Модифицированный вирус гриппа, предназначенный для мониторинга и повышения эффективности вакцины

Модифицированный вирус гриппа, предназначенный для мониторинга и повышения эффективности вакцины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США No.60/705808, зарегистрированной 4 августа 2005 г, которая во всей полноте включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Заявление, касающееся исследования или разработки, субсидировавшихся за счет федеральных средств

Исследование, в результате которого было создано настоящее изобретение, проводилось в рамках гранта AI95357 Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (National Institute of Allergy and Infectious Disease) и при поддержке Центра раковых исследований (Cancer Center Support (CORE)) в рамках гранта СА21765 Национальных институтов здравоохранения (National Institutes of Health). В соответствии с этим правительство США обладает определенными правами на изобретение.

Ссылка на приложение, записанное на компактном диске

Не применимо.

Область техники, к которой относится изобретение

В целом настоящее изобретение относится к повышению антигенности и/или иммуногенности определенных подтипов группы вирусов гриппа.

Предпосылки создания изобретения

Вирусы гриппа

Вирусы гриппа, среди которых, прежде всего, следует отметить конкретные штаммы вирусов А и В, являются серьезной причиной заболеваемости и смертности во всем мире в результате ежегодных вспышек заболевания. Периодически, но с нерегулярными интервалами возникают пандемии, приводящие к особенно высоким уровням заболеваемости и смертности. Исторически пандемии явились результатом возникновения новых подтипов вируса гриппа А, которые образовались путем перегруппировки сегментированного генома (антигенная изменчивость), в то время как ежегодные эпидемии, как правило, являются результатом эволюции поверхностных антигенов вируса гриппа А и В (антигенный дрейф). Вирусы гриппа человека часто происходят от птичьих штаммов вируса гриппа, так что в основе заражения гриппом лежит зооноз. Очевидно также, что свиньи могут служить в качестве промежуточного хозяина («смешивающиеся сосуды») при образовании новых происходящих от птиц штаммов, которые являются патогенными для человека (Scholtissek и др. Virology, 147, 1985, с.287). Вспышка заболевания в Гонконге в 1997 г., вызванного штаммом H5N1 вируса гриппа А, показала, что обладающие высокой патогенностью вирусы гриппа А могут передаваться также непосредственно от различных видов птиц человеку (Claas и др., Lancet, 351, 1998, с.472; Suarez и др., J.Virol., 72, 1998, с.6678; Subbarao и др. Science, 279, 1998, с.393; Shortridge, Vaccine, 17 (прил. 1), 1999, сс. 26-29). В 2003 г. штаммы вирусов H5N1 в Юго-Восточной Азии представляли собой различные сосуществующие генотипы, но в 2004 г. доминантным стал один генотип, известный как «Z-генотип» (Li и др. Nature, 430, 2004, с.209). Современные данные свидетельствуют о том, что случаи смерти людей были обусловлены непосредственной передачей этого генотипа от птиц человеку и что этот генотип заражает также кошек путем непосредственной передачи от кошки к кошке (Kuiken и др., Science 2004, 306:241). Это и другие доказательства изменения диапазона хозяев и широкое распространение этого вируса привело к пониманию того, что H5N1-вирусы могут приобретать свойства, позволяющие осуществлять перенос от человека к человеку. Люди не могут приобретать иммунитет к таким H5N1-вирусам, что может вызвать катастрофическую пандемию гриппа (Fouchier и др., Nature, 435, 2005, с.419). Способность вирусов гриппа А образовывать новые патогенные штаммы из огромного количества штаммов, циркулирующих в животных-носителях возбудителей вирусной инфекции, означает, что борьба с этим заболеванием требует осуществления мониторинга этих вирусов и разработки улучшенных противовирусных терапий и вакцин. Скорость, с которой развиваются новые штаммы вируса, требует особого внимания при осуществлении такого мониторинга, включая применение усовершенствованных методов оценки эффективности вакцин против новых штаммов.

Вирусы гриппа А, В и С семейства Orthomyxoviridae, все имеют сегментированный геном с негативной цепочкой РНК, который реплицируется в ядре инфицированной клетки, имеет суммарную кодирующую емкость, составляющую примерно 13 т.п.н., и содержит генетическую информацию для десяти вирусных белков. Конкретно вирусы гриппа имеют восемь генных сегментов антисмысловой РНК (nsPHK), которые кодируют по меньшей мере 10 полипептидов, включая белки РНК-полимеразы (РВ2, РВ1 и РА), мишенью которых является РНК, нуклеопротеин (NP), нейраминидазу (NA), гемагглутинин (НА, который после ферментативного расщепления образует ассоциацию субъединиц НА1 и НА2), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурные белки (NS1 и NS2) (Krug и др., в: The Influenza Viruses, под ред. R.M. Krug, изд-во Plenum Press, New York, 1989, сс. 89-152).

Разработанные в последнее время обратные генетические системы должны дать возможность осуществлять манипуляции с геномом вируса гриппа (Palese и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1996, с.11354; Neumann и Kawaoka, Adv. Influenza Res., 53, 1999, с.265; Neumann и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1999, с.9345; Fodor и др., J. Virol., 73, 1999, с.9679). Было продемонстрировано, например, что экспрессия восьми nsPHK, осуществляемая плазмидой под контролем промотора pol I, и коэкспрессия белков полимеразного комплекса приводит к образованию инфекционного вируса гриппа A (Hoffmann и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2000, с.6108).

Вирусная частица вируса гриппа имеет размер примерно 125 нм и состоит из ядра, включающего антисмысловую вирусную РНК, ассоциированную с ядерным белком, которое окружено вирусной оболочкой, имеющей двухслойную липидную структуру. Внутренний слой вирусной оболочки состоит преимущественно из матриксных белков, а наружный слой состоит в основном из липидного материала, происходящего из хозяина. Так называемые «поверхностные белки», нейраминидаза (NA) и гемагглютинин (НА) выступают в виде пиков на поверхности тела вируса. Инфективность новых вирусов гриппа зависит от расщепления НА специфическими протеазами хозяина, в то время как NA участвует в отделении вирионов-потомков от клеточной поверхности и предупреждает агглютинацию нового образовавшегося вируса.

Белки НА и NA, погруженные в вирусную оболочку, представляют собой основные антигенные детерминанты вируса гриппа (Air и др., Structure, Function, and Genetics, 6, 1989, сс.341-356; Wharton и др. в: The Influenza Viruses, под ред. R.M.Krug, изд-во Plenum Press, New York, 1989, сс.153-174). Благодаря перегруппировке сегментированного генома вируса гриппа постоянно образуются новые варианты НА и NA, в отношении которых у только что зараженного организма не вырабатывается анамнестическая реакция (вторичный иммунный ответ). Гликопротеин НА представляет собой основной антиген для нейтрализующих антител и он участвует в связывании вирусных частиц с рецепторами на клетках-хозяевах.

Последовательности молекул НА из различных штаммов вируса обладают значительным сходством, как на уровне нуклеиновых кислот, так и на уровне аминокислот. Степень сходства варьируется, когда сравнивают штаммы разных подтипов, при этом для некоторых штаммов характерны более высокие степени сходства, чем для других (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, с.7643). Степени сходства аминокислот варьируются между вирусными штаммами одного подтипа и вирусными штаммами других подтипов (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, с.7643). Эта вариация достаточна для установления отдельных подтипов и направления эволюционной дифференцировки различных штаммов, однако можно довольно легко осуществлять сравнительный анализ первичной структуры ДНК и аминокислотных последовательностей различных штаммов с помощью обычных биоинформационных методов (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, сс.7643; Suzuki и Nei, Mol. Biol. Evol., 19, 2002, с.501).

Противогриппозные вакцины

Противогриппозные вакцины, разрешенные в настоящее время органами здравоохранения для применения в Соединенных Штатах и Европе, представляют собой инактивированные противогриппозные вакцины, а также живую ослабленную вакцину FLUMIST, применяемую в Соединенных Штатах. Вирусы, являющиеся представителями важных в эпидемиологическом отношении штаммов вируса гриппа А и вируса гриппа В, выращивают в оплодотворенных куриных яйцеклетках, и затем вирусные частицы очищают и инактивируют с помощью химических средств для получения биомассы вакцины. Каждый год ВОЗ отбирает подтипы, которые по прогнозу должны встречаться с наибольшей вероятностью, для создания вакцин.

Хотя противогриппозные вакцины применяют для вакцинации человека с начала 1940-х годов и для вакцинации свиней с конца 1960-х годов, существование многочисленных животных-носителей возбудителей вирусной инфекции в сочетании с угрозой возникновения нового вируса гриппа, способного вызвать пандемию, заставляет проводить исследования с целью разработки новых терапевтических методов борьбы с вирусом. За последние несколько лет в области борьбы с гриппом был достигнут ряд важных успехов (см. обзор Сох и Subbarao, Lancet, 354, 1999, сс.1277-1282). Например, было экспериментально установлено, что интраназальное введение живой ослабленной трехвалентной противогриппозной вакцины может обладать высокой эффективностью в отношении защиты детей младшего возраста от штамма вируса гриппа A H3N2 и вируса гриппа В. Другие подходы к повышению эффективности существующих (убитых) вакцин на основе вируса гриппа включают создание адаптированных для защиты от простуды и сконструированных генетическим путем вирусов гриппа, которые содержат ослабляющие мутации (см. обзор у Palese и др., J. Infect. Dis., 176 прил. 1, 1997. сс.45-49). Существует надежда, что такие измененные генетическим путем вирусы, в которые путем перегруппировки были интродуцированы гены НА и NA из циркулирующих штаммов, можно применять в качестве безопасных живых вакцин на основе вируса гриппа для индукции пролонгированного защитного иммунного ответа у человека. Хотя, по-видимому, адаптированные для защиты от простуды вакцины являются эффективными для детей и подростков, их можно ослаблять в достаточной степени для стимулирования идеального иммунного ответа у пожилых людей, которые представляют собой основную группу из числа 20000-40000 индивидуумов, умирающих каждый год в США в результате заражения гриппом.

Легко доступные вакцины должны стать наиболее эффективным инструментом для борьбы с неожиданно возникающей пандемией гриппа. После вспышки H5N1 в Гонконге в 1997 г. на людях были испытаны вакцины, получаемые с помощью двух различных подходов. Обычная вакцина на основе субъединицы (подтипа) Н5, полученной из A/duck/Singapore/3/97, обладала слабой иммуногенностью для человека даже против близкородственных по антигенным свойствам штаммов и даже после нескольких вакцинаций (Nicholson и др., Lancet, 357, 2001, с.1937; Stephenson и др., Journal of Infectious Disease, 191, 2005, с.1210). Применение адъюванта MF59 повышало титр антител к указанной вакцине на основе Н5 (Stephenson и др., Vaccine, 21, 2003, с.1687). Вакцинация с использованием инактивированной «расщепленной» вакцины, полученной на основе непатогенного вируса A/duck/HK/836/80 (H3N1) и модифицированного гемагглютинина Н5 из вируса А/НК/156/97 (H5N1), индуцировала слабо обнаруживаемые титры нейтрализующих антител (Takada и др. Journal of Virology, 73, 1999, с.8303). Таким образом, хотя указанные вакцины на основе H5N1 хорошо переносились, оказалось, что они обладали слабой иммуногенностью. Существующий в настоящее время недостаток эффективных вакцин против штаммов вируса H5N1 повышает угрозу того, что эти вирусы могут вызвать пандемическое заболевание.

Иммуногенность противогриппозной вакцины

Методы определения титров антител в сыворотке являются суррогатными методами оценки иммунной защиты после вакцинации или вирусной инфекции. В качестве методов определения титров антител в сыворотке преимущественно применяют анализы титров вирус-нейтрализующих антител и анализы титров с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI). Эти анализы основаны на способности антител к вирусу гриппа из человеческой сыворотки вступать в перекрестную реакцию с антигенами в условиях in vitro. Методы анализа для конкретной ситуации выбирают не только на основе их способности давать непротиворечивые и применимые результаты, но также и на основе простоты их применения и требований к оборудованию, необходимому для осуществления каждого типа анализа.

В целом анализ на основе нейтрализации вирусов заключается в том, что оценивают способность антител из образца сыворотки блокировать заражение культивируемых клеток вирусом гриппа. Это анализ осуществляют путем приготовления серийных разведений (титров) образца сыворотки и объединения каждого из этих разведений со стандартным количеством инфекционного вируса. Затем каждую смесь, полученную с использованием этих разведений, вносят в определенную культуру клеток и анализируют полученные коэффициенты заражения. Считается, что анализ титров вируснейтрализующих антител является чрезвычайно ценным и надежным тестом для оценки уровня иммунозащитных антител, присутствующих в организме конкретного индивидуума. Однако он зависит от характеристик специализированной культуры клеток и поэтому не является полностью универсальным. Кроме того, методология является очень трудоемкой и требует большого количества времени, вследствие чего она плохо приспособлена для скрининга большого количества образцов.

При анализе с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI) также оценивают способность антител из образца сыворотки связываться со стандартизованным эталонным вирусом. Этот анализ основан на том факте, что вирусы гриппа должны связываться с эритроцитами и вызывать их агглютинацию. В HI-анализе серийные разведения образца сыворотки смешивают со стандартными количествами эталонного вируса и после ряда инкубации добавляют к эритроцитам. После этого визуально выявляют приводящую к образованию комплексов ассоциацию между эталонными вирусами и эритроцитами. Наибольшее разведение сыворотки, которое ингибирует гемагглютинацию, принимают за титр ингибирования гемагглютинации. Хотя HI-анализ не обладает такой же чувствительностью в отношении иммуногенности вакцины, как другие анализы, он находит широкое применение благодаря относительно простой технологии и невысоким требованиям к лабораторному оборудованию.

Принимая во внимание указанные выше ограничения существующих в настоящее время методов, пригодных для разработки и оценки противогриппозных вакцин, существует необходимость в усовершенствовании методов оценки иммуногенности для определения иммунного ответа после заражения, а также эффективности вакцины.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предложены аминокислотные замены в молекуле гемагглютинина (НА) вируса гриппа А, которые могут изменять антигенность и иммуногенность НА. Эти замены могут приводить к изменению областей детерминанты путем изменения специфичности рецептора и/или связывания антитело-антиген. В различных вариантах осуществления изобретения повышенную антигенность, обусловленную заменой, можно использовать для повышения чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI) в образцах сыворотки, взятых у зараженных животных. Такая информация важна для создания предназначенных для диагностики эталонных вирусов и новых противогриппозных вакцин. Предпочтительно аминокислотная замена приводит к образованию молекул, которые обладают иммуногенными характеристиками, свойственными аминокислотной замене на аспарагин в положении 223 в НА Н5-подтипа.

Таким образом, определенные объекты настоящего изобретения относятся к молекуле гемагглютинина (НА) вируса гриппа, имеющей одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что усиливает антигенность молекулы НА в отношении антител, обладающих специфичностью к молекуле НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в ее рецепторном сайте связывания. Молекула НА с повышенной антигенностью вируса гриппа может содержать аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, при этом включение аспарагина приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, которое инфицировано вирусом гриппа, несущим молекулу НА дикого типа. Повышенная антигенность молекулы НА вируса гриппа может быть обусловлена присутствием аминокислоты аспарагина в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где молекула НА не выведена из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03, и включение аспарагина в положение 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная замена приводит к изменению сайта гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения вирус гриппа представляет собой вирус гриппа А человека. Вирус гриппа А человека может являться, например, представителем подтипа Н5. Вирус гриппа А человека может представлять собой вирус гриппа A/Vietnam/1203/04 (H5N1). В некоторых вариантах осуществления изобретения вирус гриппа представляет собой вирус гриппа В. Под объем изобретения подпадают молекулы НА вируса гриппа с повышенной антигенностью, полученные из вируса гриппа птиц.

Другие объекты изобретения относятся к рекомбинантному вирусу гриппа, имеющему молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая содержит одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания. Рекомбинантный вирус гриппа может включать модифицированную молекулу НА, полученную из вируса гриппа H5N1, в генетическом окружении вируса гриппа А. Вирус гриппа А может представлять собой исходный вакцинный штамм гриппа. Рекомбинантный вирус гриппа можно использовать в качестве диагностического эталонного вируса в анализе с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI). Рекомбинантный вирус гриппа можно включать в набор для анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI).

Другие объекты изобретения относятся к обратным генетическим системам, предназначенным для получения вируса, содержащего молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания.

Следующие объекты представленного в настоящем описании изобретения относятся к способам создания вируса, содержащего молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецептором сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что интродуцируют рекомбинантный вектор, который экспрессирует молекулу НА с повышенной антигенностью, в обратную генетическую систему.

Кроме того, родственными объектами изобретения являются способы определения эффективности вакцины на основе вируса гриппа для животных. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма вакцинированного животного, подвергают взаимодействию с молекулой гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в рецепторном сайте связывания, присутствующей в вакцине на основе вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулу НА с повышенной антигенностью получают из изолята А/НК/213/03 человеческого H5N1, и включение аспарагина в положение, которое соответствует положению 223 в НА из вируса H5N1, приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма вакцинированного животного. В некоторых вариантах осуществления изобретения животное представляет собой человека. В других вариантах осуществления изобретения животное представляет собой хорька.

Другими родственными объектами настоящего изобретения являются способы создания вируса гриппа, который содержит молекулу гемагглютинина (НА), заключающиеся в том, что культивируют с помощью обратного генетического процесса обратную генетическую систему, в которой кодирующая НА ДНК кодирует одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в рецептором сайте связывания.

Кроме того, изобретение относится к способам повышения чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI), которые заключаются в том, что антисыворотку, полученную из организма вакцинированного или инфицированного животного, подвергают взаимодействию с молекулой гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в рецепторном сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ повышения чувствительности HI-анализа приводит по меньшей мере к 2-кратному повышению чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI), В некоторых вариантах осуществления изобретения способ повышения чувствительности HI-анализа приводит по меньшей мере к 4-кратному повышению чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI).

Другим объектом изобретения являются способы определения того, инфицировано ли животное вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма животного, подвергают взаимодействию с предназначенным для диагностики эталонным вирусом, который выведен из рассматриваемого вируса гриппа, но содержит молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания, приводящую к повышению реактивности в отношении антисыворотки. В некоторых вариантах осуществления изобретения животное представляет собой человека. В других вариантах осуществления изобретения животное представляет собой хорька.

Следующими объектами изобретения являются другие способы определения того, инфицировано ли животное вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма животного, подвергают взаимодействию с диагностическим эталонным вирусом, который выведен из рассматриваемого вируса гриппа, но содержит модифицированную молекулу НА вируса гриппа, которая имеет аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, при этом включение аспарагина приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа с молекулой НА дикого типа, что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ определения того, инфицировано ли животное вирусом гриппа, заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма животного, подвергают взаимодействию с диагностическим эталонным вирусом, который выведен из рассматриваемого вируса гриппа, но содержит модифицированную молекулу НА вируса гриппа, которая имеет аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где молекула НА не происходит из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03 и включение аспарагина в положение 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения животное представляет собой человека. В других вариантах осуществления изобретения животное представляет собой хорька.

Под объем изобретения подпадают также предназначенные для получения вакцины вирусы гриппа, содержащие молекулу гемагглютинина (НА), имеющую аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания, и где модификация приводит к повышению иммуногенности вакцинного вируса.

Одним из объектов настоящего изобретения являются выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, содержащую аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в ее рецепторном сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула НА вируса гриппа, кодируемая выделенной нуклеиновой кислотой, содержит аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где молекула НА не выведена из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03 и включение аспарагина в положение 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, зараженного вирусом гриппа.

Кроме того, изобретение относится к способам получения нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая содержит аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в ее рецепторном сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что интродуцируют нуклеотидную последовательность в нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в рецепторном сайте связывания, что приводит к аминокислотной замене в последовательности молекулу НА, придающей молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена.

Под объем настоящего изобретения подпадают эти и другие объекты изобретения, как это более подробно указано в разделах «Подробное описание изобретения» и «Примеры».

Описание чертежей

На чертежах показано:

На фиг.1 - график, иллюстрирующий HI-титры антител у хорьков, которым инокулировали вирусы гриппа H5N1, выделенные в 2003 г. и 2004 г. (A); HI-титры и титры вируснейтрализующих антител у хорьков, иммунизированных вирусами ΔН5М1/03 и ΔН5М1/04 (Б). Представленные на фиг.1А данные получены с использованием образцов сыворотки, взятых в день 28 после инокуляции 10⁶ EID₅₀ (средняя инфицирующая доза для куриного эмбриона) вирусов H5N1, которые титровали против 4 гемагглютинирующих единиц (HAU) гомологичного вируса. Данные представляют собой репрезентативные значения, полученные для 2 или 4 образцов сыворотки. Представленные на фиг.1Б данные получены с использованием образцов сыворотки, взятых из организма хорьков, вакцинированных дважды с использованием каждый раз по 7 мкг НА вирусов ΔH5N1/03 и ΔH5N1/04, которые титровали против 4 HAU и 100 TCID₅₀ (средняя цитопатогенная доза) гомологичного вируса соответственно.

На фиг.2 - график, иллюстрирующий вирусные титры в назальных смывах, полученных у вакцинированных и контрольных хорьков после контрольного заражения вирусом A/Vietnam/I 203/04 (H5N1). Хорькам, вакцинированным рекомбинантными вирусами ΔH5N1/04 или ΔН5/04, интраназально инокулировали 10⁶ EID₅₀ вируса A/Vietnam/1203/04. Титры представляют собой средние значения (log₁₀ EID₅₀/0,1 мл) ± С.К.О., определенные для назальных смывов у 3 хорьков.

Следует отметить, что различия в величинах титров для вакцинированной и контрольной групп являются статистически достоверными и характеризуются значениями р, составляющими 0,0028 - 0,0173 согласно неспаренному t-критерию.

На фиг.3 - модель молекулы полипептида НА Н5, на которой показано положение аминокислоты (положения 154 и 223) в трехмерной (3D-) структуре НА вируса A/duck/Singapore/3/97 (H5N3). На фиг.3А указаны рецепторный сайт связывания аминокислот в 3D-структуре. На фиг.3Б кружок обозначает поверхность раздела между представленным мономером и двумя другими мономерами (не показаны) в трехмерной молекуле НА. Аминокислота в положении 223 находится в 220-петле рецепторного связывающего домена между остатком глутамина, который, как правило, присутствует в положении 222, и остатком глицина, который, как правило, присутствует в положении 224.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предложены изменения в аминокислотной последовательности молекулы гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которые придают молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекул НА, в которых отсутствуют изменения. Такие изменения последовательности включают замены и делеции. Образовавшийся НА обозначают как «НА с повышенной антигенностью».

Молекулу НА с повышенной антигенностью можно применять для тестирования эффективности вакцины, поскольку изменение повышает чувствительность методов диагностики антител к вирусу гриппа в сыворотке. В конкретном варианте осуществления изобретения вирус представляет собой вирус гриппа А. В другом варианте осуществления изобретения вирус может представлять собой также вирус гриппа В, а еще в одном вариант осуществления изобретения он может представлять собой вирус гриппа С. В варианте осуществления изобретения, в котором вирус представляет собой вирус гриппа А, он может являться Н5-подтипом вируса гриппа А. В более конкретном варианте осуществления изобретения молекулу НА Н5-подтипа модифицируют с целью включения аминокислоты аспарагина в положение 223 (N₂₂₃), что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной от животного, инфицированного Н5-подтипом вируса гриппа. В конкретном варианте осуществления изобретения молекула НА, предлагаемая в изобретении, не представляет собой молекулу НА А/НК/213/03, которая относится к встречающемуся в естественных условиях Н5-подтипу, содержащему аспарагин в положении 223. Вирус гриппа может представлять собой вирус гриппа А человека Н5-подтипа, включая вирус A/Vietnam/1203/04 (H5N1).

Аминокислотные изменения, которые придают молекуле НА большую антигенность, можно осуществлять в рецепторном связывающем домене НА, например, как показано на фиг.3А, прежде всего в области 220-петли рецепторного связывающего домена. Такое изменение может уменьшать связывание НА с рецепторами сиаловой кислоты на эритроцитах, повышая тем самым способность антител к НА ингибировать гемагглютинацию, что приводит к усилению способности связываться с антителом в анализе с использованием реакции торможения гемагглютинации. В альтернативном варианте аминокислотное изменение, которое придает молекуле НА большую антигенность, можно осуществлять для того, чтобы изменить или удалить путем делеции сайт гликозилирования на белке НА, прежде всего сайт гликозилирования, который маскирует эпитопы на НА, распознаваемые специфическими в отношении НА антителами. Еще в одном варианте осуществления изобретения аминокислотное изменение можно осуществлять на аминокислотном остатке, соответствующем остатку 223 НА Н5-подтипа. Во всех вариантах осуществления изобретения аминокислотные модификации, которые придают молекуле НА большую антигенность, можно легко идентифицировать с помощью иммуноанализов с использованием антител, специфических в отношении конкретного подтипа НА. Модификация, которая придает молекуле НА большую антигенность, должна приводить к заметно более высокой связывающей активности в отношении титруемого антитела по сравнению со связывающей активностью в отношении молекулы НА, к которой вырабатываются антитела. К таким анализам относятся анализы с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI).

В конкретном варианте осуществления изобретения замена в молекуле НА Н5-подтипа остатка серина (который может представлять собой гликозилированный остаток) на аспарагин (который может быть либо негликозилированным, либо иметь другую схему гликозилирования) приводит к повышению антигенности. Однако другие замены также могут приводить к заметному повышению антигенности. Такие замены могут представлять собой консервативные замены, такие как замена треонина на серин или глутамина на аспарагин, но не обязательно консервативные замены. Они могут сохранять относительную полярность, например, замена аспарагина на серин или лизина на аспарагиновую кислоту, что сохраняет полярность, существовавшую до указанных изменений. Можно рассматривать также замену на такие остатки, как глицин и аланин, что приводит к устранению реактивной боковой цепи, не оказывая существенного влияния на структуру полипептида. И, наконец, можно осуществлять полностью неконсервативные изменения. И в этом случае с помощью простых иммуноанализов можно устанавливать, приводит ли конкретное изменение к повышению антигенности.

Некоторые H5N1-вирусы гриппа птиц, выделенные в Центральной и Южной Америке, несут основную аминокислоту аргинин в положении 223. Нейтральная аминокислота аспарагин обнаружена в положении 223 НА человеческого изолята А/НК/213/03. Этот аминокислотный остаток расположен в 220-петле рецепторного связывающего домена между остатком глутамина, как правило, присутствующим в положении 222, и остатком глицина, как правило, присутствующим в положении 224 (фиг.3). Экспериментальные данные позволяют предположить, что более высокие HI-титры отражают изменение специфичности рецептора. Фактически глутамин, как правило, присутствующий в положении 222, и глицин, как правило, присутствующий в положении 224, связываются непосредственно с рецептором сиаловой кислоты. Аминокислоты, присутствующие в 220-петле или смежные с ней, играют важную роль в конформации рецепторного связывающего кармана (На и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 2001, с.11181). Хотя в настоящем изобретении не утверждается какое-либо конкретное объяснение наблюдаемого эффекта, может оказаться возможным, что замена аспарагина на серин в положении 223 Н5 приводит к конформационным изменениям и изменяет специфичность рецептора.

Согласно следующему объекту изобретения молекулы НА, модифицированные в соответствии с изобретением с целью достижения большей антигенности, обладают также большей иммуногенностью. Такие молекулы в качестве компонента противогриппозной вакцины могут вызывать более сильный или эффективный иммунный ответ, что, в свою очередь, приводит к более эффективной защите от заражения гриппом.

Вирусы гриппа, источником которых являются птицы-носители возбудителей инфекции, имеют особое значения для общественного здравоохранения. Считается, что эти вирусы с наибольшей вероятностью способны вызывать вспышки пандемии гриппа в человеческой популяции. Поэтому молекула НА из птичьего подтипа с повышенной антигенностью и/или иммуногенностью может оказаться наиболее пригодной для применения в иммуноанализах, проводимых при разработке вакцины. Стратегию, проиллюстрированную в настоящем описании на примере Н5, можно применять для повышения титров в HI-анализе (ингибирование гемагглютинации) против других подтипов НА, что особенно важно для оценки иммунитета в отношении гриппа птиц. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулу НА, имеющую аминокислотные замены в рецепторном сайте связывания, можно получать из вируса гриппа птиц, включая подтипы от H1 до H16 включительно.

Одним из объектов настоящего изобретения является применение рекомбинантного вируса гриппа, содержащего молекулу НА с повышенной антигенностью, в качестве эталонного вируса в иммуноанализе, прежде всего HI-анализе, а также набор для осуществления такого анализа. Например, замен