Способ выявления неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов, принимавших наркотические или психоактивные вещества

Способ выявления неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов, принимавших наркотические или психоактивные вещества

Реферат

Изобретение относится к газохроматографическому анализу различных химических соединений и может быть использовано в медицине, биологии, экологии и допинговом контроле.

Известен способ анализа жидких препаратов на основе растительного сырья методом хроматографии, который включает извлечение летучих веществ отгонкой исходной пробы паром, концентрированно летучих веществ экстракцией низкокипящим растворителем с последующей отгонкой растворителя и, наконец, собственно определение компонентов методами газовой или жидкостной хроматографии [1].

Недостатком указанного технического решения является невысокая информативность получаемых данных, в частности хроматографических спектров, что препятствует однозначной идентификации химических соединений и их фрагментов в произвольных комбинациях.

Известен также способ хроматографической идентификации компонентов сложных смесей органических соединений, включающий пропускание вещества через систему последовательно соединенных колонок, заполненных сорбентом различной полярности, отбор пробы после каждой колонки, детектирование на детекторах различных типов и идентификацию определяемого вещества расчетом коэффициента чувствительности и относительного удерживания по данным двух детекторов [2].

К недостаткам указанного способа следует отнести сложность процедуры анализа, а также вероятность получения недостоверных результатов при расчетах значений удерживания разных колонок.

Известен также способ идентификации неизвестных веществ методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. По указанному способу регистрируют хроматограмму как функцию времени удерживания и регистрируют масс-спектр в период времени, соответствующий выходу вещества из колонки, и сравнивают с масс-спектрами известных веществ, находящимися в базе данных, далее определяют индекс удерживания и сравнивают его с таковыми из базы данных и идентифицируют вещество по двум параметрам - масс-спектру и индексу удерживания [3].

Недостатком указанного способа, несмотря на привлекательность использования индекса удерживания, является высокая вероятность получения недостоверных результатов анализа, поскольку индексы удерживания изначально привязаны к конкретной колонке с определенными параметрами и зачастую либо не воспроизводятся, либо воспроизводятся на другом оборудовании с искажением, что может привести к недостоверной интерпретации результатов анализа.

Наиболее близким аналогом к заявляемому техническому решению является способ осуществления масс-спектрального анализа многокомпонентной системы, заключающийся в регистрации масс-спектров образца, деконвалюции масс-спектров и ассоциированных с ними хроматограмм одного вещества, и распознавание сравнением со справочным спектром вещества, сравнением интенсивностей пиков и времени удерживания распознанных веществ с предварительно определенными параметрами искомого вещества с подтверждением распознавания [4].

Недостатком указанного способа является низкий порог чувствительности определения, заключающийся в том, что он не позволяет определять исследуемые вещества при низких концентрациях, и вытекающая из этого высокая вероятность получения недостоверных результатов анализа при таком двухстадийном распознавании.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является обеспечение возможности однозначной идентификации химических соединений и их фрагментов в произвольных комбинациях при одновременном повышении точности и оперативности определения.

Поставленный технический результат достигается тем, что готовят три пробы исследуемого образца биологической жидкости - первую путем экстракции с перерастворением, вторую путем кислотного гидролиза и третью путем ферментативного гидролиза, причем первую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 15°С/мин и данные анализируют путем сравнения с базой данных, по которой выявляют признаки неизвестного вещества (НВ), а именно - спектры с m/z, совпадающими с базовыми ионами действовавшего на пациента наркотического или психоактивного вещества и его метаболитов и содержание НВ в пробе, вторую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 25°С/мин и третью пробу подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°С/мин и при увеличении содержания НВ в последних двух пробах по сравнению с первой, подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°C/мин действовавшее на пациента наркотическое или психоактивное вещество на присутствие в нем НВ, и при его отсутствии в базовом веществе, проверяют присутствие НВ в интактной биологической жидкости, для чего пробу ее готовят путем кислотного гидролиза и подвергают ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°C/мин и 25°C/мин и в случае обнаружения НВ в интактной биологической жидкости его квалифицируют как эндогенное, а при отсутствии признаков - аликвоту первой пробы, смешивают с пробой интактной биологической жидкости, готовят пробу путем кислотного гидролиза смеси, подвергают пробу ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°C/мин и 25°C/мин, определяют содержание НВ по результатам обоих режимов анализа и сравнивают его с содержанием НВ в первой пробе и при совпадающих значениях содержания НВ в указанных трех пробах квалифицируют НВ как новый, ранее неизвестный продукт метаболизма наркотического или психотропного вещества.

Следует отметить, что заявляемый способ также может быть осуществлен с использованием аналитической системы ВЭЖХ-МС/МС, поскольку принципиальными положениями заявляемого технического решения являются пробоподготовка, проведение анализа в различных режимах кондиционирования параметров по градиенту температуры, выбор объектов анализа и последующая идентификация определяемых веществ сопоставлением результатов анализа с базовыми данными эталонных веществ.

В качестве биологической жидкости используют кровь, мочу, слюну, водные экстракты дезинтегрированных органов и тканей и т.п.

В качестве аналитической системы ГХ-МС могут быть использованы, например, хромато-масс-спектрометр с квадрупольным анализатором Agilent-5973, соединенным с газовым хроматографом модели Agilent-6890.

В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы:

- автоматический шейкер фирмы Glas-Col^®, США - для ЖЖЭ;

- центрифуга марки Rotina 46R фирмы Hettich, (ФРГ) для получения контрастной поверхности раздела между органической и водной фазами;

- вакуумный концентратор фирмы Barnstead Inc. (США) для упаривания органического экстракта;

- колонки HP-5MS и VF-5MS для хроматографического разделения.

Разумеется, для реализации заявленного изобретения могут быть использованы и другие приборы и устройства с характеристиками, аналогичными вышеуказанным.

В качестве газа-носителя может быть использован гелий, азот или водород.

В качестве внутренних стандартов (ВС) используют дифениламин или др. подходящее соединение.

Ионизацию осуществляют методом электронного удара в вакууме. Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации полного сканирования или по выбранным ионам.

Обработку данных проводят с применением программы автоматической обработки AMDIS и баз данных.

В принципе, поиск и обнаружение необходимо осуществлять для того, чтобы найти новые, неизвестные ранее метаболиты, которые могут явиться потенциально активными и соответственно отвечать за побочные действия препарата, например кетамина, или же могут в случае того же кетамина явиться основой для разработки новых анестетиков.

Что касается порядка действий при осуществлении заявляемого технического решения, то авторы, основываясь на своих знаниях и опыте, полагают целесообразным осуществлять поиск в следующей последовательности:

- поиск и обнаружение неизвестного вещества (ГХ-МС анализ пробы исследуемой биологической жидкости при градиенте температуры 15°С/мин);

- выявление влияния параметров проведения анализа на образование неизвестного вещества (ГХ-МС анализ кислотного гидролизата пробы исследуемой биологической жидкости при градиенте температуры 25°С/мин);

- выявление конъюгатов (ГХ-МС анализ ферментативного гидролизата пробы исследуемой биологической жидкости при градиенте температуры 15°С/мин);

- выявление неизвестного вещества как примеси или продукта распада наркотического или психоактивного вещества (ГХ-МС анализ пробы наркотического или психоактивного вещества при градиенте температуры 15°С/мин);

- выявление неизвестного вещества в интактной жидкости (ГХ-МС анализ кислотного гидролизата пробы интактной биологической жидкости при градиенте температуры 15°С/мин и 25°С/мин);

- подтверждение происхождения неизвестного вещества из исследуемой биологической жидкости (ГХ-МС анализ кислотного гидролизата смеси проб исследуемой и интактной биологической жидкости при градиенте температуры 15°C/мин и 25°C/мин).

Изобретение может быть осуществлено следующим образом.

Предварительно, для создания библиотеки (базы данных) готовят растворы веществ-эталонов (они же наркотические и/или психоактивные вещества) в органических растворителях. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики веществ-эталонов (детектируют не менее трех характеристических ионов каждого эталонного вещества, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения).

Готовят раствор внутреннего стандарта, далее проводят пробоподготовку, при которой в образец исследуемой биологической жидкости вводят раствор внутреннего стандарта, доводят рН образца до 9,0 твердым буфером, проводят жидкостно-жидкостную экстракцию смесью органических растворителей различной полярности, органический слой выпаривают досуха в токе азота, перерастворяют в этилацетате и далее разделяют пробу на два аналита, первый из которых вводят в систему ГХ-МС. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики пробы. Полученные результаты анализа сравнивают с базой данных и выявляют признаки неизвестного вещества (НВ). Далее готовят вторую и третью пробы исследуемой биологической жидкости кислотным и ферментативным гидролизом соответственно и также вводят их в систему ГХ-МС, снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики проб. Полученные результаты анализа сравнивают с базой данных, и по признакам НВ определяют содержание его в каждой пробе. Затем проверяют вероятность присутствия НВ в самом наркотическом или психоактивном веществе, для чего готовят пробу указанного вещества путем экстракции и вводят ее в систему ГХ-МС, снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики пробы и определяют наличие НВ. Далее путем кислотного гидролиза готовят пробу интактной биологической жидкости, вводят ее в систему ГХ-МС и снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики пробы в двух режимах кондиционирования по градиенту температуры, и затем экстрагируют пробу интактной биологической жидкости, смешивают ее со вторым аналитом пробы исследуемой биологической жидкости, подвергают смесь кислотному гидролизу и полученную таким образом пробу вводят в систему ГХ-МС, снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики пробы также в двух режимах кондиционирования по градиенту температуры. Далее сравнивают, исходя из результатов анализов, содержание НВ во всех пробах и на основании соотношения содержания его квалифицируют НВ по происхождению.

Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующими примерами его конкретного осуществления.

Пример 1.

Определение продуктов метаболизма кетамина.

А. Подготовка эталонного образца и анализ пробы.

В качестве внутреннего стандарта используют дифениламин, который добавляют к анализируемым пробам до концентрации 2 мг/дм³. К 1 мл исследуемой эталонной жидкости добавляют внутренний стандарт до концентрации 2 мг/л и экстрагируют 1 мл смеси гексан/диэтиловый эфир 1:1. Экстракт упаривают, добавляют 100 мкл этилацетата и 1 мкл пробы вводят в хроматограф.

Анализ проводят на хромато-масс-спектрометрической системе Agilent 6890/5973N с масс-селективным детектором (регистрируют масс-спектр квадрупольный и масс-спектр «ионная ловушка»). Температура узла ввода пробы - 280°C, аналитического интерфейса 240°C. Разделение проводят на кварцевой капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки НФ 0,25 мкм. Температурная программа: 70°C (1 мин), 20°C/мин, 280°C. Скорость потока газа-носителя 0,62 мл/мин, средняя линейная скорость газа-носителя 29 см/сек. Объем вводимой пробы 1 мкл. Регистрацию сигнала проводят по полному ионному току (SCAN) в диапазоне масс m/z 29-550 а.е.м. Количественный анализ проводят по выбранным ионам.

Быстрая ГХ программа: 100°C, 1 мин выдержки, (25°C/мин); 300°C (15 мин). Время удерживания внутреннего стандарта составляет 4,52 мин.

Плавная ГХ программа: 50°C; 0,5 мин выдержки; 99°C/мин; 100°C (1 мин); (15°C/мин); 280°C (35 мин). Время удерживания внутреннего стандарта составляет 9,27 мин.

Б. Подготовка пробы и анализ исследуемой биологической жидкости (моча пациента, принимавшего кетамин).

К образцу мочи (5 мл) добавляют 5 мкл раствора внутреннего стандарта, содержащего дифениламин (100 мкг/мл), 0,1 г твердого буфера, 5,0 г сульфата аммония и 5 мл диэтилового эфира, перемешивают в течение 2 минут, далее центрифугируют при 1000 об/мин, в течение 5 мин, органический слой отделяют, упаривают досуха в токе азота при 40°C и перерастворяют сухой остаток в 50 мкл этилацетата, разделяют на четыре аликвоты, первую из которых вводят в систему ГХ-МС. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики пробы (детектируют не менее трех характеристических ионов каждого эталонного вещества, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения): отбирают по 5 мкл раствора и вводят в систему ГХ-МС с ионизацией электронным ударом в вакууме. Анализ ведут как в части «А» по плавной программе (15°C/мин). Результаты анализа в сравнении с базой данных (кетамин, норкетамин) представлены в Таблице 1.

Таблица 1
Базовое вещество	Содержаниев пробе	Время удерживания	Масс-спектр квадрупольный	Масс-спектр «ионная ловушка»	Молекулярная масса
Кетамин	-	11,40	237[M+] 1, 20923, 18099, 16611, 15217, 11513	238[M+H]+ 25, 20912, 18099, 16640, 15220, 11515,	237
Норкетамин	-	11,10	223[M+] 1, 19522, 16699, 13814, 13116, 11513, 10212	224[M+H]+ 50, 19520, 16699, 13132, 13816, 11518, 10240	223
неизвестное вещество	10 нг/мл	9,94	208[M+] 1, 17399, 14510, 12997, 13829	209[M+H]+ 80, 17399, 14525, 12940, 1385, 11535	208

Далее во вторую аликвоту пробы вводят соляную кислоту, смесь гидролизуют и гидролизат вводят в систему ГХ-МС. Анализ ведут по быстрой программе (25°C/мин). Третью аликвоту пробы подвергают ферментативному гидролизу и гидролизат вводят в систему ГХ-МС. Анализ ведут по плавной программе (15°C/мин). Далее готовят пробу базового вещества - кетамина. Растворяют кетамин в этилацетате, к 1 мл раствора добавляют внутренний стандарт до концентрации 2 мг/л и экстрагируют 1 мл смеси гексан/диэтиловый эфир 1:1. Экстракт упаривают, добавляют 100 мкл этилацетата и 1 мкл пробы вводят в хроматограф. Анализ ведут по плавной программе (15°C/мин). Далее готовят пробу интактной биологической жидкости (моча человека, не принимавшего кетамин) кислотным гидролизом, как указано выше, гидролизат анализируют по плавной и быстрой программам (15°C/мин и 25°C/мин). Далее негидролизованную пробу интактной биологической жидкости смешивают с четвертой аликвотой пробы исследуемой биологической жидкости, гидролизуют соляной кислотой, как указано выше, и гидролизат анализируют по плавной и быстрой программам (15°C/мин и 25°C/мин). Результаты анализов представлены в Таблице 2.

Таблица 2
№ п/п	Объект анализа	Режим анализа Градиент т-ры (°C/мин)	Содержание неизвестного вещества (нг/мл)	Примечание
1	Перерастворенный экстракт исследуемой мочи	15°C/мин	10
2	Кислотный гидролизат экстракта исследуемой мочи	25°C/мин	1000
3	Ферментный гидролизат экстракта исследуемой мочи	15°C/мин	1000
4	Проба кетамина	15°C/мин	0
5	Кислотный гидролизат экстракта интактной мочи	15°C/мин	0
6	Кислотный гидролизат экстракта интактной мочи	25°C/мин	0
7	Кислотный гидролизат смеси экстрактов исследуемой и интактной мочи	15°C/мин	10
8	Кислотный гидролизат смеси экстрактов исследуемой и интактной мочи	25°C/мин	10

По результатам сопоставительного анализа неизвестное вещество в исследуемой биологической жидкости представляет собой новый метаболит кетамина.

Пример 2

Определение продуктов метаболизма трамадола.

Анализ проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что анализируют биологическую жидкость (проба крови) пациента, принимавшего трамадол. Результаты анализа в сравнении с базовыми веществами представлены в Таблице 3.

Таблица 3
Вещество, мол. масса	Время удерживания, мин	Масс-спектр (ионная ловушка)
Трамадол 263 а.е.м.	19.01	263[M+H]+(8%); 58(100%)
Эпокситрамадол, примесное вещество (и потенциальный метаболит) 261 а.е.м.	19.26	261[M]+(8%); 202(15%); 189(50%); 135(20%); 121(35%); 73(40%); 58(100%)
O-дезметил- трамадол 249 а.е.м.	19.19	250[М+Н]+(100%); 58(30%)
Неизвестное вещество	17.55	246[М+Н]+(5%); 58(100%)

В ходе проведения анализа как в Примере 1 негидролизованную пробу интактной биологической жидкости (проба крови пациента, не принимавшего трамадол) смешивают с четвертой аликвотой пробы исследуемой биологической жидкости, подвергают ферментативному гидролизу и гидролизат анализируют по плавной и быстрой программам (15°C/мин и 25°C/мин).

Содержание неизвестного вещества в анализируемых пробах представлено в Таблице 4.

Таблица 4
№ п/п	Объект анализа	Режим анализаГрадиент т-ры (°С/мин)	Содержание неизвестного вещества (нг/мл)	Примечание
1	Перерастворенный экстракт исследуемой крови	15°С/мин	750
2	Кислотный гидролизат экстракта исследуемой крови	25°С/мин	0
3	Ферментный гидролизат экстракта исследуемой крови	15°С/мин	750
4	Проба трамадола	15°С/мин	10
5	Кислотный гидролизат экстракта интактной крови	15°С/мин	0
6	Кислотный гидролизат экстракта интактной крови	25°С/мин	0
7	ферментативный гидролизат смеси экстрактов исследуемой и интактной крови	15°С/мин	750
8	Ферментативный гидролизат смеси экстрактов исследуемой и интактной крови	25°С/мин	750

Несмотря на то что в пробе трамадола (п.4 Таблицы 2) также обнаружено неизвестное вещество, его, принимая во внимание содержание в каждом случае, квалифицируют как новый, неизвестный ранее метаболит трамадола.

Как видно из описания и приведенных примеров осуществления способа заявляемое техническое решение обеспечивает возможность однозначной идентификации химических соединений и их фрагментов в произвольных комбинациях при одновременном повышении точности и оперативности определения.

Источники информации

1. RU 2093822 С1, Мкл. G01N 30/04, публ. 1997 г.

2. RU 2069363 С1, Мкл. G01N 30/02, публ. 1996 г.

3. WO 2004/104571, Мкл. G01N 30/00, публ. 2004 г.

4. ЕР 1846757 А2, Мкл. G01N 30/86, публ. 2007 г. - ближайший аналог.

Способ выявления неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов, принимавших наркотические или психотропные вещества, при котором готовят пробу исследуемого образца, подвергают ее ГХ/МС анализу, регистрируют масс-спектры образца, и ассоциированные с ними хроматограммы и проводят распознавание вещества сравнением с базой данных эталонных аналитических характеристик веществ, отличающийся тем, что готовят три пробы исследуемого образца биологической жидкости - первую путем экстракции с перерастворением, вторую путем кислотного гидролиза и третью путем ферментативного гидролиза, причем первую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 15°С/мин и данные анализируют путем сравнения с базой данных, по которой выявляют признаки неизвестного вещества (НВ), а именно - спектры с m/z, совпадающими с базовыми ионами наркотического или психотропного вещества или метаболитов, и содержание (НВ) в пробе, вторую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 25°С/мин и третью пробу подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°С/мин и при увеличении содержания НВ в последних двух пробах по сравнению с первой, подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°С/мин базовое наркотическое или психотропное вещество на присутствие в нем НВ, и при его отсутствии в базовом веществе, проверяют присутствие НВ в интактной биологической жидкости, для чего пробу ее готовят путем кислотного гидролиза и подвергают ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°С/мин и 25°С/мин и в случае обнаружения НВ в интактной биологической жидкости его квалифицируют как эндогенное, а при отсутствии признаков аликвоту первой пробы смешивают с пробой интактной биологической жидкости, готовят пробу путем кислотного гидролиза смеси, подвергают пробу ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°С/мин и 25°С/мин, определяют содержание НВ по результатам обоих режимов анализа и сравнивают его с содержанием НВ в первой пробе и при совпадающих значениях содержания НВ в указанных трех пробах квалифицируют НВ как новый, ранее неизвестный продукт метаболизма базового наркотического или психотропного вещества.