Вакцина на основе lawsonia и способы ее применения

Вакцина на основе lawsonia и способы ее применения

Реферат

Ссылка на родственную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США серийный номер 60/699946, зарегистрированной 15 июля 2005 г., сущность и содержание которой включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в широком смысле относится к улучшенным способам вакцинации с целью иммунизации против пролиферативного энтерита свиней, известного как илеит, который вызывается облигатной внутриклеточной бактерией Lawsonia intracellularis (Lawsonia или L. intracellularis). Конкретно изобретение относится к способам, которые обеспечивают повышенную защиту против L. intracellularis, заключающимся в вакцинации беременных свиноматок; вакцинации беременных свиноматок и затем последующей вакцинации рожденных ими молодых поросят в течение примерно трехнедельного периода времени после рождения; и вакцинации молодых поросят в течение периода времени, составляющего до 25 или 26 дней после рождения соответственно.

Описание существующего уровня техники

Пролиферативный энтерит свиней (ПЭС) представляет собой встречающееся в естественных условиях заболевание, которое может поражать свиней в возрасте от отъема до стадии молодого взрослого животного. Было установлено, что возбудителем этого заболевания является Lawsonia intracellularis, представляющая собой облигатную внутриклеточную грамотрицательную бактерию, которую нельзя культивировать с помощью обычных бактериологических методов на стандартных бесклеточных средах, и предполагается, что для своего роста ей необходимы клетки. У S. McOrist и др., Infection и Immunity, том 61 (19), 1993, cc.4286-4292 и G. Lawson и др., J. of Clinical Microbiology, том 31 (5), 1993, cc.1136-1142 описано культивирование L. intracellularis с использованием монослоев крысиных эпителиальных клеток кишечника линии IEC-18 в стандартных колбах для культуры ткани. В US 5714375 и US 5885823, которые оба включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте, описано культивирование L. intracellularis в суспендированных клетках-хозяевах.

Из существующего уровня техники хорошо известны патогенные и непатогенные ослабленные штаммы бактерии L. intracellularis. Например, в WO 96/39629 и WO 05/011731 описаны непатогенные ослабленные штаммы L. intracellularis. Другие ослабленные штаммы бактерии L. intracellularis описаны в WO 02/26250 и WO 03/00665. Сущность и содержание каждого из этих документов включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Заболевание отличается, прежде всего, своей макроскопической и микроскопической патологией, а позднее проявляется в присутствии внутриклеточных бактерий в пораженных клетках. Отличительным патологическим признаком заболевания является пролиферация незрелых эпителиальных клеток в криптах подвздошной кишки (концевая область тонкого кишечника), толстого кишечника или их обоих. Срезы инфицированной ткани характеризуются покрасневшей утолщенной слизистой оболочкой, напоминающей «садовый шланг», и энтеральными повреждениями. Утолщение кишки, в конце концов, препятствует нормальной функции кишки, абсорбционной способности и транспорту питательных веществ. Клиническими признаками заболевания являются хроническая потеря веса, плохое развитие, диарея, в результате чего наступает смерть. Заболевание имеет важное экономическое значение, поскольку приводит к потерям поголовья вследствие гибели, повышенным расходам на лечение, слабому приросту массы и пониженному превращению корма у пораженных животных. Клинические случаи илеита проявляются наиболее заметно у свиней 6-20-недельного возраста. Однако присутствие L. intracellularis было подтверждено (с помощью ПЦР) у свиней сразу после отъема (в 3-4-недельном возрасте), это позволяет предположить что контакт с L. intracellularis происходит в питомнике и, по-видимому, обусловлен Lawsonia-положительными свиноматками (Mauch и Bilkei, Vet Rec 155, 2004, с.532; Marsteller и др., Swine Health Prod 11, 2003, cc.127-130; Stege и др., Vet Micro 104, 2004, cc.197-206). Эти данные подчеркивают важность использования в системе производства стратегий профилактики, таких как вакцинация на более ранних стадиях.

Существующие в настоящее время стратегии вакцинации для иммунизации против илеита включают оральное введение вакцины незараженным Lawsonia свиньям в возрасте только от трех недель и старше, поскольку более молодые поросята могут иметь материнские антитела к L. intracellularis благодаря тому, что свиноматки подвергались ранее воздействию этой бактерии или были вакцинированы. До создания способа, предлагаемого в настоящем изобретении, существовало мнение, что присутствие материнских антител или других лактогенных факторов может оказывать негативное влияние (имеет место интерференция) на эффективность вакцинации таких поросят, поскольку материнские антитела обладают способностью нейтрализовать вакцину до того, как иммунная система поросенка сможет распознать ее и начать секретировать свои собственные антитела. Поэтому, принимая во внимание материнский иммунитет, ранее не применяли вакцинацию молодых поросят.

Краткое изложение сущности изобретения

При создании настоящего изобретения были преодолены недостатки существующего уровня техники и разработаны новые способы, обеспечивающие улучшенную защиту свиней от илеита. В частности, в настоящем изобретении предложен способ введения в иммунологически эффективном количестве вакцины свиноматкам и/или молодым поросятам в течение нескольких недель после рождения для того, чтобы иммунизировать их против илеита. Было установлено, что передача материнского иммунитета от вакцинированных против Lawsonia или подвергнутых воздействию этой бактерии свиноматок поросятам обеспечивает определенный уровень защиты от илеита в течение по меньшей мере 6 недель после рождения. Однако без вакцинации они быстро становятся чувствительными к заболеванию. С помощью способов, предлагаемых в настоящем изобретении, неожиданно было продемонстрировано, что введение вакцины беременным животным в высоких дозах, повторное введение доз и даже когда введение осуществляют на второй или третьей стадиях беременности, является безопасным и эффективным в отношении создания материнского иммунитета.

Таким образом, настоящее изобретение в целом относится к способу вакцинации беременных животных (предпочтительно свиней) против инфекций, вызываемых L. intracellularis, заключающемуся в том, что беременных животных вакцинируют с помощью антигена L. intracellularis. Согласно следующему объекту изобретения вакцинацию осуществляют с использованием высоких доз и/или повторных доз антигена L. intracellularis. Еще один объект настоящего изобретения относится к способу вакцинации беременных животных (предпочтительно свиней) против инфекций, вызываемых L. intracellularis, который заключается в том, что беременных животных вакцинируют на второй или третьей стадиях беременности, предпочтительно этих беременных животных вакцинируют с использованием высоких доз и/или повторных доз антигена L. intracellularis.

Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является способ вакцинации свиней против илеита, заключающийся в том, что беременной вводят вакцину на основе Lawsonia свиноматке по меньшей мере один раз перед опоросом и наиболее предпочтительно три раза перед опоросом («повторные дозы»). В некоторых вариантах осуществления изобретения беременных свиноматок вакцинируют с использованием высоких доз антигена L. intracellularis. Когда вакцину вводят свиноматке три раза, то первое введение следует осуществлять за 50-60 дней до опороса, предпочтительно за 52-58 дней до опороса, и наиболее предпочтительно за 54-56 дней до опороса. Второе введение следует осуществлять за 30-40 дней до опороса, предпочтительно за 32-38 дней до опороса, и наиболее предпочтительно за 34-36 дней до опороса. Последнее введение следует осуществлять за 10-20 дней до опороса, предпочтительно за 12-18 дней до опороса, и наиболее предпочтительно за 14-16 дней до опороса. Затем после того, как свиноматка дала потомство, вакцину вводят каждому поросенку в период времени от отъема до забоя, но предпочтительно до того, как они достигнут трехнедельного возраста, в любом случае в возрасте по меньшей мере от 10 до 25-26 дней соответственно (предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней), более предпочтительно в возрасте от 10 до 21 дня, еще более предпочтительно в возрасте от 15 до 21 дня, и наиболее предпочтительно в возрасте от 19 до 21 дня. В другом варианте осуществления данного способа вакцину вводят каждому поросенку до 26-дневного возраста, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней, и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня.

Таким образом, еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу вакцинации беременных свиноматок, а также родившихся поросят. Предпочтительно беременных свиноматок и родившихся поросят вакцинируют, как описано выше.

Кроме того, неожиданно было установлено, что материнский иммунитет не оказывает негативного влияния на успешную вакцинацию поросят сразу после рождения, и фактически у поросят, вакцинированных в течение трех недель после рождения согласно описанному выше способу, макроскопическая патология, связанная с заболеванием, проявляется в меньшей степени, чем у невакцинированных поросят.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу вакцинации молодых животных (предпочтительно молодых поросят) в течение трех недель после рождения против инфекции, вызываемой L. intracellularis. Предпочтительно таких молодых животных (предпочтительно молодых поросят) вакцинируют в возрасте 21±5 дней. Еще более предпочтительно таких молодых животных (предпочтительно молодых поросят) вакцинируют в возрасте от 10 до 25 и 26 дней соответственно. Еще более предпочтительно таких молодых животных (предпочтительно молодых поросят) вакцинируют в возрасте от 10 до 21 дня. Еще более предпочтительно таких молодых животных (предпочтительно молодых поросят) вакцинируют в возрасте от 12 до 21 дня соответственно. Еще более предпочтительно таких молодых животных (предпочтительно молодых поросят) вакцинируют в возрасте от 15 до 21 дня, наиболее предпочтительно в возрасте от 19 до 21 дня. В другом варианте осуществления этого способа вакцину вводят каждому поросенку до достижения 26-дневного возраста, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней, и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня. Вакцина, применяемая согласно настоящему изобретению, может представлять собой любую вакцину, которая обеспечивает защиту от L. intracellularis. Предпочтительно вакцина представляет собой вакцину на основе живого вируса L. intracellularis. Более предпочтительно вакцина представляет собой Enterisol® Ileitis B3903 (фирма Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).

Вакцину вводят животным, предпочтительно млекопитающим, и еще более предпочтительно свиньям, любым обычным методом, наиболее предпочтительно с помощью прибора для вливания лекарства в ротовую полость животного.

Предназначенная для введения доза должна варьироваться в зависимости от конкретной ситуации, но в любом случае она должна представлять собой количество, достаточное для индукции защитного гуморального иммунного ответа и/или клеточно-опосредованного иммунного ответа против илеита. Правильную дозу можно определять методами, известными в данной области без излишних экспериментов, и она должна в большинстве случаев зависеть от применяемой вакцины. Во многих случаях пригодная суточная доза составляет от 0,1 до 10 мл, предпочтительно примерно от 1 до 5 мл. В случае Enterisol® Ileitis доза предпочтительно составляет по меньшей мере 2 мл на свинью. Для неводных вакцин дозы можно рассчитывать также на основе соотношения сухой массы вакцины и массы свиньи.

Опыты, результаты которых приведены ниже в примерах, были проведены для оценки эффективности вакцины для свиней, родившихся от свиноматок, подвергнутых воздействию Lawsonia intracellularis, и Lawsonia-отрицательных свиноматок. Кроме того, в исследованиях оценивали, имелось ли какое-либо негативное материнское влияние на вакцинацию поросят в трехнедельном возрасте.

Подробное описание изобретения

Понятие «вакцинация» или «вакцинирование» в контексте настоящего описания означает (но, не ограничиваясь им) процесс, который заключается во введении антигена L. intracellularis животному, где антиген L. intracellularis, будучи введенным животному, вызывает или может вызывать иммунный ответ у животного против L. intracellularis.

Понятие «животное» в контексте настоящего описания относится (но, не ограничиваясь ими) к птицам, рыбе и млекопитающим, таким как крупный рогатый скот, свиньи, лошади и приматы. Однако, согласно одному из наиболее предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения животное представляет собой свинью, предпочтительно поросенка возрастом от 10 до 25 и 26 дней соответственно, предпочтительно возрастом от 10 до 21 дня, еще более предпочтительно возрастом от 15 до 21 дня, и наиболее предпочтительно возрастом от 19 до 21 дня. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения возраст поросенка составляет менее 26 дней, предпочтительно возраст составляет от 16 до 26 дней, более предпочтительно возраст составляет от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно возраст составляет от 19 до 22 дней и наиболее предпочтительно возраст составляет 21 день.

Понятие «эффективная доза» или «обладающая эффективностью доза» в контексте настоящего описания означает (но, не ограничиваясь этим) количество антигена, которое вызывает или может вызывать иммунный ответ у животного, которому вводят антиген L. intracellularis в указанной эффективной дозе.

«Иммунологический или иммунный ответ» на композицию или вакцину представляет собой формирование в хозяине клеточного- и/или антитело опосредованного иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Таким образом, понятие «вызывает или может вызывать иммунный ответ» означает (но, не ограничиваясь этим) иммунологический процесс в организме-хозяине, характеризующийся тем, что у хозяина вырабатывается клеточною- и/или антитело опосредованный иммунный ответ на представляющую интерес композицию или вакцину. Как правило, «иммунный ответ» включает (но, не ограничиваясь ими) одну или несколько из следующих реакций: производство или активацию антител, В-клеток, Т-клеток-хелперов, Т-клеток-супрессоров и/или цитотоксических Т-клеток и/или yd-T-клеток, направленных специфически на антиген или антигены, включенные в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно организм-хозяин должен вырабатывать либо терапевтический, либо защитный иммунологический ответ так, чтобы повышалась устойчивость к новой инфекции и/или снижалась клиническая серьезность заболевания. Такое защитное действие можно выявлять либо по уменьшению, включая уменьшение серьезности, либо по отсутствию описанных выше симптомов, связанных с заражением хозяина.

Количество антигена, являющееся эффективным в отношении вызывания иммунного ответа у животного, зависит от ингредиентов вакцины и от графика введения. Как правило, когда в вакцине используют убитый бактериальный антиген, то вакцина содержит от примерно 10³ до примерно 10⁹ бактерий на дозу, предпочтительно от примерно 10⁴ до примерно 10⁸ бактерий на дозу, и еще более предпочтительно от примерно 10⁵ до примерно 10⁶ бактерий на дозу.

В частности, когда в комбинированных вакцинах используют модифицированные живые бактерии L. intracellularis, например, изоляты бактерий, обозначенные как изолят В3903, регистрационный номер АТСС РТА-4926, и изолят N34NP40wk, регистрационный номер АТСС 55783 (оба изолята описаны в WO 96/39629 и WO 05/011731), то рекомендованная доза, подлежащая введению чувствительному животному, предпочтительно содержит от примерно 3,0 до примерно 6,0 TCID₅₀ (конечная средняя цитопатогенная доза для культуры ткани)/дозу и более предпочтительно от примерно 4,0 до примерно 5,0 TCID₀/дозу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения титр вакцины составляет примерно 4,9 TCID₅₀/дозу при определении конечной средней цитопатогенной дозы для культуры ткани методом разведении (TCID₅₀).

Субъединицы вакцин, как правило, вводят с уровнем включения антигена, составляющим по меньшей мере 0,2 мкг антигена на дозу, предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу.

Как правило, когда используют очищенные бактерии, то количество антигена должно составлять от 5 до 5000 мкг, и от 10^2,0 до 10^9,0 TCID₅₀, предпочтительно от 10^3,0 до 10^6,0 TCID₅₀, и более предпочтительно от 10^4,0 до 10^5,0 TCID₅₀.

В контексте настоящего описания понятие «высокие дозы», как правило, обозначает по меньшей мере трехкратное количество антигена по сравнению с количеством, которое содержится в одной дозе, обычно применяемой для вакцинации взрослых животных. В частности, понятие «высокие дозы» применительно к живым модифицированным бактериям L. intracellularis обозначает количество, составляющее от по меньшей мере 3×10^3,0 до 3×10^9,0 TCID₅₀, предпочтительно примерно от 3×10^4,5 до 3×10^6,0 TCID₅₀. В частности, применительно к убитому антигену L. intracellularis понятие «высокие дозы» обозначает количество, составляющее по меньшей мере от 3×10^4,0 до 3×10^9,0 организмов или бактерий, предпочтительно примерно от 3×10^6,0 до 3×10^8,0 организмов или бактерий. В частности, применительно к любой субъединице антигена L. intracellularis понятие «высокие дозы» обозначает количество, составляющее по меньшей мере от 3×0,2 до примерно 3×400 (от 0,6 до примерно 1200) мкг/дозу. При создании настоящего изобретения антиген L. intracellularis в высоких дозах вводили беременным свиноматкам с целью индукции повышенного иммунологического ответа у беременной свиноматки, который должен передаваться потомству и обеспечивать определенный уровень иммунитета у родившихся поросят.

В контексте настоящего описания понятие «повторные дозы» означает введение антигена L. intracellularis по меньшей мере дважды, предпочтительно трижды. Примеры режимов вакцинации беременных свиноматок с использованием «повторных доз» приведены выше.

В контексте настоящего описания понятие «повышенная защита» означает (но, не ограничиваясь этим) статистически достоверное уменьшение степени серьезности или частоты встречаемости одного или нескольких клинических симптомов и/или развития повреждений, связанных с инфекциями, вызываемыми L. intracellularis (например, частоты встречаемости макроскопических повреждений, которые определяют согласно методам и критериям, указанным в примере 1, и т.д.) в группе вакцинированных животных, по сравнению с контрольной группой невакцинированных животных. Понятие «статистически достоверное уменьшение клинических симптомов» означает (но, не ограничиваясь этим), что частота встречаемости по меньшей мере одного клинического симптома и/или развития повреждения после контрольного заражения инфекционными бактериями L. intracellularis в группе вакцинированных животных по меньшей мере на 20%, предпочтительно на 30%, еще более предпочтительно на 40%, еще более предпочтительно на 50%, еще более предпочтительно на 60%, еще более предпочтительно на 70%, еще более предпочтительно на 80%, еще более предпочтительно на 90%, и наиболее предпочтительно на 95% меньше, чем в контрольной группе невакцинированных животных.

В контексте настоящего описания понятие «L. intracellularis» или «Lawsonia» относится к внутриклеточным искривленным грамотрицательным бактериям, подробно описанным у С.Gebhart и др., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, том 43, №3, 1993, cc.533-538 и S. McOrist и др., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, том 45, №4, 1995, cc.820-825, каждая публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте и включает (но, не ограничиваясь ими) изоляты, описанные в WO 96/39629 и WO 05/011731. В частности, понятие «L. intracellularis» относится также (но, не ограничиваясь ими) к изолятам, депонированным в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт.Виргиния, 20110-2209, под регистрационным номером АТСС РТА 4926 или под регистрационным номером АТСС РТА 55783. Оба изолята описаны в WO 96/39629 и WO 05/011731 соответственно. Понятие «L. intracellularis» относится также (но, не ограничиваясь ими) к любому другому штамму или изоляту бактерии, который предпочтительно обладает иммуногенными свойствами по меньшей мере одного из штаммов L. intracellularis, описанных в WO 96/39629 и WO 05/011731, в частности, иммуногенными свойствами по меньшей мере одного из изолятов, депонированных в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт.Виргиния, 20110-2209, под регистрационным номером АТСС РТА 4926 или под регистрационным номером АТСС РТА 55783.

Штамм или изолят обладает «иммуногенными свойствами» по меньшей мере одного из штаммов L. intracellularis, описанных в WO 96/39629 и WO 05/011731, в частности, изолятов, депонированных под регистрационным номером АТСС РТА 4926 или регистрационным номером АТСС 55783, если его можно обнаруживать с использованием по меньшей мере одного из специфических к L. intracellularis антител, описанных в WO 06/01294, с помощью метода обнаружения, также описанного в WO 06/01294. Предпочтительно эти антитела выбирают из антител, имеющих ссылочные номера 301:39, 287:6, 268:29, 110:9, 113:2 и 268:18. Предпочтительно метод обнаружения представляет собой сэндвич-ELISA, описанный в примерах 2 и 3 WO 06/12949, в котором антитело 110:9 используют в качестве иммобилизованного антитела и антитело 268:29 используют в качестве конъюгированного антитела. Все антитела, описанные в WO 06/12949, получают с использованием клеток гибридомы, депонированных в Центре прикладной микробиологии и научных исследований (Centre for Applied Microbiology и Research (CAMR)) и в Европейской коллекции клеточных культур (European Collection of Cell Cultures (ЕСАСС)), Солсбери, Уилтшир SP4 OJG, Великобритания, в качестве патентного депозита в соответствии с Будапештским договором. Дата депонирования: 11 мая 2004 г. Линия клеток гибридомы 110:9 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092204. Линия клеток гибридомы 113:2 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092201. Линия клеток гибридомы 268:18 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092202. Линия клеток гибридомы 268:29 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092206. Линия клеток гибридомы 287:6 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092203. Линия клеток гибридомы 301:39 успешно депонирована в ЕСАСС под регистрационным номером 04092205.

Понятие «антиген L. intracellularis» в контексте настоящего описания относится (но, не ограничиваясь ими) к любой заявляемой композиции, содержащей по меньшей мере один антиген, который при введении в организм животного обладает способностью индуцировать, стимулировать или усиливать иммунный ответ на вызываемую L. intracellularis инфекцию. Предпочтительно антиген L. intracellularis представляет собой полную бактерию L. intracellularis, прежде всего в неактивированной форме (так называемую убитую бактерию), модифицированную живую или ослабленную бактерию L. intracellularis (так называемую MLB), любую субъединицу, полипептид или компонент L. intracellularis, или любой химерный вектор, который содержит по меньшей мере одну иммуногенную аминокислотную последовательность L. intracellularis. Понятия «иммуногенный белок», «иммуногенный полипептид» или «иммуногенная аминокислотная последовательность» в контексте настоящего описания относятся к любой аминокислотной последовательности, которая вызывает иммунный ответ у хозяина против патогена, содержащего иммуногенный белок, иммуногенный полипептид или иммуногенную аминокислотную последовательность. В частности, понятие «иммуногенный белок», «иммуногенный полипептид» или «иммуногенная аминокислотная последовательность» L. intracellularis относится к любой аминокислотной последовательности, кодирующей антиген, который вызывает иммунологический ответ против L. intracellularis у хозяина, которому вводят «иммуногенный белок», «иммуногенный полипептид» или «иммуногенную аминокислотную последовательность».

«Иммуногенный белок», «иммуногенный полипептид» или «иммуногенная аминокислотная последовательность» в контексте настоящего описания включают (но, не ограничиваясь ими) полноразмерную последовательность любых белков, их аналогов или их иммуногенных фрагментов. Понятие «иммуногенный фрагмент» обозначает фрагмент белка, который содержит один или несколько эпитопов и в результате этого вызывает иммунологический ответ против соответствующего патогена. Такие фрагменты можно идентифицировать с помощью любого из многочисленных методов картирования эпитопов, известных в данной области (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, том 66, под ред. Glenn E. Morris, изд-во Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). Сущность и содержание этих публикаций включены в настоящее описание в качестве ссылки. Линейные эпитопы можно выявлять, например, осуществляя конкурентный синтез большого количества пептидов на твердых подложках, где пептиды соответствуют фрагментам молекулы белка, и, подвергая пептиды взаимодействию с антителами, причем пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие методы известны в данной области и описаны, например, в US 4708871; у Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc. 3998-4002; Geysen и др., Molec. Immunol. 23, 1986, cc. 709-715. Сущность и содержание этих документов включены в настоящее описание в качестве ссылки. Конформационные эпитопы также легко можно идентифицировать путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса (см., например, Epitope Mapping Protocols, выше). Понятие включает также синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие, полученные рекомбинантными или синтетическими методами антигены (см., например, Bergmann и др., Eur. J. Immunol. 23, 1993, cc. 2777-2781; Bergmann и др., J. Immunol. 157, 1996, cc. 3242-3249; Suhrbier A., Immunol, и Cell Biol. 75, 1997, cc. 402-408; Gardner и др., 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 28 июня-3 июля 1998 г.). Сущность и содержание этих документов включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Пригодные антигены L. intracellularis включают (но, не ограничиваясь ими) антигены, описанные в ЕР 1219711; US 6605696; WO 96/39629; WO 97/20050; WO 00/69903; WO 00/69904; WO 00/69905; WO 00/69906; WO 02/38594; WO 02/26250; WO 03/006665; WO 04/033631; WO 05/026200 и WO 05/011731.

Таким образом, вакцина, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению, содержит любой описанный выше антиген L. intracellularis, который вызывает или может вызывать иммунный ответ против L. intracellularis. Предпочтительно указанная вакцина обеспечивает по меньшей мере повышенную защиту против L. intracellularis.

Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к способу вакцинации молодого животного против инфекций, вызываемых L. intracellularis, который заключается в том, что молодому животному в возрасте примерно до 3 недель вводят антиген L. intracellularis в эффективной дозе, где антиген L. intracellularis выбирают из группы, включающей живые модифицированные бактерии L. intracellularis, убитые бактерии L. intracellularis или одну, или несколько субъединиц бактерий L. intracellularis. Как указано выше, в одном из вариантов осуществления изобретения вакцинацию предпочтительно осуществляют в возрасте от 10 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 12 дней до 21 дня, еще более предпочтительно в возрасте от 15 дней до 21 дня, и наиболее предпочтительно в возрасте от 19 дней до 21 дня. В другом варианте осуществления изобретения вакцинацию предпочтительно осуществляют до достижения 26-дневного возраста, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней, и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня.

Предпочтительно вакцина содержит модифицированные живые бактерии L. intracellularis. Более предпочтительно вакцина представляет собой Enterisol® Ileitis B3903 (фирма Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).

Следующий объект настоящего изобретения относится к способу вакцинации молодого животного, предпочтительно молодого поросенка против инфекций, вызываемых L. intracellularis, который заключается в том, что молодому животному в возрасте от 10 дней включительно и до 26-дневного возраста, более предпочтительно в возрасте от 12 дней до 21 дня, еще более предпочтительно в возрасте от 15 дней до 21 дня, и наиболее предпочтительно в возрасте от 19 дней до 21 дня, или молодому животному в возрасте до 26 дней, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней, и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня, вводят живые модифицированные бактерии L. intracellularis в дозе от примерно 3,0 TCID₅₀ до примерно 6,0 TCID₅₀. Предпочтительно указанные бактерии представляют собой бактерии, содержащиеся в вакцине Enterisol® Ileitis B3903 (фирма Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).

Еще один объект настоящего изобретения относится к способу вакцинации молодого животного, предпочтительно молодого поросенка, против инфекций, вызываемых L. intracellularis, который заключается в том, что молодому животному в возрасте от 10 дней включительно до 26-дневного возраста, более предпочтительно в возрасте от 12 дней до 21 дня, еще более предпочтительно в возрасте от 15 дней до 21 дня, и наиболее предпочтительно в возрасте от 19 дней до 21 дня, или до достижения 26-дневного возраста, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня, вводят антиген L. intracellularis в эффективной дозе, где молодое животное является L. intracellularis - отрицательным, и присутствия материнского антитела к L. intracellularis.

Следующий объект настоящего изобретения относится также к новому медицинскому применению антигена L. intracellularis, взятому в эффективном количестве, для приготовления лекарственного средства, предпочтительно композиции вакцины, предназначенной для вакцинации молодого животного, предпочтительно молодого поросенка, в возрасте от 10 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 12 дней до 21 дня, еще более предпочтительно в возрасте от 15 дней до 21 дня, и наиболее предпочтительно в возрасте от 19 дней до 21 дня, или в возрасте до 26 дней, предпочтительно в возрасте от 16 до 26 дней, более предпочтительно в возрасте от 18 до 24 дней, еще более предпочтительно в возрасте от 19 до 22 дней, и наиболее предпочтительно в возрасте 21 дня.

Согласно еще одному варианту указанного выше медицинского применения антиген L. intracellularis выбирают из группы, включающей живые модифицированные бактерии L. intracellularis, убитые бактерии L. intracellularis или одну, или несколько субъединиц бактерий L. intracellularis. Предпочтительно антиген L. intracellularis представляет собой живые модифицированные бактерии L. intracellularis. Более предпочтительно молодому животному вводят живые модифицированные бактерии L. intracellularis в дозе, составляющей от примерно 3,0 TCID₅₀ до примерно 6,0 TCID₅₀. Получение композиций вакцин, содержащих антиген L. intracellularis, осуществляют общепринятым в данной области методом, известным специалисту в данной области. Специалисту в данной области должны быть известны, например, дополнительные компоненты, которые можно включать в указанную композицию (см. также Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., изд-во Mack Publ., Easton, 1990). Специалист может применять известные инъекционные физиологически приемлемые стерильные растворы. Для приготовления готового к применению раствора для парентеральной инъекции или инфузии легко можно получать водные изотонические растворы, такие, например, как физиологический раствор или растворы, соответствующие белкам плазмы. Композиции вакцины могут находиться в форме лиофилизатов или безводных препаратов, которые можно восстанавливать с помощью известного инъекционного раствора непосредственно перед применением в стерильных условиях, например, они могут представлять собой набор компонентов.

Кроме того, иммуногенные и используемые в качестве вакцин композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать один или несколько приемлемых для ветеринарии носителей. В контексте настоящего описания понятие «приемлемый для ветеринарии» относится к любому и ко всем растворителям, диспергирующим средам, покрытиям, адъювантам, стабилизаторам, разбавителям, консервантам, антибактериальным и противогрибковым агентам, агентам для придания изотоничности, замедляющим адсорбцию агентам и т.п.

Понятие «разбавитель» может обозначать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п. Агенты для придания изотоничности могут представлять собой среди прочего хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. К стабилизаторам относятся среди прочего альбумин и щелочные соли этилендиаминтетрауксусной кислоты.

В контексте настоящего описания понятие «адъюванты» может обозначать гидроксид алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например, Quil A, QS-21 (фирма Cambridge Biotech Inc., Кэмбридж, шт.Массачусетс), GPI-0100 (фирма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, шт. Алабама), эмульсию типа вода в масле, эмульсию типа масло в воде, эмульсию типа вода в масле в воде. Эмульсия, в частности, может быть приготовлена на основе легкого жидкого парафинового масла (удовлетворяющего требованиям Европейской фармакопеи); изопреноидного масла, такого как сквалан или сквален; масла, полученного олигомеризацией алкенов, прежде всего изобутена или децена; эфиров кислот или спиртов, содержащих линейную алкильную группу, более предпочтительно на основе растительных масел, этилолеата, ди(каприлата/капрата) пропиленгликоля, три(каприлата/капрата) глицерина или диолеата пропиленгликоля; эфиров разветвленных жирных кислот или спиртов, прежде всего эфиров изостеариновой кислоты. Для образования эмульсии масло применяют в сочетании с эмульгаторами. Эмульгаторами предпочтительно являются неионогенные поверхностно-активные вещества, прежде всего сложные эфиры сорбитана, маннида (например, безводный маннитолеат), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рициноловой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности, продукты типа плуроник, прежде всего L121 (см. Hunter и др., The Theory и Practical Application of Adjuvants, под ред. Stewart-Tull, D.E.S., изд-во JohnWiley и Sons, NY, 1995, cc.51-94 и Todd и др., Vaccine 15, 1997, cc.564-570). Сущность и содержание указанных публикаций включены в настоящее описание в качестве ссылки. Например, можно применять эмульсию SPT, описанную на с.147 «Vaccine Design, The Subunit и Adjuvant Approach», под ред. M. Powell и M. Newman, изд-во Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на с.183 этой же самой книги. Сущность и содержание указанных публикаций включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного. Предпочтительными адъювантами являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, сшитые, прежде всего, с простыми полиалкениловыми эфирами сахаров или многоатомных спиртов. Эти соединения известны под названием карбомеры (Phameuropa, том 8, No. 2, июнь 1996 г.). Специалисты в данной области могут найти соответствующие сведения также в US 2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, сшитые с полигидроксилированным соединением, которое имеет по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, причем атомы водорода по меньшей мере в трех гидроксилах замещены ненасыщенными алифатическими радикалами, содержащими по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными являются радикалы, содержащие от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие группы с этиленовой ненасыщенной связью. Ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил. Наиболее пригодными являются продукты, пос