарственного средства для лечения гиперпастиче-ских и воспалительных заболеваний человека. Примерами заболеваний, при которых полезно назначение данного средства, являются: миома, аденомиоз, гиперплазия щитовидной железы, атопический дерматит, болезнь Крона и другие воспалительные заболевания кишечника, папилломатоз гортани, хламидийные цервициты. Предпочтительно средство вводят из расчета 0,5-2 мг 3,3'-дииндолилметана на кг веса пациента. Однако в зависимости от тяжести заболевания, возраста, пола, сопутствующих патологий дозы могут быть увеличены или уменьшены.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Способ получения растворимой лекарственной формы дииндолилметана, обладающего повышенной биодоступностью (DIM-High Bioavailability (DIM-HB)).

К полисорбату (или смеси полисорбатов) добавляют рыбий жир в количестве 10-20% от общей массы композиции и полученную смесь тщательно перемешивают до получения однородной жидкости. В полученный раствор вносят субстанцию дииндолилметана 1-20% (10-200 мг вещества на 1 г композиции) и перемешивают до ее полного растворения. Полученный раствор фасуют по специальным капсулам или флаконам из темного стекла.

Пример 2

Лекарственные формы на основе дииндолилметана

А. Капсулы, содержащие 100 мг дииндолилметана. Рыбий жир 100 мг, полисорбат 80 - 400 мг.

Б. Капсулы, содержащие 50 мг дииндолилметана. Рыбий жир 50 мг, полисорбат 80 - 400 мг.

С. Капсулы, содержащие 20 мг дииндолилметана. Рыбий жир 80 мг, полисорбат 80 - 450 мг.

Д. Флаконы из темного стекла объемом 10 мл, содержащие раствор, с концентрацией ДИМ 10 мг на 1 г раствора, 10% рыбьего жира и полисорбат 20 в смеси с полисорбатом 40 - остальное.

Е. Флаконы из темного стекла, объемом 50 мл, содержащие раствор с концентрацией ДИМ 100 мг на 1 г раствора, 15% рыбьего жира и полисорбат 80 - остальное.

Пример 3

Экспериментальное изучение специфической фармакологической активности предлагаемого средства в условиях in vivo

За 1 неделю до прививки опухолевых клеток самкам бестимусных (nu/nu) линейных мышей C57Black/6 имплантировали в подлопаточную область пилюлю, содержащую 0,72 мг эстрадиола, из которой гормон высвобождается в течение 60 дней.

Для индукции солидных опухолей опухолевые клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 собирали с помощью 0,05% раствора Трипсин-ЭДТА ("Sigma", США), трижды промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) и затем в количестве 3 млн клеток в 0,1 мл физиологического раствора вводили подкожно каждому экспериментальному животному в боковую область (число живых клеток подсчитывали с помощью красителя трипанового синего (0,1%) и светового микроскопа).

Через 24 час после инокуляции ксеногенных опухолевых клеток молочной железы животным из опытной группы (10 животных в группе) начинали вводить внутрижелудочно (с помощью зонда) предлагаемое средство по примеру 2, пункт Д, в количестве, эквивалентном 1 мг на одну мышь ежедневно. Контрольным животным вводили физиологический раствор.

Размер солидных опухолей измеряли 1 раз в 2-3 дня после ее появления.

Количественное определение уровня DIM в плазме крови у мышей линии С57Вlаck/6 осуществляли методом HPLC (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе "System Gold" (Beckman, США) с УФ-детектором с переменной длиной волны.

Для получения образцов крови животным из опытной группы вводили внутрижелудочно (с помощью зонда) предлагаемое средство в количестве, эквивалентном 250 мг DIM/кг (всего 36 животных в группе) и индивидуальное вещество I3C в количестве 250 мг DIM/кг (30 животных в группе). Контрольным животным вводили физиологический раствор. Через 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 4,0; 6,0; 12,0; 18,0; 24,0 и 36,0 ч после введения предлагаемого средства и через 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 4,0; 6,0; 12,0 и 24,0 ч после введения индивидуального вещества DIM у экспериментальных животных (по 3 животных для каждой временной точки) из хвостовой вены гепаринизированным шприцем осуществляли забор периферической крови. Каждый образец крови помещали в пробирку, содержащую гепарин. Пробы крови центрифугировали (10000×g, 5 мин), после чего отбирали по 1,5-2,0 мл плазмы, замораживали и хранили при -20°С.

Непосредственно перед проведением HPLC-анализа в опытные образцы плазмы крови объемом 250 мкл добавляли внутренний стандарт - 4-метокси-индол (IS) (2,5 мкл раствора концентрации 0,4 мг/мл), перемешивали с помощью Vortex и оставляли при комнатной температуре на 30 мин, после чего образцы дважды экстрагировали с помощью третбутилметилового эфира (750 мкл).

В каждом образце органическую фазу отделяли от водной центрифугированием (2800×g, 10 мин) и переносили ее в новую 4 мл пробирку. Органические слои образцов для каждой экспериментальной точки объединяли, эфир упаривали в токе азота, к осадку добавляли 150 мкл элюента (ацетонитрил/50 mМ Hepes-буфер (объемное соотношение 40:60; рН 7,4)) и 50 мкл полученного образца вводили в хроматограф.

Аналогичные процедуры проводили с контрольными образцами плазмы крови, в которые затем были внесены заданные количества дииндолилметана в диапазоне концентраций:

для: 0,05-10,0 мкг/мл.

Количественное определение дииндолилметана в плазме крови проводили на жидкостном хроматографе "System Gold" (Beckman, США) с УФ-детектором при длине волны 280 нм.

Жидкостная хроматография производилась при комнатной температуре (22°-24°С) на колонке Nucleosil, С18,5 мкм (4,6×50 мм). Элюент (подвижная фаза) состоял из воды и ацетонитрила (АЦ). Перед хроматографированием подвижную фазу дегазировали и фильтровали. Элюция осуществлялась градиентом концентрации АЦ по следующей схеме: 1) от 15% до 60% АЦ в течение первых 20 мин; 2) линейный градиент АЦ от 60% до 65% с 20 по 40 мин; 3) линейный градиент АЦ от 65% до 85% с 40 по 65 мин; 4) повторное уравновешивание колонки 15% АЦ в течение 5 мин. Суммарная продолжительность элюции составляла 70 мин, скорость элюирования - 1 мл/мин.

Концентрацию DIM в экспериментальных образцах определяли по калибровочным графикам, отражающим зависимость между концентрациями данных веществ в пробе и площадями хроматографических пиков.

Минимальная чувствительность метода HPLC-анализа составила 0,05 мкг/мл.

Противоопухолевую эффективность данных соединений оценивали, определяя объем солидной опухоли в опытной и контрольной группах животных.

Как видно из Фиг.1, начиная приблизительно с 12 дня от начала эксперимента у животных контрольной группы, не получавших предлагаемого средства, отмечался интенсивный рост солидных опухолей. В течение последующих 20 дней (с 14 по 34 день эксперимента) средний размер опухоли, индуцированной клетками аденокарциномы человека линии MCF-7, увеличился ~ в 10 раз. В то же время средний объем опухоли у животных, получавших предлагаемое средство, за тот же промежуток времени увеличился всего в 5 раз.

Таким образом, ведение бестимусным (nu/nu) мышам C57Black/6 предлагаемого средства в дозе 1 мг