Усовершенствования, касающиеся везикул внешней мембраны менингококков

Усовершенствования, касающиеся везикул внешней мембраны менингококков

Реферат

Все процитированные здесь документы во всей полноте включены в настоящее описание посредством ссылки.

Область техники настоящего изобретения

Изобретение относится к области везикул внешней мембраны менингококков для целей иммунизации.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Один из многочисленных подходов к иммунизации против инфекции Neisseria meningitidis (менингококка) заключается в использовании везикул внешней мембраны (OMV). Эффективная вакцина против менингококка серогруппы В на основе OMV была получена в Национальном институте здравоохранения Норвегии (Norwegian National Institute of Public Health) ['MenBvac™'; например, ссылка

1], но хотя эта вакцина безопасна и предотвращает заболевание, вызываемое MenB, ее эффективность ограничена гомологичным серотипом, используемым для приготовления вакцины.

Вакцина 'RIVM' основана на OMV, содержащих шесть различных подтипов PorA. В ходе фазы II клинических испытаний было показано, что она иммуногенна у детей [2].

В ссылке 3 раскрыта вакцина против различных патогенных серотипов менингококка серогруппы В на основе OMV, в которых сохранился белковый комплекс массой 65 кДа. В ссылке 4 раскрыта вакцина, содержащая OMV из штаммов генетически сконструированных менингококков, причем OMV содержат, по меньшей мере, один белок внешней мембраны (ОМР) класса 1, но не содержат ОМР классов 2/3. В ссылке 5 раскрыты OMV, содержащие ОМР, содержащие мутации в поверхностных петлях, и OMV, содержащие производные менингококкового липополисахарида (LPS). В ссылке 6 раскрыт способ приготовления вакцин против менингококка серогруппы А на основе OMV.

Высказано множество предложений по повышению эффективности OMV. В ссылке 7 раскрыты композиции, содержащие OMV, дополненные трансферринсвязывающими белками (например, TbpA и TbpB) и/или Cu,Zn-супероксиддисмутазой. В ссылке 8 раскрыты композиции, содержащие OMV, дополненные множеством белков. В ссылке 9 раскрыты препараты мембранных везикул, полученных из N. meningitidis с модифицированным геном fur. В ссылке 26 описано, что экспрессия nspA должна положительно регулироваться одновременным выключением porA и cps. Другие нокаут-мутанты N. meningitidis для получения OMV раскрыты в ссылках 26-28. В отличие от этих попыток усовершествования OMV путем изменения профилей экспрессии авторы ссылки 29 сосредоточили усилия на изменении способов получения OMV и сообщили, что такие антигены, как NspA, могут быть сохранены в ходе экстракции везикул путем избегания использования таких поверхностно-активных веществ, как дезоксихолат.

Неспособность менингококковых OMV индуцировать перекрестную защиту от менингококков негомологичных серотипов ограничивает их использование в качестве общих вакцин, но они могут быть весьма полезны при эпидемиях, при которых заболевание вызвано по существу клональными патогенными штаммами. Так, вакцина, разработанная в Finlay Institute (VA-MENGOC-BC™), оказалась полезна в Латинской Америке, где вызвавшие заболевание менингококки серогруппы В преимущественно принадлежали к серотипу Р1.19,15, но больше нигде не была эффективна [10]. Аналогично, разработанная Chiron вакцина MeNZB™ была направлена против эпидемического штамма (Р1.7b,4, известного в последней номенклатуре как Р1.7-2,4), который преобладал в Новой Зеландии с 1991 года.

В ссылке 11 раскрыта вакцина на основе мультивалентных композиций менингококковых пузырьков, содержащих первый тип пузырьков, полученных из менингококков штамма, характеризующегося сероподтипом, преобладающим в государстве применения, и второй тип пузырьков, полученных из менингококков штамма, необязательно характеризующегося сероподтипом, преобладающим в государстве применения.

Целью изобретения является создание дополнительных и усовершенствованных препаратов менингококковых OMV.

Раскрытие настоящего изобретения

Опыт применения MeNZB™ показал, что OMV, направленные против конкретных эпидемических штаммов, могут быть чрезвычайно эффективно использованы для борьбы с локальными вспышками заболевания. При вспышке вакцина может быть быстро произведена с помощью крупномасштабных и воспроизводимых технологий производства. Таким образом, изобретение относится к способу получения вакцины на основе везикул внешней мембраны (OMV) менингококков, предусматривающему следующие стадии: (i) идентификация сероподтипа штамма менингококков, связанного со вспышкой менингококкового менингита; (ii) получение OMV из менингококкового штамма, характеризующегося сероподтипом, идентифицированным на стадии (i), для использования в производстве вакцин. Способ может предусматривать одну или обе из следующих дополнительных стадий: (iii) приготовление указанных OMV в форме вакцины и (iv) распределение указанной вакцины по географической области, которая подвержена или может быть подвержена указанной вспышке. Изобретение также относится к такому же способу без стадии (i), применимому в ситуациях, в которых ответственный за вспышку сероподтип уже идентифицирован. Менингококковый штамм, как правило, принадлежит к серогруппе В, но альтернативно может относиться к серогруппе А, С, W135, Y и т.д.

Опыт применения MeNZB™ также позволил авторам настоящего изобретения предположить, что OMV применимы для иммунизации против менингококков серогрупп А, С, W135 и Y либо по отдельности, либо в сочетании и что их производство может обойтись дешевле, чем производство предлагаемых в настоящее время конъюгированных вакцин. Таким образом, изобретение относится к (а) композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококка штамма серогруппы С; (b) композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококка штамма серогруппы W135; (с) композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококка штамма серогруппы Y; и (d) композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококка штаммов двух или более серогрупп А, В, С, W135 и Y. В разделе (d) предпочтительные композиции включают в себя следующие смеси серогрупп: А+В; А+С; A+W135; A+Y; B+C; B+W135; B+Y; C+W135; C+Y; W135+Y; А+В+С; A+B+W135; A+B+Y; A+C+W135; A+C+Y; A+W135+Y; B+C+W135; B+C+Y; C+W135+Y; A+B+C+W135; A+B+C+Y; B+C+W135+Y и A+B+C+W135+Y.

Поскольку существует общность субкапсулярных антигенов между серогруппами, OMV (и смеси OMV) способны обеспечивать защиту от менингококков не только той серогруппы, из которой они были получены. Например, субкапсулярные антигены штаммов серогрупп А и W135, наблюдающихся в африканских государствах, расположенных южнее Сахары, идентичны с таковыми штаммов серогрупп С и Y, наблюдающихся по всему миру. Таким образом, изобретение относится к применению OMV из штамма менингококков первой серогруппы для защиты от одного или нескольких штаммов менингококков второй серогруппы, причем указанные первая и вторая серогруппы отличны. Штаммы предпочтительно содержат одинаковые субкапсулярные антигены и могут характеризоваться одним подтипом, сероподтипом и/или иммунотипом даже несмотря на то, что принадлежат к различным серогруппам. Предпочтительной является смесь OMV менингококков серогрупп А и W135, а также смесь OMV менингококков серогрупп С и Y.

Опыт применения MeNZB™ также позволил авторам настоящего изобретения предположить, что смесь OMV из штаммов, используемых для получения OMV новозеландских штаммов, OMV норвежских штаммов и OMV кубинских штаммов, характеризуется приемлемой эффективностью. Таким образом, изобретение относится к композиции, содержащей везикулы внешней мембраны из двух из трех следующих менингококков: (i) менингококк сероподтипа Р1.7b,4; (ii) менингококк сероподтипа Р1.7,6 и (iii) менингококк сероподтипа P1.19,15. Различные OMV предпочтительно находятся в смеси, но, альтернативно, они могут содержаться в отдельных контейнерах в составе набора.

Комбинируя OMV менингококков различных сероподтипов, авторы настоящего изобретения обнаружили, что дозы OMV менингококков отдельных сероподтипов могут быть снижены без потери эффективности. Тогда как VA-MENGOC-B™ содержит 50 мкг OMV (в объеме 0,5 мл), НехаМеn™ содержит около 1 мг OMV (в объеме 0,3 мл), а как MenBVac™, так и MeNZB™ содержат 25 мкг OMV (в объеме 0,5 мл) в расчете на общее содержание белка, авторы настоящего изобретения обнаружили, что доза отдельных OMV может быть снижена, если смесь используется без потери индивидуальной эффективности. Таким образом, изобретение относится к композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококков первого сероподтипа и менингококков второго сероподтипа, причем концентрация OMV менингококков первого сероподтипа составляет менее 45 мкг/мл и концентрация OMV менингококков второго сероподтипа составляет менее 45 мкг/мл. Изобретение также относится к композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококков, по меньшей мере, двух сероподтипов, причем совокупная концентрация OMV составляет менее 90 мкг/мл. Изобретение также относится к композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококков n различных сероподтипов, причем концентрация OMV менингококков каждого сероподтипа составляет менее 45 мкг/мл (т.е. совокупная доза OMV составляет менее 45n мкг/мл). Значение n может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6 и т.д.

Изобретение также относится к набору, содержащему OMV, полученные из менингококков n различных сероподтипов. Везикулы могут содержаться или храниться в составе набора раздельно до тех пор, пока не возникнет необходимость их совместного использования, например, в виде смеси или одновременного раздельного или последовательного использования. Аналогично, изобретение относится к способу, предусматривающему получение n серий OMV, по одному из менингококков каждого из n различных сероподтипов; и объединение n серий везикул. Различные серии могут быть объединены в набор или в смесь.

Изобретение также относится к композиции, содержащей OMV, полученные из менингококков штамма серогруппы В, характеризующегося сероподтипом Р1.7b,4, причем концентрация OMV в композиции составляет около 50 мкг/мл. Композиция предпочтительно содержит адъювант на основе гидроксида алюминия и гистидиновый буфер. Композиция может быть введена в составе дозы объемом около 0,5 мл.

Везикулы

Изобретение основано на везикулах внешней мембраны (OMV), полученных из Neisseria meningitidis. Термин "OMV" относится к любой протеолипосомной везикуле, полученной путем разрушения внешней мембраны бактерии с образованием из внешней мембраны везикул, содержащих белковые компоненты внешней мембраны. OMV искусственно получают из бактерий (например, путем обработки поверхностно-активными веществами или средствами, отличными от поверхностно-активных веществ [29]). Термин также охватывает пузырьки, микровезикулы (MV [12]) и 'нативные OMV' ('NOMV [13]), которые представляют собой природные мембранные везикулы, которые спонтанно образуются в процессе роста бактерий и высвобождаются в культуральную среду. MV могут быть получены путем культивирования Neisseria в бульонной культуральной среде, отделения цельных клеток от меньших MV в бульонной культуральной среде (например, путем фильтрования или низкоскоростного центрифугирования для осаждения только клеток, но не меньших везикул) с последующим сбором MV из бесклеточной среды (например, путем фильтрования, дифференциального осаждения или агрегации MV, высокоскоростного центрифугирования для осаждения MV). Штаммы, применимые для получения MV, как правило, могут быть выбраны по количеству MV, получаемых в культуре, например, в ссылках 14 и 15 описана Neisseria с высоким выходом MV.

OMV могут быть получены различными способами. Способы получения подходящих препаратов раскрыты, например, в процитированных здесь ссылках. Методики получения OMV включают в себя обработку бактерий поверхностно-активными солями желчных кислот (например, солей литохолевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, холевой кислоты, урсохолевой кислоты и т.д., причем предпочтительным для обработки Neisseria является дезоксихолат натрия [16 и 17]) при значении рН, достаточно высоком для того, чтобы не вызвать преципитацию поверхностно-активного вещества [6]. Другие методики могут быть осуществлены по существу в отсутствие поверхностно-активного вещества [29], включая такие методики, как обработка ультразвуком, гомогенизация, микрофлуидизация, кавитация, осмотический удар, размалывание, обработка с помощью пресса Френча, смешивание и т.д.

Предпочтительный способ получения OMV предусматривает ультрафильтрацию [18] вместо высокоскоростного центрифугирования неочищенных OMV. Это позволяет перерабатывать гораздо большие количества содержащего OMV супернатанта за гораздо более короткое время (как правило, >15 литров за 4 часа по сравнению с <1,5 литрами за 10 часов) и избегать необходимости повторного диспергирования OMV после центрифугирования. Ультрацентрифугирование позволяет гораздо легче получать большие количества OMV и обеспечивает быстрое получение OMV из выбранного штамма для использования в приготовлении вакцин.

Менингококковые штаммы, используемые для приготовления вакцин

Идентификация сероподтипа интересующего менингококкового штамма может быть проведена в соответствии со стандартными методиками на основе белка внешней мембраны порина класса I (PorA). После того как определен сероподтип, найти другие известные штаммы, принадлежащие к тому же сероподтипу, можно в соответствии с рутинными процедурами. Другие штаммы могут принадлежать к той же серогруппе и/или серотипу (PorB), что и первый штамм, но не обязательно. Однако, как правило, предпочтительно, чтобы совпали как серогруппа, так и сероподтип.

Менингококковые штаммы, используемые в соответствии с изобретением, как правило, относятся к одной из следующих серогрупп: А, В, С, W135 или Y.

Менингококковые штаммы, используемые в соответствии с изобретением, как правило, не являются штаммами, экспрессирующими множественные сероподтипы (т.е. множественные аллели PorA). Таким образом, предпочтительные бактерии, используемые в соответствии с изобретением, экспрессируют одну последовательность PorA, т.е. они не принадлежат к одному сероподтипу.

Также могут быть использованы штаммы с отрицательно регулированным PorA, например штаммы, в которых количество PorA снижено, по меньшей мере, на 20% (например, >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, >95% и т.д.) или в которых его ген даже выключен относительно содержания в штамме дикого типа (например, относительно штамма Н44/76, раскрытого в ссылке 11).

Менингококки, используемые в соответствии с изобретением, могут принадлежать к любому серотипу (например, 1, 2а, 2b, 4, 14, 15, 16 и т.д.) и/или к любому иммунотипу (например, L1; L3,3,7; L10 и т.д.). Менингококки могут относиться к любой подходящей группе, включая гиперинвазивные и гипервирулентные группы, например к любой из следующих семи гипервирулентных групп: подгруппе I; подгруппе III; подгруппе IV-1; комплексу ЕТ-5; комплексу ЕТ-37; кластеру А4; группе 3. Эти группы определяли по методу мультилокусного ферментного электрофореза (MLEE), но для классификации менингококков также использовали мультилокусное типирование последовательностей (MLST) [ссылка 19], например, комплекс ЕТ-37 определяется по методу MLST как ST-11, комплекс ЕТ-5 определяется как ST-32 (ЕТ-5), группа 3 определяется как ST-41/44 и т.д.

Менингококки могут содержать одну или несколько мутаций гена(ов). Например, для снижения пирогенной активности бактерия должна содержать мало эндотоксинов (LPS), и это может быть достигнуто выключением генов ферментов, участвующих в биосинтезе LPS. Уже известны подходящие мутантные бактерии, например мутантная Neisseria [20, 21] и мутантная Helicobacter [22]. Способы получения лишенных LPS внешних мембран грамотрицательных бактерий раскрыты в ссылке 23.

Помимо отрицательной регуляции экспрессии конкретных белков, бактерия может усиленно экспрессировать (относительно соответствующего штамма дикого типа) иммуногены, такие как NspA, белок 287 [8], белок 741 [30], TbpA [7], TbpB [7], супероксиддисмутаза [7] и т.д.

Помимо выключенных определенных эндогенных генов, бактерия может экспрессировать один или несколько генов, не являющихся эндогенными. Например, изобретение может предусматривать использование рекомбинантного штамма, экспрессирующего новые гены относительно соответствующего штамма дикого типа. Экспрессия неэндогенных генов, таким образом, может быть достигнута различными способами, например с помощью введения хромосом (используемого для введения множественных генов PorA [24]), включающих мутаций, экспрессии экстрахромосомными векторами (например, плазмидами) и т.д.

Бактерия также может нести одну или несколько мутаций, детерминирующих выключение и/или усиленную экспрессию, описанных в ссылках 25-30. Предпочтительные гены, подходящие для отрицательной регуляции и/или выключения, включают в себя: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [25]; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [26]; (с) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [27] и (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB и/или SynC [28].

Помимо объединения OMV на основании различных сероподтипов, сочетания могут быть составлены в соответствии с другими критериями. Показательные критерии включают в себя серотип (PorB, ОМР класса 2 или 3); иммунотип (липополисахарид или липоолигосахарид); географическое происхождение штаммов; локальное преобладание клинических штаммов; гипервирулентная группа, например две или более из подгрупп I, III и IV-1, комплекса ЕТ-5, комплекса ЕТ-37, кластера А4 и группы 3; мультилокусный тип последовательности (MLST) [19]; более одного из трех различных вариантов NMB1870 [31].

Дозирование OMV

Существующие вакцины на основе менингококковых OMV обеспечивают фармацевтический, позологический и композиционный аспекты для осуществления изобретения. Например, VA-MENGOC-BC™ представляет собой инъецируемую суспензию объемом 0,5 мл, содержащую 50 мкг OMV из штамма Сu-385-83 и 50 мкг капсульного полисахарида серогруппы С, адсорбированного на 2 мг гелеобразного гидроксида алюминия с добавлением 0,01% тиомерсала и фосфатного буфера. MeNZB™ также представляет собой суспензию объемом 0,5 мл, содержащую 25 мкг OMV из штамма NZ98/254, адсорбированных на 1,65 мг адъюванта на основе гидроксида алюминия, с гистидиновым буфером и хлоридом натрия. MenBvac схожа с MeNZB™, но приготовлена из штамма 44/76.

Концентрация OMV менингококков каждого подтипа должна быть достаточно высока для того, чтобы обеспечить формирование протективного иммунитета после введения пациенту. Концентрация OMV в композициях согласно изобретению, как правило, находится в диапазоне от 10 до 500 мкг/мл, предпочтительно, от 25 до 200 мкг/мл и, более предпочтительно, около 50 мкг/мл или около 100 мкг/мл (в расчете на общее содержание белка в OMV).

Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что если композиция содержит OMV более чем из одного менингококкового сероподтипа, дозы OMV отдельных сероподтипов могут быть снижены без потери эффективности. В частности, доза новозеландского и норвежского подтипов может быть снижена вдвое с 25 мкг до 12,5 мкг в дозе объемом 0,5 мл без потери иммуногенности. Таким образом, композиция согласно изобретению, содержащая везикулы внешней мембраны из менингококков более одного подтипа, может содержать менее 100 мкг/мл, чего можно было бы заведомо ожидать в результате простого смешивания MenBvac™ и MeNZB™, и менее 150 мкг/мл, чего можно было бы заведомо ожидать в результате простого смешивания VA-MENGOC-ВС™ либо с MenBvac™, либо с MeNZB™. Таким образом, такие композиции согласно изобретению характеризуются совокупной концентрацией OMV не более 90 мкг/мл (например, не более 80 мкг/мл, 70 мкг/мл, 60 мкг/мл, 50 мкг/мл, 40 мкг/мл, 30 мкг/мл или даже менее).

Более обобщенно, если композиция содержит везикулы внешней мембраны из менингококков n различных подтипов, концентрация OMV из менингококков каждого подтипа составляет менее 45 мкг/мл (например, менее 40 мкг/мл, 35 мкг/мл, 30 мкг/мл, 25 мкг/мл, 20 мкг/мл или даже менее). Предпочтительной является концентрация около 25 мкг/мл.

Если композиция содержит везикулы внешней мембраны из менингококков n различных подтипов, количества OMV каждого подтипа предпочтительно отличаются друг от друга не более чем на ±10%, т.е. композиция содержит по существу равные массы каждого OMV. Однако в определенных обстоятельствах количество OMV одного подтипа может быть приблизительно в х раз больше, чем количество OMV другого, причем х равно 2, 3 или 4, например, композиция может содержать двойную дозу OMV одного подтипа относительно содержания в композиции OMV другого(их) подтипа(ов).

Фармацевтические композиции, содержащие OMV

Композиции согласно изобретению могут представлять собой фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель. Такие композиции могут быть приготовлены в соответствии со способом, предусматривающим стадию смешивания OMV с фармацевтически приемлемым носителем.

Типичные "фармацевтически приемлемые носители" включают в себя любой носитель, который сам по себе не индуцирует выработку антител, вредных для субъекта, получающего композицию. Подходящие носители, как правило, представляют собой крупные медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и агрегаты липидов (такие как масляные капли или липосомы). Такие носители хорошо известны средним специалистам в данной области техники. Вакцины также могут содержать разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин и т.д. Кроме того, в таких носителях могут содержаться вспомогательные вещества, такие как увлажняющие вещества или эмульгаторы, рН-буферные вещества, сахароза и т.п. Типичным носителем является стерильный апирогенный фосфатно-буферный физиологический раствор (например, на основе воды для инъекций). С подробным обсуждением фармацевтически приемлемых наполнителей можно ознакомиться в ссылке 32.

Композиции согласно изобретению, как правило, находятся в водной форме (например, растворов или суспензий) предпочтительнее, чем в сухом виде (например, лиофилизированном). Водные композиции также применимы для восстановления других вакцин из лиофилизированной формы (например, лиофилизированной конъюгированной вакцины против Hib, лиофилизированной конъюгированной вакцины против менингококка и т.д.). Если композиция согласно изобретению подлежит использованию, предусматривающему такое восстановление непосредственно перед применением, изобретение относится к набору, который может содержать два флакона или может содержать один шприц-тюбик и один флакон, причем водное содержимое шприц-тюбика используют для реактивации сухого содержимого флакона перед инъекцией.

Композиции согласно изобретению могут находиться во флаконах, или они могут находиться в шприц-тюбиках. Шприцы могут поставляться с иглами или без них. Композиции могут быть упакованы в однократную дозированную форму или многократную дозированную форму. Шприц, как правило, содержит однократную дозу композиции, тогда как флакон может содержать однократную дозу или многократные дозы. Таким образом, для многократных дозированных форм флаконы предпочтительны по сравнению со шприц-тюбиками.

Эффективные объемы доз могут быть установлены в соответствии с рутинными процедурами, но типичная доза композиции для введения человеку имеет объем около 0,5 мл, например, для внутримышечной инъекции. Вакцину RIVM на основе OMV вводили в объеме 0,5 мл [33] внутримышечной инъекцией в бедро или плечо. MeNZB™ вводят в объеме 0,5 мл внутримышечной инъекцией в переднелатеральную часть бедра или область дельтовидной мышцы руки. Аналогичные дозы могут быть использованы при других путях доставки, например, за одно распыление может быть интраназально распылено около 100 мкл или около 130 мкл вакцины RIVM на основе OMV [13], причем четыре распыления обеспечивают введение суммарной дозы в объеме около 0,5 мл.

Значение рН композиции, предпочтительно, составляет от 6 до 8 и, более предпочтительно, от 6,5 до 7,5 (например, около 7). Значение рН вакцины RIVM на основе OMV составляет 7,4 [34], а значение рН <7,5 является предпочтительным для композиций согласно изобретению. Стабильное значение рН может поддерживаться путем использования буфера, например трис-буфера, фосфатного буфера или гистидинового буфера. Композиции согласно изобретению, как правило, содержат буфер. Если композиция содержит гидроксид алюминия, предпочтительно использовать гистидиновый буфер [35], например, в концентрации 1-10 мМ, предпочтительно, около 5 мМ. Значение рН вакцины RIVM на основе OMV поддерживается путем использования 10 мМ буфера трис/HCl. Композиция может являться стерильной и/или апирогенной. Композиции согласно изобретению могут быть изотоничны относительно физиологических сред организма человека.

Композиции согласно изобретению являются иммуногенными и, более предпочтительно, представляют собой вакцинные композиции. Вакцины согласно изобретению могут быть либо профилактическими (т.е. предназначенными для профилактики инфекции), либо терапевтическими (т.е. предназначенными для лечения инфекции), но, как правило, являются профилактическими. Иммуногенные композиции, используемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигена(ов), а также при необходимости любых других компонентов. Под термином "иммунологически эффективное количество" подразумевается, что введение такого количества субъекту либо однократной дозой, либо в качестве части курса эффективно для лечения или профилактики. Это количество варьирует в зависимости от состояния здоровья и физического состояния подлежащего лечению субъекта, возраста, таксономической группы подлежащего лечению субъекта (например, нечеловекообразный примат, примат и т.д.), способности иммунной системы субъекта синтезировать антитела, желаемой степени защиты, состава вакцины, суждения лечащего врача о клинической ситуации и других влияющих факторов. Ожидается, что количество будет разниться в относительно широких пределах, которые могут быть определены в соответствии с рутинными испытаниями. Содержание антигена в композициях согласно изобретению, как правило, выражают в количестве белка на дозу. Типичной для интраназально вводимых вакцин на основе OMV является доза, составляющая около 0,9 мг белка на мл [13].

Менингококки поражают различные отделы организма, и, соответственно, композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в различных формах. Например, композиции могут быть приготовлены в виде препаратов для инъекций либо в форме истинных растворов, либо суспензий. Может быть приготовлена композиция для легочного введения, например, в форме ингалятора, содержащего мелкодисперсный порошок или спрей. Может быть приготовлена композиция в форме суппозитория или пессария. Может быть приготовлена композиция для назального, ушного или глазного введения, например, в форме спрея, капель, геля или порошка [например, ссылки 36 и 37]. Типичными являются инъецируемые препараты для внутримышечного введения.

Композиции согласно изобретению могут содержать антимикробное вещество, особенно при упаковке в форму многократного дозирования. Обычно в вакцинах содержатся такие антимикробные вещества, как тиомерсал и 2-феноксиэтанол, но предпочтительно использовать либо не содержащий ртуть консервант, либо не использовать консервант совсем.

Композиции согласно изобретению могут содержать поверхностно-активное вещество, например Tween (полисорбат), такой как Tween 80. Поверхностно-активные вещества, как правило, содержатся в низких концентрациях, например <0,01%.

Композиции согласно изобретению могут содержать остаточное количество поверхностно-активного вещества (например, дезоксихолата) из препарата OMV. Остаточное количество поверхностно-активного вещества предпочтительно составляет менее 0,4 мкг (более предпочтительно, менее 0,2 мкг) на каждый мкг белка.

Композиции согласно изобретению могут содержать LPS менингококков. Количество LPS предпочтительно составляет менее 0,12 мкг (более предпочтительно, менее 0,05 мкг) на каждый мкг белка.

Композиции согласно изобретению могут содержать соли натрия (например, хлорид натрия) для обеспечения нужной тоничности. Типичной является концентрация 10±2 мг/мл NaCl. Концентрация хлорида натрия предпочтительно составляет около 9 мг/мл.

Композиции согласно изобретению, как правило, вводят в сочетании с другими иммунорегуляторными агентами. В частности, композиции обычно содержат один или несколько адъювантов, и изобретение относится к способу приготовления композиции согласно изобретению, предусматривающему стадию смешивания везикул согласно изобретению с адъювантом, например, в фармацевтически приемлемом носителе. Подходящие адъюванты включают без ограничения:

А. Минералсодержащие композиции

Минералсодержащие композиции, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, содержат минеральные соли, такие как соли алюминия и соли кальция. Изобретение предусматривает использование минеральных солей, таких как гидроксиды (например, оксигидроксиды), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.д. [см., например, главы 8 и 9 ссылки 38], или смесей различных минеральных соединений, причем указанные соединения принимают любую подходящую форму (например, геля, кристаллического вещества, аморфного вещества и т.д.), причем предпочтительной является адсорбция. Минералсодержащие композиции также могут быть приготовлены в форме частиц солей металлов [39].

Типичный адъювант на основе фосфата алюминия представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным отношением РО₄/Al, составляющим от 0,84 до 0,92, содержащийся в концентрации 0,6 мг Al³⁺/мл. Может быть использована адсорбция на малом количестве фосфата алюминия, например от 50 до 100 мкг Al³⁺ на дозу. Если используют фосфат алюминия и желательно не адсорбировать антиген на адъювант, этого достигают путем включения в состав раствора свободных фосфат-ионов (например, путем использования фосфатного буфера).

Вакцину RIVM испытывали при адсорбции либо на адъювант на основе фосфата алюминия, либо на адъювант на основе гидроксида алюминия, и было обнаружено, что при использовании адъюванта на основе фосфата алюминия достигаются лучшие результаты [34]. Каждый из продуктов MeNZB™, MenBvac™ и VA-MENINGOC-BC™ содержит адъювант на основе гидроксида алюминия.

Типичная доза адъюванта на основе соединений алюминия составляет около 3,3 мг/мл (выраженная в расчете на концентрацию Al³⁺).

В. Масляные эмульсии

Композиции в форме масляной эмульсии, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, содержат эмульсии сквалена-воды, такие как MF59 [глава 10 ссылки 38; см. также ссылку 40] (5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85, приготовленные в виде субмикронных частиц с помощью микрофлуидайзера). Также могут быть использованы полный адъювант Фройнда (CFA) и неполный адъювант Фройнда (IFA).

С. Сапонинсодержащие составы [глава 22 ссылки 38]

В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы сапонинсодержащие составы. Сапонины представляют собой разнородную группу стероидных гликозидов и тритерпеноидных гликозидов, которые содержатся в коре, листьях, стеблях, корнях и даже цветках широкого круга видов растений. В качестве адъюванта был хорошо исследован сапонин из коры мыльного дерева Quillaia saponaria Molina. Сапонин также может быть промышленно получен из Smilax ornata (сарсапарели), Gypsophilla paniculata (гипсофилы ползучей) и Saponaria officinalis (мыльного корня). Сапонинсодержащие адъювантные составы включают в себя очищенные составы, такие как QS21, равно как и липидные составы, такие как ISCOM. QS21 распространяется на рынке под наименованием Stimulon™.

Сапонинсодержащие композиции очищали по методу ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ. С помощью этих методов были выделены конкретные очищенные фракции, включая QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B и QH-C. Предпочтительно, сапонин представляет собой QS21. Методика получения QS21 описана в ссылке 41. Сапонинсодержащие составы также могут содержать стерин, такой как холестерин [42].

Сочетания сапонинов и холестеринов может быть использовано для формирования уникальных частиц, называемых иммуностимулирующими комплексами (ISCOM) [глава 23 ссылки 38]. ISCOM, как правило, также содержат фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. Для получения ISCOM может быть использован любой известный сапонин. Предпочтительно, ISCOM содержит один или несколько из QuilA, QHA и QHC. ISCOM более подробно описаны в ссылках 42-44. При необходимости ISCOM могут не содержать дополнительных поверхностно-активных веществ [45].

С обзором разработки адъювантов на основе сапонинов можно ознакомиться в ссылках 46 и 47.

D. Виросомы и вирусоподобные частицы

Виросомы и вирусоподобные частицы (VLP) также могут быть использованы в качестве адъювантов в соответствии с изобретением. Эти структуры, как правило, содержат один или несколько вирусных белков, необязательно объединенных или включенных в композицию с фосфолипидом. Как правило, они не патогенны, не способны к репликации и не содержат каких-либо частей нативного вирусного генома. Вирусные белки могут быть получены в соответствии с рекомбинантными методиками или выделены из цельных вирусов. Такие вирусные белки, пригодные для использования в получении виросом или VLP, включают в себя белки, полученные из вируса гриппа (такие как НА или NA), вируса гепатита В (такие как коровые или капсидные белки), вируса гепатита Е, вируса кори, вируса Синдбис, ротавируса, вируса ящура, ретровируса, вируса Норуолк, вируса папилломы человека, ВИЧ, РНК-фагов, Qβ-фага (такие как белки оболочки), GA-фага, fr-фага, фага АР205 и Ту (такие как белок р1 ретротранспозона Ту). VLP более подробно обсуждаются в ссылках 48-53. Виросомы более подробно обсуждаются, например, в ссылке 54.

Е. Бактериальные или микробные производные

Адъюванты, пригодные для использования в соответствии с изобретением, включают в себя бактериальные или микробные производные, такие как нетоксичные производные энтеробактериального липополисахарида (LPS), производные липида А, иммуностимулирующие олигонуклеотиды и АДФ-рибозилирующие токсины и их обезвреженные производные.

Нетоксичные производные LPS включают в себя монофосфорил-липид A (MPL) и 3-O-дезацилированный MPL (3dMPL). 3dMPL представляет собой смесь 3-дез-O-ацилированного монофосфорил-липида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительная форма 3-дез-O-ацилированного монофосфорил-липида А в виде "мелких частиц" описана в ссылке 55. Такие "мелкие частицы" 3dMPL достаточно малы для того, чтобы стерильно фильтроваться через мембрану с размером ячеи 0,22 мкм [55]. Другие нетоксичные производные LPS включают в себя миметики монофосфорил-липида А, такие как производные аминоалкилглюкозаминидфосфата, например RC-529 [56, 57].

Производные липида А включают в себя производные липида А из Escherichia coli, такие как ОМ-174. ОМ-174 описан, например, в ссылках 58 и 59.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя нуклеотидные последовательности, содержащие мотив CpG (динуклеотидную последовательность, состоящую из неметилированного цитозина, связанного фосфатной связью с гуанозином). Также был продемонстрирован иммуностимулирующий эффект двухцепочечных РНК и олигонуклеотидов, содержащих палиндромные или поли(dG) последовательности.

CpG могут содержать нуклеотидные модификации/аналоги, такие как фосфоротиоатные модификации, и могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. В ссылках 60, 61 и 62 описаны возможные аналогичные замены, например замена гуанозина 2'-дезокси-7-дезазагуанозином. Адъювантный эффект олигонуклеотидов CpG более подробно обсуждается в ссылках 63-68.

Последовательность CpG, такая как мотив GTCGTT или TTCGTT, может быть направлена на TLR9 [69]. Последовательность CpG, такая как CpG-A ODN, может специфично индуцировать Тh1-зависимый иммунный ответ, или последовательность CpG, такая как CpG-B ODN, может более специфично индуцировать В-клеточный ответ. CpG-A и CpG-B ODN обсуждаются в ссылках 70-72. Предпочтительно, CpG представляет собой CpG-A ODN.

Предпочтительно, олигонуклеотид CpG конструируют таким образом, что 5'-конец доступен для распознавания рецептора. Необязательно две олигонуклеотидные последовательности CpG могут быть соединены своими 3'-концами с образованием "иммуномеров". См., н