Терапевтическое средство для ускоренного заживления кожи, содержащее в качестве активного ингредиента грелин и его производные или вещество, воздействующее на рецептор ghs-r1a

Терапевтическое средство для ускоренного заживления кожи, содержащее в качестве активного ингредиента грелин и его производные или вещество, воздействующее на рецептор ghs-r1a

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к активному влиянию на пролиферацию кожных клеток вещества, воздействующего на рецептор, стимулирующий секрецию гормона роста (GHS-R). Более специфично, настоящее изобретение относится к терапевтическому средству или композиции, применяемым при лечении кожных повреждений, к средству, ускоряющему регенерацию кожи, а также к способу культивирования клеток кожи при лечении кожных повреждений, в котором указанное вещество используется как активный ингредиент.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Даже не заглядывая в длительную историю трансплантации кожи, очевидно, что кожа - это такая ткань, попытки лечения которой с помощью пересадок начались в самом давнем прошлом. Далее, если попытаться заглянуть вперед, в будущее исследований трансплантации и регенерации, надо отметить, что кожа рассматривается как ткань, доступ к которой максимально прост, а процесс ее развития/регенерации полностью контролируется через исследования развития кожи, исследования регенерации с использованием волос и так далее. В дополнение к этому следует отметить, что трансплантация и регенерация кожи - это такая область исследований, которую можно непосредственно приложить к различным заболеваниям кожи, например, к термическим повреждениям, к наследственному буллезному эпидермолизу и к возрастному облысению у мужчин, и вполне можно ожидать, что этот подход всегда будет играть важную роль при травматических и других повреждениях кожи (см. веб-сайт Центра 21-го века усовершенствований "Организация международного COE (центра сосредоточения преимуществ) по интеграции трансплантационной терапии и регенеративной медицины" - исследования в области трансплантации и регенерации кожи, http://www.kuhp.kyoto-u.ac.jp/~coe/member15.html).

Культивированная кожа, необходимая для трансплантации, различается в зависимости от заболевания, размеров повреждения и анатомической области пересадки. Если в случаях ожоговых повреждений легкой и умеренной тяжести вполне достаточна только пересадка культивированного эпидермиса, то для больных с повреждением кожи на всю толщину необходима культивированная кожа, в которой присутствует слой дермы. Желательно разработать такую культивированную кожу, которая будет действовать и как раневая повязка, и как потенциальный источник высвобождения физиологически активного вещества для лечения упорных язв кожи у больных с такими заболеваниями, как, например, сахарный диабет (см. Takamura: Bio Venture, 1:58 (2001)).

В настоящее время существуют две разновидности культивированных пластов кожи для использования при пересадках: один из них представлен нормальными кератиноцитами эпидермиса и культивируется по методике, разработанной Green et al. (см. Rheinwald and Green: Cell, 6:331 (1975)), а другой - это эквивалент кожной ткани, культивируемый по методике, которая разработана Bell et al. (см. Bell et al.: Science, 211: 1052 (1981)). Группа авторов Green et al. использовал клетки 3Т3 как вспомогательные клетки для подавления дифференцировки кератиноцитов эпидермиса и успешной пролиферации в достаточных размерах. В соответствии с разработанной методикой кератиноциты эпидермиса при культивировании создают многослойную структуру, типа листка или пласта, которая весьма напоминает живую структуру организма, причем было продемонстрировано, что такая структура полезна в клиническом аспекте как материал для замещения кожной ткани. Применив такой материал, как коллаген, Bell et al. предварительно изготовили компонент кожи, соответствующий дерме, и культивировали на этой основе кератиноциты эпидермиса. В этом способе было принципиально важно использовать материал, дающий вклад в трехмерное инкорпорирование клеток для образования искусственной ткани, и коллагеновый гель оказался вполне подходящим материалом для этой цели (см. Hata: Jikken Igaku Extra Number, 19: 2121 (2001)).

Если удалось подготовить клеточный каркас, то следующим необходимым фактором является вещество, которое способно стимулировать пролиферацию и дифференциацию клеток (см. Ueda: Bio Venture, 1: 32 (2001)). Люди, с осторожностью относящиеся к клиническому применению IGF, TGF-β, FGF и подобных им веществ, утверждают, что эти вещества могут нарушить дифференцировку и развитие клеток в других частях человеческого организма. Поэтому желательно открыть/разработать вещество, которое, обладая такой активностью, было бы практически безопасным.

В будущей трансплантационной терапии или регенеративной медицине применительно к повреждениям кожи также представляется желательным использование культивированных кожных клеток плода, поскольку, будучи пересаженными в поврежденный участок кожи, такие клетки дифференцируются и пролиферируют в нормальную кожу, то есть обладают способностью восстанавливать кожу (см. Hohfeld et al.: Lancet, 366: 788-790 (2005)). Однако в связи с тем, что скорость пролиферации кожных клеток плода невелика, желательно разработать технологию стимулирования пролиферации.

Грелин - это гормон, который был обнаружен в желудке в 1999 г. Он представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, состоящей из 28 остатков, который имеет крайне редкую химическую структуру в том смысле, что третья аминокислота, считая от N-конца последовательности, ацилирована жирной кислотой (см. Kojima et at.: Nature, 402, 656-660 (1999), а также WO01/07475). Грелин воздействует на рецептор 1a, стимулирующий секрецию гормона роста (GHS-R1a, см. Haward et al.: Science, 273:974-977 (1996)). Он описан как эндогенный, мозговой и желудочно-кишечный гормон, стимулирующий секрецию гормона роста (GH) из гипофиза (см. Kojima et at.: Nature, 402, 656-660 (1999)). Недавно проведенные исследования показали, что грелин усиливает аппетит, что подкожное введение грелина способствует увеличению веса и жировой массы тела и что грелин также обладает активностью в улучшении сердечной функции (см. Wren et at.: Endocrinology 141: 4325-4328 (2000), Nakazato et al.: Nature 409:194-198 (2001), Shintani et al.: Diabetes 50: 227-232 (2001), Lely et al.: Endocr. Rev. 25: 426-457 (2004), and Korbonits et al.: Front Neuroendocrino. 25: 27-68 (2004)).

Поскольку грелин стимулирует секрецию GH и способствует повышению аппетита, можно ожидать, что в связи с этим он способен эффективно задействовать сжигание жиров, превращая жиры в энергию, и укреплять мышцы через анаболическую активность, экспрессируемую гормоном роста (см. Akamizu and Kangawa: Saishin Igaku, 60: 1569-1573 (2005)).

Грелин был впервые выделен из организма крысы и очищен как эндогенный GHS, действующий на GHS-R1a. С тех пор аминокислотные последовательности грелина с аналогичной первичной структурой были обнаружены и у других позвоночных, в том числе у человека, мыши, свиньи, курицы, угря, быка, лошади, овцы, лягушки-быка, форели и собаки.

Человеческий
:GSS(n-октаноил) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	(SEQ ID NO:1)
:GSS(n-октаноил) FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR	(SEQ ID NO:2)
Крысиный
:GSS(n-октаноил) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	(SEQ ID NO:3)
:GSS(n-октаноил) FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR	(SEQ ID NO:4)
Мышиный
:GSS(n-октаноил) FSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	(SEQ ID NO:5)
Свиной
:GSS(n-октаноил) FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR	(SEQ ID NO:6)
Бычий
:GSS(n-октаноил) FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR	(SEQ ID NO:7)
Овечий
:GSS(n-октаноил) FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR	(SEQ ID NO:8)
Собачий
:GSS(n-октаноил) FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR	(SEQ ID NO:9)
Угря
:GSS(n-октаноил) FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH2	(SEQ ID NO:10)
Форели
:GSS(n-октаноил) FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH2	(SEQ ID NO:11)
:GSS(n-октаноил) FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH2	(SEQ ID NO:12)
Куриный
:GSS(n-октаноил) FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR	(SEQ ID NO:13)
:GSS(n-октаноил) FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR	(SEQ ID NO:14)
:GSS(n-октаноил) FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH	(SEQ ID NO:15)
Лягушки-быка
:GLT(n-октаноил) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM	(SEQ ID NO:16)
:GLT(n-деканоил) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM	(SKQ ID NO:16)
:GLT(n-октаноил) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN	(SEQ ID NO:17)
Тилапии
:GSS(n-октаноил) FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH2	(SEQ ID NO:18)
Зубатки
:GSS(n-октаноил) FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH2	(SEQ ID NO:19)
:GSS(n-октаноил) FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG	(SEQ ID NO:20)
Лошадиный
:GSS(n-бутаноил) FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR	(SEQ ID NO:21)

(В приведенной выше таблице аминокислотные остатки представлены однобуквенными аббревиатурами).

Описанный выше пептид имеет специфическую структуру, в которой гидроксильная группа боковой цепи, представленная остатком серина (S) или треонина (T) и находящаяся в третьем положении, ацилирована жирной кислотой, например октановой кислотой, декановой кислотой и т.п. За исключением грелина пока не было других случаев выделения физиологически активного пептида, имеющего структуру с гидрофобной модификацией.

В соответствии с настоящим изобретением вещества, которые воздействуют на рецептор GHS-R1a, в дополнение к вышеуказанным пептидным соединениям включают пептид-2 высвобождения гормона роста (GHRP-2) (D-Ala-D-(βNal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂) и GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂) (Muccioli, G et al.: J. Endocrino., 157, pp.99-106 (1998)) и их производные. Кроме того, можно применять такие низкомолекулярные соединения, как L-692,429 (MK-0751); L-163,191 (MK-0677) (Patchett et al.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92, pp.7001-7005 (1995); ипаморелин (NN161); табморелин (NN703) и CP-724, 391 (Ankerson M. et al.: Drug Discovery Today, 4. pp.497-506).

Насколько известно авторам настоящего изобретения, до сих пор не было ни одного сообщения, касающегося экспрессии GHS-R1a в клетках кожи и влияния веществ, взаимодействующих с GHS-R1a, на пролиферацию клеток кожи.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМА, НА РЕШЕНИЕ КОТОРОЙ НАПРАВЛЕНО ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для лечения кожных повреждений, к средству, ускоряющему регенерацию кожи, а также к способу культивирования клеток кожи при лечении кожных повреждений, основанному на применении вещества, стимулирующего пролиферативную активность клеток кожи.

СРЕДСТВА ДЛЯ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение вещества, воздействующего на GHS-R1a, самке животного во время беременности ускоряет рост плода, а вводимое вещество попадает в организм плода, как и амниотическая жидкость. Принимая во внимание функцию и роль вещества, воздействующего на GHS-R1a, в амниотической жидкости, можно ожидать, что такое вещество активно стимулирует пролиферацию кожных клеток.

Авторы настоящего изобретения изучали вопрос о том, как вещество, воздействующее на GHS-R1a, влияет на кожные клетки плода, и обнаружили, что вещество, воздействующее на GHS-R1a, действует на клетки кожи, увеличивая в них внутриклеточное содержание кальция, и что такое вещество стимулирует пролиферативную активность клеток кожи.

То есть настоящее изобретение относится к средству, ускоряющему регенерацию кожи при лечении кожных повреждений, к средству, ускоряющему образование (формирование) пласта кожных клеток при их культивировании, к средству, ускоряющему заживление кожи, и к терапевтическому средству, используемому при трансплантации культивированной кожи, которое в качестве активного ингредиента содержит вещество, воздействующее на рецептор GHS-R1a.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения кожных повреждений, основанному на ускоренном формировании пласта клеток кожи при их культивировании, а также к способу ускоренного заживления кожи при трансплантации культивированных клеток кожи и к способу лечения указанного заболевания, основанному на ускоренном заживлении и содержащему введение вещества, воздействующего на рецептор GHS-R1a.

Далее, настоящее изобретение относится к применению вещества, воздействующего на рецептор GHS-R1a, в составе средства, ускоряющего регенерацию кожи при лечении кожных повреждений, в составе средства, ускоряющего формирование пласта клеток кожи при их культивировании, а также к производству средства, ускоряющего заживление кожи, и терапевтического средства, используемого при трансплантации культивированных клеток.

Настоящее изобретение, основанное на вышеприведенном описании, специфически относится к следующим объектам.

(1) Терапевтическое средство для лечения кожных повреждений, содержащее в качестве активного ингредиента вещество, которое воздействует на рецептор, стимулирующий секрецию гормона роста, или его фармацевтически приемлемую соль.

(2) Терапевтическое средство согласно абзацу (1), в котором активное вещество представляет собой пептид, который выбран из группы, включающей пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой третий аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, и пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, где одна или несколько аминокислот от 5-й до 28-й, считая от аминоконца, делетированы, замещены и/или добавлены, а 3-й аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, или его фармацевтически приемлемая соль.

(3) Терапевтическое средство согласно абзацу (2), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в гидроксильную группу боковой цепи которого введена жирная кислота.

(4) Терапевтическое средство согласно абзацу (3), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, имеет в боковой цепи гидроксильную группу, ацилированную n-октаноильной группой.

(5) Терапевтическое средство по любому из абзацев с (1) по (4), содержащее активный ингредиент в количестве от 0,001 мг до 100 мг на единицу состава.

(6) Средство, ускоряющее регенерацию кожи, содержащее в качестве активного ингредиента вещество, которое воздействует на рецептор, стимулирующий секрецию гормона роста, или его фармацевтически приемлемая соль.

(7) Средство согласно абзацу (6), в котором активное вещество представляет собой пептид, который выбран из группы, которая включает пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой третий аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, и пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, где одна или несколько аминокислот от 5-й до 28-й, считая от аминоконца, делетированы, замещены и/или добавлены, а 3-й аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, или его фармацевтически приемлемая соль.

(8) Средство согласно абзацу (7), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в гидроксильную группу боковой цепи которого введена жирная кислота.

(9) Средство согласно абзацу (8), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, имеет в боковой цепи гидроксильную группу, ацилированную n-октаноильной группой.

(10) Средство по любому из абзацев с (6) по (10), содержащее активный ингредиент в количестве от 0,001 мг до 100 мг на единицу состава.

(11) Способ ускорения пролиферации культивированных клеток кожи, в котором в качестве активного ингредиента применяют вещество, воздействующее на рецептор усиления секреции гормона роста, или его фармацевтически приемлемую соль.

(12) Способ согласно абзацу (11), в котором активное вещество представляет собой пептид, который выбран из группы, которая включает пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой третий аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, и пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, где одна или несколько аминокислот от 5-ой до 28-ой, считая от аминоконца, делетированы, замещены и/или добавлены, а 3-й аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, или его фармацевтически приемлемая соль.

(13) Способ согласно абзацу (12), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в гидроксильную группу боковой цепи которого введена жирная кислота.

(14) Способ согласно абзацу (13), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, имеет в боковой цепи гидроксильную группу, ацилированную n-октаноильной группой.

(15) Способ по любому из абзацев с (11) по (14), в котором пролиферацию культивируемых клеток кожи осуществляют в среде, содержащей активный ингредиент в количестве от 0,0000001 мг/мл до 0,1 мг/мл.

(16) Способ лечения кожных повреждений, предусматривающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, вещества, которое воздействует на рецептор усиления секреции гормона роста, или его фармацевтически приемлемой соли в качестве активного ингредиента лекарства.

(17) Способ согласно абзацу (16), в котором активное вещество представляет собой пептид, который выбран из группы, которая включает пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой третий аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, и пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, где одна или несколько аминокислот от 5-ой до 28-ой, считая от аминоконца, делетированы, замещены и/или добавлены, а 3-й аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, или его фармацевтически приемлемая соль.

(18) Способ согласно абзацу (17), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в гидроксильную группу боковой цепи которого введена жирная кислота.

(19) Способ согласно абзацу (18), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, имеет в боковой цепи гидроксильную группу, ацилированную n-октаноильной группой.

(20) Способ по любому из абзацев с (16) по (19), в котором активный ингредиент вводят в количестве от 0,001 мг до 100 мг применительно к разовой дозе.

(21) Способ ускорения регенерации кожи, предусматривающий введение млекопитающему, нуждающемуся в ускоренной регенерации кожи, вещества, которое воздействует на рецептор усиления секреции гормона роста, или его фармацевтически приемлемой соли в качестве активного ингредиента лекарства.

(22) Способ согласно абзацу (21), в котором активное вещество представляет собой пептид, который выбран из группы, которая включает пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой третий аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, и пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, где одна или несколько аминокислот от 5-й до 28-й, считая от аминоконца, делетированы, замещены и/или добавлены, а 3-й аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, или его фармацевтически приемлемая соль.

(23) Способ согласно абзацу (22), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в гидроксильную группу боковой цепи которого введена жирная кислота.

(24) Способ согласно абзацу (23), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, имеет в боковой цепи гидроксильную группу, ацилированную n-октаноильной группой.

(25) Способ по любому из абзацев с (21) по (24), в котором активный ингредиент вводят в количестве от 0,001 мг до 100 мг применительно к разовой дозе.

(26) Применение вещества, воздействующего на рецептор усиления секреции гормона роста, или его фармацевтически приемлемой соли в качестве активного ингредиента при производстве фармацевтической композиции для лечения кожных повреждений.

(27) Применение согласно абзацу (26), в котором активное вещество представляет собой пептид, который выбран из группы, которая включает пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой третий аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, и пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, где одна или несколько аминокислот от 5-й до 28-й, считая от аминоконца, делетированы, замещены и/или добавлены, а 3-й аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, или его фармацевтически приемлемая соль.

(28) Применение согласно абзацу (27), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в гидроксильную группу боковой цепи которого введена жирная кислота.

(29) Применение согласно абзацу (28), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, имеет в боковой цепи гидроксильную группу, ацилированную n-октаноильной группой.

(30) Применение по любому из абзацев с (26) по (29), в котором фармацевтическая композиция для лечения кожных повреждений содержит активный ингредиент в количестве от 0,001 мг до 100 мг на единицу состава.

(31) Применение вещества, воздействующего на рецептор усиления секреции гормона роста, или его фармацевтически приемлемой соли в качестве активного ингредиента при производстве фармацевтической композиции для ускорения регенерации кожи.

(32) Применение согласно абзацу (31), в котором активное вещество представляет собой пептид, который выбран из группы, которая включает пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой третий аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, и пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, где одна или несколько аминокислот от 5-й до 28-й, считая от аминоконца, делетированы, замещены и/или добавлены, а 3-й аминокислотный остаток, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в боковую цепь которого введена жирная кислота, или его фармацевтически приемлемая соль.

(33) Применение согласно абзацу (32), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток, в гидроксильную группу боковой цепи которого введена жирная кислота.

(34) Применение согласно абзацу (33), в котором активное вещество представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, в которой сериновый остаток в третьем положении, считая от аминоконца, имеет в боковой цепи гидроксильную группу, ацилированную n-октаноильной группой.

(35) Применение по любому из абзацев с (31) по (34), в котором фармацевтическая композиция для ускорения регенерации кожи содержит активный ингредиент в количестве от 0,001 мг до 100 мг на единицу состава.

ЭФФЕКТ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИЙ СОБОЙ ПРЕИМУЩЕСТВО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение показывает, что вещество, воздействующее на рецептор усиления секреции гормона роста, активно влияет на пролиферацию кожных клеток. Таким образом, настоящее изобретение делает возможным быстрое применение культивированных клеток кожи для лечения за счет добавления вещества, которое, воздействуя на рецептор усиления секреции гормона роста, ускоряет пролиферацию кожных клеток при их культивировании. То есть более быстрое предоставление больному искусственного пласта кожи, полученного из культивированных клеток кожи, становится реальной возможностью в процессе восстановительного лечения кожи, которое заключается в культивировании кожных клеток для создания искусственной структуры кожи, имеющей форму пласта и используемой для закрытия поверхности кожного дефекта. Далее, становится возможным ускорение заживления за счет трансплантации кожных клеток непосредственно в поврежденный участок кожи или в кожную рану, сопровождающейся введением в участок трансплантации вещества, воздействующего на рецептор усиления секреции гормона роста.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 наглядно демонстрирует экспрессию мРНК GHS-R1a в кожных клетках плода.

Фиг.2 наглядно демонстрирует активность грелина, направленную на повышение внутриклеточного содержания кальция в отдельно взятой культивированной клетке кожи плода.

Фиг.3 наглядно демонстрирует активность грелина, направленную на ускорение поглощения [³H]-тимидина кожными клетками плода.

Фиг.4 наглядно демонстрирует активность грелина и GHRP6, направленную на ускорение пролиферации кожных клеток плода.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Лекарственное средство, предлагаемое настоящим изобретением, можно применять, как таковое, для млекопитающих (индивидуальных особей), включая человека. Примеры вещества, используемого в настоящем изобретении, включают стимулятор секреции гормона роста (GHS), который представляет собой лиганд, воздействующий на рецептор усиления секреции гормона роста (GHS-R). В качестве GHS могут быть использованы известные пептидные соединения и соединения с низкой молекулярной массой (например, грелин, GHRP6, MK-0677 и ипаморелин), но особенно предпочтителен грелин, представляющий собой пептидное соединение.

В качестве грелина, как описано выше, кроме грелина, полученного от человека, можно также использовать грелин, полученный от крысы, мыши, свиньи, быка и других животных, а также производные этих грелинов.

Предпочтительно, чтобы для индивидуального организма был использован грелин, полученный от такого же индивидуального организма (одного биологического вида). Например, грелин, полученный от человека, предпочтительно использовать для организма человека. Грелин, полученный от человека, представляет собой пептид, содержащий 28 аминокислот и боковую цепь с гидроксильной группой в остатке серина в третьем положении, считая от аминоконца, которая ацилирована жирной кислотой (n-октаноильной группой) (SEQ ID NO: 1). В качестве производных грелина можно использовать, например, пептид, в аминокислотной последовательности которого одна или несколько аминокислот замещены, добавлены и/или делетированы в участке от 5-го до 28-го аминокислотного остатка, считая от аминоконца аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, причем такой пептид обладает активностью по повышению внутриклеточной концентрации ионов кальция за счет связывания с рецептором усиления секреции гормона роста (GHS-R). Предпочтительно, чтобы гомология аминокислотных последовательностей производных с природной аминокислотной последовательностью составляла 70%, предпочтительнее 80%, еще предпочтительнее 90%, еще предпочтительнее 95% и наиболее предпочтительно 97%. Эти условия неизменны для грелина, полученного от других животных (от SEQ ID NO: 2 до SEQ ID NO: 22).

В соответствии с настоящим изобретением грелин и его производные могут быть изготовлены традиционным способом. Например, их можно выделять из природных сырьевых материалов, производить на основе технологии рекомбинантных ДНК и/или химического синтеза. Если необходима модификация (ацилирование) аминокислотного остатка, такую реакцию модификации можно осуществить в соответствии с известными способами и средствами. Например, при способе производства на основе технологии рекомбинантных ДНК грелин и его производные, соответствующие настоящему изобретению, можно получить, культивируя клетки-хозяева, трансформированные вектором экспрессии, в котором содержится ДНК, кодирующая пептид, который соответствует настоящему изобретению, а затем выделяя целевой пептид из культуры и собирая его. Выбирая клетку-хозяин, можно получить нужное соединение, целевой пептид, модифицированный (ацилированный) в этой клетке. Если пептид не модифицирован (ацилирован), реакцию модификации, например, ацилирования, по желанию можно провести, применив известные средства.

Примеры векторов, содержащих целевой ген, включают векторы E. coli (например, pBR322, pUC18 и pUC19), векторы bacillus subtilis (например, pUBHO, pTP5 и pC194), векторы дрожжей (например, YEp, YRp и Yip) и векторы клеток животных (например, ретровирус и вирус вакцинии). Можно использовать и любые другие векторы, которые способны стабильно удерживать целевой ген в клетке-хозяине. Вектор вводят в правильно выбранную клетку-хозяин. В качестве способа встраивания целевого гена в плазмиду или его введения в клетку-хозяин можно использовать, например, способ, описанный в ссылке Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989).

Для того чтобы ген целевого пептида мог экспрессироваться в плазмиде, выше него в эту же плазмиду встраивают промотор, причем так, чтобы он функционировал.

В этой заявке подразумевается, что можно использовать любой промотор, если он подходит для клетки-хозяина, которая выбрана для экспрессии целевого гена. Например, если клетка-хозяин, подлежащая трансформации, принадлежит роду Escherichia, то можно использовать промотор lac, промотор trp, промотор lpp, промотор A.PL, промотор recA и подобные им. Если клетка-хозяин принадлежит роду Bacillus, то можно использовать такие промоторы, как SP01, SP02 и т.п. Если клетка-хозяин - это дрожжевая клетка, то можно использовать такие промоторы, как GAP, PH05, ADH и т.п. Если же клетка-хозяин имеет животное происхождение, то можно использовать промоторы, полученные из SV40, из ретровируса и подобные им.

Клетку-хозяин трансформируют каким-либо из указанных векторов, содержащих целевой ген. Используемая клетка-хозяин может быть бактерией (например, из рода Escherichia и рода Bacillus), дрожжевой клеткой (например, из рода Saccharomyces, рода Pichia и рода Candida), либо иметь животное происхождение (например, клетки CHO и клетки COS). В качестве культуральной среды вполне подходит жидкая питательная среда, причем наиболее предпочтительная среда должна содержать источники углерода и азота, которые необходимы для роста трансформированных клеток в культуре. По желанию в питательную среду можно вводить такие добавки, как витамины, стимуляторы роста, сыворотку и т.п.

Для того чтобы приготовить модифицированный жирной кислотой (ацилированный) пептид прямым способом, в качестве клетки-хозяина предпочтительно использовать клетку, обладающую активностью рабочей протеазы для расщепления полипептида-предшественника в правильном положении, а также активностью по ацилированию серинового остатка в целевом пептиде. Клетку-хозяин, обладающую этой активностью рабочей протеазы и активностью по ацилированию серина, можно отобрать путем трансформации клетки-хозяина вектором экспрессии, содержащим кДНК, которая кодирует пептид-предшественник, с последующим подтверждением того, продуцирует ли (или не продуцирует) трансформированная клетка пептид, модифицированный жирной кислотой и обладающий активностью по повышению внутриклеточного содержания кальция или активностью по усилению секреции гормона роста.

После культивирования клеток пептид, соответствующий настоящему изобретению, выделяют из культуры и очищают общепринятым способом. Например, экстракцию целевого вещества из культивированных бактериальных форм или клеток проводят, собирая бактериальные формы или клетки после культивирования, суспендируя их в буферном растворе, содержащем белковый модификатор (например, гуанидингидрохлорид), разрушая бактериальные формы или клетки ультразвуком либо другим способом и центрифугируя их. Для того чтобы очистить целевое вещество от надосадочной жидкости, можно применить различные методы сепарации и очистки, например, просачивание через гель, ультрафильтрацию, диализ, SDS-PAGE и различные методики хроматографии, подбирая их в правильной комбинации в зависимости от молекулярной массы, растворимости, электрического заряда (изоэлектрической точки) и аффинности целевого вещества.

В соответствии с настоящим изобретением вещество, воздействующее на рецептор GHS-R1a (например, грелин), и его производные можно синтезировать химически общепринятым способом. Например, целевое вещество можно приготовить конденсацией аминокислоты с защитными группами жидкофазным и/или твердофазным способом с последующим удлинением пептидной цепи, удалением всех защитных групп кислотой и очисткой полученного неочищенного продукта вышеуказанным способом. Селективное ацилирование боковой цепи в целевом положении аминокислоты можно провести при помощи фермента ацилирования или ацилтрансферазы.

В отношении способа выработки пептида уже давно известны различные методики. Согласно настоящему изобретению пептид также можно довольно просто получить одним из известных способов, например, классическим методом твердофазного синтеза пептидов.

Можно также применить способ выработки, содержащий как технологию рекомбинантных ДНК, так и химический синтез: например, фрагменты, содержащие модифицированный аминокислотный остаток, получают химическим синтезом, другие фрагменты без каких-либо модификаций аминокислотных остатков получают на основе технологии рекомбинантных ДНК, после чего проводят слияние соответствующих фрагментов друг с другом (см. WO01/07475).

Если говорить об использовании солей вещества, воздействующего на GHS-R1a (например, грелина) и его производных в настоящем изобретении, то предпочтение следует отдать фармацевтически приемлемым солям. Примеры таких солей включают соли неорганических оснований, соли органических оснований, соли неорганических кислот, соли органических кислот, соли основных аминокислот (диаминокислот) и соли кислых (дикарбоновых) аминокислот.

Предпочтительные примеры солей неорганических оснований включают соли щелочных металлов, например, соли натрия и соли калия, соли щелочноземельных металлов, например, соли кальция и соли магния, а также соли алюминия, соли аммония и т.п.

Предпочтительные примеры солей органических оснований включают триметиламин, триэтиламин, пиридин, пиколин, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, дициклогексиламин, N,N'-дибензилэтилендиамин и т.п.

Предпочтительные примеры солей неорганических кислот включают соли соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, азотной кислоты, серной кислоты, фо