Lawsonia intracellularis европейского происхождения и вакцины, диагностические агенты на ее основе и способы их применения

Lawsonia intracellularis европейского происхождения и вакцины, диагностические агенты на ее основе и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на родственную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США серийный номер 60/490001, поданной 25 июля 2003 г., содержание которой включено в настоящее описание во всей полноте в качестве ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Настоящее изобретение относится к вакцинам на основе Lawsonia intracellularis (вакцинам Lawsonia intracellularis) и к способам защиты от инфекции, вызываемой L.Intracellularis, и диагностики указанной инфекции. Продукты и способы, предлагаемые в изобретении, можно реализовывать на практике, в частности, в результате разработки усовершенствованного способа крупномасштабного культивирования L.intracellularis, включая новый изолят L.intracellularis европейского происхождения, и способа получения лиофилизированного продукта, представляющего собой вакцину, который содержит ослабленный европейский изолят.

L.intracellularis, возбудитель пролиферативной энтеропатии свиней ("ПЭС"), поражает практически всех животных, включая кроликов, хорьков, хомяков, лис, лошадей и различных представителей других классов животных, таких как страусы и эму. L.intracellularis является наиболее распространенной причиной потерь поголовья свиней в Европе, а также в Соединенных Штатах.

Характерной особенностью ПЭС является присутствие интрацитоплазматических несвязанных с мембраной изогнутых бацилл внутри энтероцитов в инфицированных областях кишечника. Бактерии, связанные с ПЭС, были названы "Campylobacter-подобными организмами" (S.McOrist и др., Vet. Pathol., том 26, 1989, сс.260-264). Затем бактерии-возбудители были охарактеризованы в качестве нового таксономического рода и видов под общеупотребительным названием Ileal symbiont (IS) intracellularis (C.Gebhart и др., Int'l.J. of Systemic Bacteriology, том. 43(3), 1993, сс.533-538). В последние годы этим новым бактериям было дано таксономическое название Lawsonia (L.) intracellularis (S.McOrist и др., Int'l.J. of Systemic Bacteriology, том 45 (4), 1995, сс.820-825). Эти три названия использовали взаимозаменяемо для обозначения одного и того же организма, как он идентифицирован и описан далее в настоящем описании.

L.intracellularis является облигатной внутриклеточной бактерией, которую нельзя культивировать с помощью обычных бактериологических методов на стандартных бесклеточных средах, и предполагается, что для своего роста они должны присоединиться к эпителиальным клеткам. У S.McOrist и др., Infection and Immunity, том 61 (19), 1993, сс.4286-4292 и G.Lawson и др., J. of Clinical Microbiology, том 31 (5), 1993, сс.1136-1142 описано культивирование L.intracellularis с использованием монослоев крысиных эпителиальных клеток кишечника линии IEC-18 в стандартных колбах для культуры ткани. Кроме того, у Н.Stills, Infection and Immunity, том 59 (9), 1991, сс.3227-3236 описано применение монослоев человеческих эмбриональных клеток кишечника линии Intestine 407 и монослоев клеток аденокарциномы ободочной кишки линии GPC-16 морской свинки для культивирования в стандартных колбах для культуры ткани.

В последние годы в Соединенных Штатах было разрешено применение вакцины L.intracellularis, где вакцина основана на изолятах L.intracellularis, описанных и заявленных в US 5714375 и 5885823, оба патента включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте. Указанная выше вакцина поступает в продажу от фирмы Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., 2621 North Belt Highway, Сент-Джозеф, шт.Миссури, 64506-2002, под товарным знаком ENTERISOL^® Ileitis.

Краткое изложение сущности изобретения

Одной из целей изобретения является создание усовершенствованной вакцины L.intracellularis с использованием изолята европейского происхождения.

Другой целью изобретения является разработка усовершенствованного способа крупномасштабного культивирования L.intracellularis и усовершенствованного способа производства вакцины L.intracellularis.

Для достижения этих и других целей и в соответствии с задачей изобретения, как оно представлено и подробно описано в настоящем описании, в настоящем изобретении предложен новый выделенный изолят L.intracellularis европейского происхождения, способ ослабления такого изолята и его ослабленный изолят. В настоящем изобретении предложена также вакцина, содержащая ослабленный изолят. В настоящем описании предложен также способ получения вакцины, содержащей ослабленный изолят в лиофилизированной форме, предназначенной для восстановления при введении, и лиофилизированный продукт, представляющий собой указанную вакцину.

В одном из вариантов осуществления изобретения новый выделенный изолят DK 15540 L.intracellularis европейского происхождения представляет собой изолят, депонированный в АТСС (Американская коллекция типовых культур) под регистрационным номером РТА-4927. В другом варианте осуществления изобретения ослабленный изолят, выведенный из изолята DK 15540, представляет собой изолят, обозначенный как В3903, регистрационный номер АТСС РТА-4926.

Подробное описание изобретения

В контексте настоящего описания понятие "L.intracellularis" обозначает внутриклеточные искривленные грамотрицательные бактерии, подробно описанные у С.Gebhart и др., Int'l.J. of Systemic Bacteriology, том. 43 (3), 1993, сс.533-538 и S.McOrist и др., Int'l.J. of Systemic Bacteriology, том 45 (4), 1995, сс.820-825, каждая публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте, и включает (но, не ограничиваясь ими) изолят, обозначенный DK 15540, который был депонирован в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт.Виргиния, 20110-2209, 9 января 2003 г. под регистрационным номером АТСС РТА-4927; бактерии-возбудители, которые можно получать из зараженной ПЭС свиньи или других животных, обитающих во всем мире, на основе знаний в данной области и указаний, приведенных в настоящем описании; и варианты или мутанты любой из указанных выше бактерий, полученные спонтанно или искусственным путем.

В контексте настоящего описания понятие "ослабленный изолят" обозначает любой изолят L.intracellularis, полученный с помощью методов культивирования и пересева, приведенных в настоящем описании, для достижения авирулентности при сохранении иммуногенных свойств при введении животному-хозяину, включая (но, не ограничиваясь им) ослабленный изолят, обозначенный В-3903, который был депонирован в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт.Виргиния, 20110-2209, 9 января 2003 г. под регистрационным номером АТСС РТА-4926.

Ослабленный изолят, предлагаемый в изобретении, можно применять в качестве иммуногена в антимикробных вакцинах для животных, включая птиц, рыб и млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, свиньи, лошади и приматы. Такие вакцины можно получать методами, известными специалистам в данной области, с использованием указаний, приведенных в настоящем описании. Такая вакцина должна содержать иммунологически эффективное количество ослабленного изолята в фармацевтически приемлемом носителе. Вакцину можно вводить в виде одной или нескольких доз. Иммунологически эффективное количество определяют методами, известными в данной области, без проведения дополнительных экспериментов, руководствуясь указаниями, приведенными в данном описании. Количество авирулентных бактерий должно быть достаточным для стимуляции иммунного ответа у чувствительных к заболеванию животных, оставаясь при этом авирулентным. Это зависит от конкретного животного, бактерий и рассматриваемого заболевания. Рекомендованная доза, предназначенная для введения чувствительному животному, предпочтительно составляет от примерно 3,0 TCID₅₀ (конечное значение инфицирующей дозы, способной вызывать заражение 50% тканевой культуры)/дозу до примерно 6,0 TCID₅₀/дозу и более предпочтительно от примерно 4,0 TCID₅₀/дозу до примерно 5,0 TCID₅₀/дозу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения титр вакцины составляет примерно 4,9 TCID₅₀/дозу согласно методу разведении для определения значения инфицирующей дозы, способной вызывать заражение 50% тканевой культуры (TCID₅₀). Носители известны специалистам в данной области, и они включают стабилизаторы и разбавители. Такая вакцина может содержать также соответствующий адъювант. Вакцины, предлагаемые в изобретении, можно применять также в сочетании с другими вакцинами, например, в качестве разбавителя для другой вакцины. Препараты вакцин можно сушить, например, с помощью сушки вымораживанием, для целей хранения или для последующего приготовления препаратов в виде жидких вакцин.

Таким образом, под объем изобретения подпадает способ индукции иммунного ответа на вирулентные бактерии L.intracellularis дикого типа у животного-хозяина с целью защиты хозяина от таких бактерий. Способ заключается в том, что хозяину вводят иммунологически эффективное количество ослабленных бактерий или убитых бактерий, предлагаемых в изобретении, и предпочтительно хозяину вводят вакцину, предлагаемую в изобретении.

В контексте настоящего изобретения понятие "крупномасштабное культивирование" обозначает уровень культивирования L.intracellularis, превышающий примерно 2,0-3,0 л, и включает производство в масштабе 100 л или более. "Культивирование" в контексте настоящего описания обозначает процесс стимуляции роста, репродукции и/или пролиферации L.intracellularis.

L.intracellularis можно культивировать с помощью методов, известных в данной области, предпочтительно согласно методу, описанному в патентах US 5714375 и 5885823. Например, клеточную культуру можно сначала инокулировать инокулятом, содержащим бактерии L.intracellularis так, чтобы осуществить заражение клеток бактериями. Для осуществления на практике изобретения можно использовать многие клеточные линии, включая (но, не ограничиваясь ими) IEC-18 (АТСС 1589) - эпителиальные клетки кишечника крысы, НЕр-2 (АТСС 23) - клетки плоскоклеточного рака человека, McCoys (АТСС 1696) - мышиные неспецифические клетки, BGMK (Biowhittaker №71-176) - клетки почки зеленой мартышки-буффало и эпителиальные клетки кишечника свиньи. Предпочтительными клеточными культурами являются клетки линии НЕр-2, McCoys или IEC-18.

Если используют клеточную культуру, то перед инокуляцией клетки могут находиться в форме монослоя. Для образования монослоя клетки можно высевать в стандартные колбы. В каждую колбу высевают от примерно 1×10⁵ до примерно 10×10⁵ клеток на колбу или роллер-флакон площадью 25, 75, 150, 850 см², смешанных с питательной средой. Питательные среды могут представлять собой любые среды для культивирования клеток, которые содержат источник азота, необходимые факторы роста для выбранной клеточной культуры и источник углерода, такой как глюкоза или лактоза. Предпочтительной средой является DMEM, обогащенная средой Хэма F 12, содержащей 1-5% фетальной бычьей сыворотки, хотя можно применять также другие поступающие в продажу среды, позволяющие получать хорошие результаты.

Эффективность культивирования L.intracellularis усиливают, поддерживая клеточную культуру на стационарной фазе роста. Следовательно, монослой клеточной культуры должен обладать в момент инокуляции от примерно 20 до примерно 50%-ной конфлюэнтностью. Предпочтительно клетки должны обладать в момент инокуляции от примерно 30 до примерно 40%-ной конфлюэнтностью, наиболее предпочтительно примерно 30%-ной конфлюэнтностью.

В альтернативном варианте клетки перед инокуляцией можно выращивать в суспензии, как описано ниже. Предпочтительно клетки сначала выращивают до 100%-ной конфлюэнтности в форме монослоя в системе адгезивного слоя, например в системе роллер-флаконов, и затем переносят в сосуд объемом 3-3000 л и выращивают в суспензии. В альтернативном варианте клетки можно выращивать перед инокуляцией в суспензии до достижения требуемой плотности клеток, например 2×10⁵ клеток/мл, в сосуде объемом 3-3000 л (биореактор, ферментер, вращающаяся колба и т.д.) с использованием параметров, пригодных для роста в такой системе.

Инокулят может представлять собой чистую культуру L.intracellularis, полученную из инфицированной свиньи или других животных. Предпочтительно инокулят может представлять собой чистую культуру L.ilntracellularis, полученную из культуры, находящейся в АТСС под регистрационным номером РТА-4927.

Инокулят может представлять собой кишечный гомогенат, полученный путем соскабливания слизистой оболочки подвздошной кишки свиньи или другого животного, зараженного ПЭС. Когда приготавливают кишечный гомогенат, срезы подвздошной кишки, выбранные для получения культуры, должны иметь серьезные повреждения, характеризующиеся большим утолщением кишки. Вследствие недолговечности бактерий образцы после осуществления аутопсии предпочтительно следует как можно быстрее помещать на хранение при -70°С. К инокуляту добавляют антибиотик, к которому L.intracellularis обладает устойчивостью, такой как ванкомицин, амфотерицин В или представителей антибиотиков, несущих аминогликозидную группу, включая указанные в качестве примера гентамицин и неомицин, для подавления загрязняющих бактерий при сохранении роста L.intracellularis. Независимо от того, является ли инокулят чистой культурой или кишечным гомогенатом, инокуляцию клеточной культуры можно осуществлять различными методами, известными в данной области, с использованием указаний, приведенных в настоящем описании.

Затем бактерии и/или инокулированные клеточные культуры инкубируют при пониженной концентрации растворенного О₂. При концентрации растворенного кислорода выше 10% рост L.intracellularis происходит с меньшей скоростью по сравнению с оптимальной, причем, в конце концов, прекращается, когда концентрация кислорода выходит из указанного диапазона. Предпочтительно бактерии и/или инокулированную клеточную культуру инкубируют при концентрации растворенного кислорода в диапазоне от примерно 0 до примерно 10%. Более предпочтительно бактерии и/или клетки инкубируют при концентрации кислорода в диапазоне от примерно 0 до примерно 8%, причем наиболее предпочтительной является концентрация кислорода от примерно 0 до примерно 3,0%.

Оптимальная концентрация диоксида углерода также является важной для требуемого роста L.intracellularis. При концентрации диоксида углерода от 0 до 4% происходит неоптимальный рост, причем рост в конце концов прекращается, когда концентрация диоксида углерода находится в указанном диапазоне. Предпочтительно концентрация диоксида углерода находится в диапазоне от примерно 6 до примерно 10%, причем наиболее предпочтительной является концентрация диоксида углерода примерно 8,8%.

Кроме того, клетки предпочтительно инкубируют при концентрации водорода в диапазоне от примерно 4 до примерно 10%. Наиболее предпочтительно клетки инкубируют при концентрации О₂ от примерно 0 до примерно 8,0%, концентрации СО₂ примерно 8,8% и концентрации Н₂ примерно 4%. Азот применяют для роста рассматриваемого организма в качестве "баланса" в газовой смеси, содержащей азот (96%) и водород (4%) или азот (80%), диоксид углерода (10%) и водород (10%). Клетки предпочтительно инкубируют при концентрации азота в диапазоне от примерно 80 до 96%. Таким образом, клетки наиболее предпочтительно инкубируют при концентрации О₂ от примерно 0 до примерно 8,0%, концентрации СО₂ примерно 8,8%, концентрации Н₂ примерно 4%, концентрации N₂ примерно 96%.

Инокулированные клетки можно инкубировать в двойном газовом инкубаторе или иных газовых камерах, которые содержат необходимые концентрации водорода, кислорода и диоксида углерода и которые позволяют поддерживать клетки в суспендированном состоянии в процессе инкубации. Камера должна иметь устройства для поддержания инокулированных клеток в суспензии и газовый монитор, и источник питания для подачи и поддержания необходимых газовых концентраций. Температура инкубации должна находиться в диапазоне от 30 до примерно 45°С и более предпочтительно в диапазоне от примерно 36 до примерно 38°С. Наиболее предпочтительно температура составляет примерно 37°С. Необходимое оборудование для культивирования и ослабления хорошо известно и доступно специалистам в данной области и оно указано в настоящем описании. Одним из примеров оборудования, пригодного для осуществления настоящего изобретения, является двойной газовый инкубатор, например модель 480 (Lab-Line, Мелрозе Парк, шт.Иллинойс) в сочетании с вращающимися колбами для поддержания клеток в суспензии. Предпочтительное в настоящее время оборудование включает ферментер, биореактор, шейкер с перемешивающей пластиной или роторный шейкер, вмещающий по меньшей мере примерно 2 л сред, и способный поддерживать клеточную культуру в суспензии посредством продувки газом соответствующей концентрации или с помощью иных средств механического перемешивания, и позволяющий осуществлять непрерывный мониторинг уровней растворенного О₂ в средах. Фирма New Brunswick, Braun и другие компании изготавливают пригодные для этой цели ферментеры и биореакторы.

Максимального роста клеток и следовательно L.intracellularis достигают путем поддержания инокулированных клеток в суспендированном состоянии в процессе инкубации за счет увеличения контакта индивидуальных клеток с питательной средой и присутствия необходимой смеси водорода, кислорода и диоксида углерода. Клеточные культуры можно перемешивать и поддерживать в суспензии разнообразными методами, известными в данной области, с использованием, например, колб для культур, роллер-флаконов, мембранных культур, биоконтейнеров, биореакторных систем WAVE™, ферментеров и вращающихся колб. Клетки можно поддерживать в суспензии в процессе инкубации путем инкубации клеток во вращающейся колбе внутри двойного газового инкубатора или аналогичного устройства. Понятие "вращающаяся колба" в контексте настоящего изобретения обозначает колбу или иной контейнер, в котором для перемешивания культуры и поддержания ее в суспензии используется лопастная мешалка, пропеллерная мешалка или иные средства.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения инокулированные клетки инкубируют до достижения конфлюэнтности клеток, и затем клетки помещают во вращающуюся колбу, содержащую питательные среды, и инкубируют в двойном газовом инкубаторе при вращении колбы. Предпочтительно инокулированные клетки соскабливают или трипсинизируют и пересевают во вращающуюся колбу. Это можно осуществлять различными методами, известными в данной области, например, с использованием скребка для клеток для отделения клеток. После внесения клеток во вращающуюся колбу лопасть вращающейся колбы, как правило, вращается со скоростью от примерно 5 до примерно 500 об/мин на магнитной перемешивающей пластине для поддержания инфицированных клеток в суспензии.

Затем часть культивированных L.intracellularis пересевают на свежую культуру для увеличения производства бактерий L.intracellularis. Понятие "пересев" или его варианты в контексте настоящего описания обозначает процесс переноса части культивированных L.intracellularis на свежую клеточную культуру для осуществления заражения свежих клеток бактерией. Понятие "свежий" в контексте настоящего описания обозначает клетки, которые еще не были заражены L.intracellularis. Предпочтительно возраст таких клеток в среднем составляет не более примерно одного дня.

Пересев L.intracellularis в суспензионных культурах можно осуществлять путем изъятия части исходной культуры и внесения ее в новую колбу, содержащую свежую клеточную культуру. Если исходная культура имеет большое количество бактерий/мл, например более примерно 10⁴ бактерий/мл, ее предпочтительно добавляют в количестве от примерно 1 до 10 об.% культуры из зараженной колбы по отношению к культуре свежих клеток, находящихся в новой колбе. Это предпочтительно осуществляют, когда заражено 50-100% клеток. Если заражено менее 50% клеток, то пересев предпочтительно осуществляют путем разделения культуры в соотношении 1:2 в новой колбе и увеличения объема с помощью добавления свежей тканевой клеточной культуры и сред. В любом случае не требуется осуществлять лизис клеток и другие стадии в полной противоположности от пересева монослойных культур, применяемого в прототипах.

После достижения достаточного увеличения клеточной культуры и последующего заражения L.intracellularis, что определяют с помощью окрашивания согласно методу непрямой иммунофлуоресценции (антител) (IFA), оценки значения TCID₅₀ или с помощью любого сопоставимого метода, собирают по меньшей мере часть культивированных бактерий L.intracellularis. Сбор, как правило, осуществляют при клеточной инфицированности, составляющей примерно 60% или более; однако специалисту в данной области известно, что сбор можно осуществлять при клеточной инфицированности менее 60%. Стадию сбора можно осуществлять путем отделения бактерий от суспензии с помощью различных методов, известных обычным специалистам в данной области, с использованием указаний, приведенных в настоящем описании. Предпочтительно бактерии L.intracellularis собирают путем центрифугирования всего содержимого или части суспензии с образованием дебриса клеточной культуры, ресуспендирования образовавшихся дебрисов клеток и лизиса инфицированных клеток. Как правило, по меньшей мере часть содержимого центрифугируют при примерно 3000×g в течение примерно 20 мин для того, чтобы получить дебрис клеток и бактерий. Затем дебрис можно ресуспендировать, например в сахарозо-фосфат-глутаматном (СФГ) растворе, и пропускать примерно 20 раз через иглу 25 размера для осуществления лизиса клеток. Если требуется дополнительная очистка, то образцы можно центрифугировать при примерно 145×g в течение примерно пяти минут для удаления клеточных ядер и дебриса. Затем супернатант можно центрифугировать при примерно 3000×g в течение примерно двадцати минут и образовавшийся дебрис ресуспендировать в соответствующем растворителе, таком как СФГ, дополненном фетальной бычьей сывороткой (чтобы сделать собранные бактерии пригодными для лиофилизации, замораживания или использования в качестве инокулята), или в питательных средах (чтобы сделать собранные бактерии пригодными для пересева на свежие клетки).

Как указывалось ранее, эффективный рост L.intracellularis для крупномасштабного производства усиливается при поддержании активного роста тканевых клеток. В случае монослоев, когда культуры становятся конфлюэнтными, скорость деления клеток существенно уменьшается. Попытки выращивать L.intracellularis на монослойных тканевых культурах не имели большого успеха и в этом случае увеличение масштаба производства оказывалось невозможным. Однако использование суспензионных культур значительно облегчает поддержание активного роста клеток и позволяет осуществлять непрерывное увеличение объема культуры и повышение масштаба производства. При использовании ферментера и концентрации растворенного О₂ от примерно 0 до 3%, как это указано выше, оказывается возможным достигать концентрации вплоть до 10⁸ бактерий/мл и выше.

Когда используют клетки линии IEC-18, то наряду с питательными средами предпочтительно добавляют желатин, агарозу, коллаген, акриламид или кремниевые гранулы, такие как пористые микроносители типа Cultisphere-G (фирма HyClone Laboratories, Логан, шт.Юта). Однако для клеток линии НЕр-2 и других линий клеток не требуются микроносители при использовании способов, предлагаемых в изобретении.

При использовании культур клеток линии НЕр-2 для поддержания культуры предпочтительно 25-50% культуры удаляют с недельными интервалами и заменяют свежими средами. Для клеточных культур с микроносителями или гранулами предпочтительно удаляют 25-50% культуры и заменяют свежими средами 1-2 раза в неделю. Для повышения масштаба производства к культуре можно дополнительно добавлять 25-50% сред или сред с микроносителями.

В зависимости от скорости, с которой происходит заражение клеточной культуры, пересев на свежие клетки, как правило, осуществляют с интервалом времени от примерно 2 до примерно 7 дней. Принимая во внимание, что клеточная культура становится зараженной по меньшей мере на 70% в течение 2-7 дней, пересев предпочтительно осуществляют примерно через каждые 5-7 дней.

В настоящем изобретении предложены также вакцины и способы получения вакцин против нового изолята L.intracellularis европейского происхождения. Предпочтительно после поддержания зараженных клеток в суспензии в течение продолжительного периода времени (например в течение 6-8 месяцев) собирают по меньшей мере часть культивированных бактерий L.intracellularis и осуществляют мониторинг возможного ослабления. Такой мониторинг предпочтительно осуществляют с использованием контрольного заражения животного-хозяина или на модели контрольного заражения с использованием животного для отбора ослабленного изолята. Такие ослабленные изоляты используют в вакцинах, согласно способам, представленным в настоящем описании.

Настоящее изобретение позволяет осуществлять быстрое размножение культуры, увеличивать выход в 100-1000 раз и уменьшать стоимость производства L.intracellularis европейского происхождения. В результате большое количество продуцируемых бактерий L.intracellularis легко можно ослаблять с целью получения вакцины. Способ выращивания L.intracellularis в суспензии позволяет значительно облегчать получение, повышать скорость и количество бактерий, пригодных для этой цели. Чем больше количество клеток и происходящих делений клеток, тем выше уровень возникающих мутаций, что является благоприятным с точки зрения создания вакцины. Так выращивание в суспензии повышает экспрессию важных иммуногенов, контролируемых регулируемыми окружающей средой генами, и продуктов их экспрессии.

Образовавшиеся ослабленные изоляты можно культивировать в монослоях тканевых культур, но предпочтительно их культивируют в суспензионных культурах. В качестве других методов ослабления можно применять химическое ослабление с использованием, например, N-метилнитрозогуанидина, или другие методы, известные в данной области. Как с помощью многократных пересевов, так и с помощью химических средств получают ослабленную L.intracellularis и осуществляют селекцию для получения вакцины. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полученный ослабленный изолят представляет собой изолят с регистрационным номером АТСС РТА-4926.

Антиген, используемый для приготовления вакцины, можно собирать путем центрифугирования или микрофильтрации, как описано выше. Затем антиген стандартизуют до определенного уровня на основе оптимального иммунного ответа животного-хозяина, что определяют титрованием доз для различных видов животных-хозяев. Бактерии можно инактивировать методами, известными в данной области, например, путем использования 0,3%-ного формалина или других инактивирующих агентов для получения убитой вакцины. Затем антиген вносят в пригодный адъювант, такой как гидроксид алюминия или минеральное масло, для усиления иммунного ответа. После этого антиген применяют для вакцинации хозяина (в случае свиней опыты проводят на особях возрастом 3-4 недели) путем внутримышечного или подкожного заражения, используя при необходимости бустер-дозу.

Предпочтительно осуществляют серийные пересевы бактерий для индукции и селекции ослабленной авирулентной живой культуры. Культуру тестируют на животном-хозяине для выявления признаков ослабления. Культуру собирают согласно описанному выше методу и лиофилизируют. Свиней, например, подвергают вакцинации оральным путем с использованием 1×10⁴ - 1×10⁶ бактерий. Примерно через 28 дней после вакцинации свиней инокулируют оральным путем, используя примерно 1×10⁷ организмов, полученных после небольшого количества пересевов (менее 30 пересевов in vitro после первоначального выделения из кишечного гомогената) вирулентной культуры L.intracellularis. Инфицированных животных подвергают аутопсии через 21 день после контрольного заражения и производят обследование тонкого кишечника с целью выявления как макроскопических повреждений, так и микроскопических повреждений. Следует проводить также ПЦР, исследование методом непрямой иммунофлуоресценции (IFA) или иммуногистохимическим методом (ИГХ). Примерно 80% контрольных животных должны иметь значительные или микроскопические повреждения и давать положительную реакцию в тесте на присутствие L.intracellularis в клетках слизистой оболочки кишечника при использовании любого из методов тестирования, ПЦР, IFA или ИГХ. Вакцинированные животные должны иметь здоровые поверхности слизистой оболочки по данным гистологических исследований и давать отрицательную реакцию в тесте с использованием ПЦР через 3-4 недели после инокуляции.

Как правило, ослабленный иммуногенный изолят L.intracellularis получают после непрерывного культивирования в течение периода времени от примерно 150 до примерно 250 дней, в течение этого периода времени культуру пересевают примерно 50-100 раз. Однако специалисту в данной области известно, что путем варьирования этих параметров можно получать другие ослабленные культуры.

Продукт в виде вакцины, предлагаемой в изобретении, можно лиофилизировать. После сбора изолят можно концентрировать различными методами, известными в данной области, и можно смешивать со стабилизатором, например с сахарозо-желатиновым стабилизатором. Затем продукт в виде вакцины можно подвергать замораживанию и сушке (лиофилизация). Как правило, стадия замораживания заключается в ступенчатом понижении температуры до примерно -45°С±3°С и выдерживании при этой температуре в течение периода времени от примерно 150 до примерно 480 мин. Стадия сушки может включать основную и вторичную стадии сушки. Например, основная стадия сушки может заключаться в том, что: (а) ступенчато понижают температуру до уровня, составляющего от примерно -30 до примерно -5°С, и выдерживают при этой температуре в течение периода времени от примерно 120 до примерно 1000 мин, и необязательно (б) ступенчато понижают температуру до уровня, составляющего от примерно -5 до примерно 5°С, и выдерживают при этой температуре в течение периода времени от примерно 150 до примерно 2000 мин. Вторая стадия, как правило, заключается в том, что ступенчато изменяют температуру до примерно 27°С±5°С и выдерживают при этой температуре в течение периода времени, составляющего от примерно 330 до примерно 1120 мин. Специалисту в данной области известно, что указанные диапазоны можно регулировать в зависимости от условий, например от исходного объема.

После этого получают вакцину, содержащую иммунологически эффективное количество ослабленной L.intracellularis в фармацевтически приемлемом носителе. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцина содержит изолят с регистрационным номером АТСС РТА-4926 в фармацевтически приемлемом носителе. Объединенные иммуноген и носитель могут находиться в виде водного раствора, эмульсии или суспензии. Иммунологически эффективное количество определяют методами, известными в данной области, без дополнительных экспериментов, руководствуясь указаниями, приведенными в настоящем описании. Как правило, при использовании очищенных бактерий количество иммуногена составляет от 5 до 5000 мкг и от 10^2,0 до 10^9,0 TCID₅₀, предпочтительно от 10^3,0 до 10^6,0 TCID₅₀, более предпочтительно от 10^4,0 до 10^5,0 TCID₅₀.

Под объем настоящего изобретения подпадают также комбинированные вакцины, содержащие ослабленный изолят L.intracellularis с регистрационным номером АТСС РТА-4926 и антигенный материал по меньшей мере из одного другого патогена, включая (но, не ограничиваясь ими): Salmonella spp. (например Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium), Erysipelothrix spp. (например Erysipelothrix rhusiopathiae), Haemophilus spp. (например, Haemophilus parasuis), Mycoplasma spp. (например, Mycoplasma hyopneumonid), Leptospira spp., Clostridium spp. (например, Clostridium perfingens, Clostridium difficile), Streptococcus spp. (например, Streptococcus suis), Brachyspira spp. (например, Brachyspira hyodysenteriae), Bordetella (например, Bordetella bronchiseptica), Pasteurella spp. (например, Pasteurella multocida), цирковирус (например, цирковирус типа 2 свиней), вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS), вирус гриппа свиней (SIV), короновирус (например, передаваемый желудочно-кишечным путем (TGE) вирус, респираторный коронавирус свиней), парвовирус или Escherichia coli; и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном из вариантов осуществления изобретения комбинированная вакцина содержит ослабленный изолят L.Intracellularis, регистрационный номер РТА-4926, и антигенный материал из Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix spp., Clostridium spp, Brachyspira spp., передаваемого желудочно-кишечным путем (TGE) вируса и Escherichia coli; и фармацевтически приемлемый носитель. Антигенный материал из Clostridium spp. может включать (но, не ограничиваясь им) антигенный материал из Clostridium perfingens и Clostridium difficil. Антигенный материал из Erysipelothrix spp. может включать (но, не ограничиваясь им) антигенный материал из Erysipelothrix rhusiopathiae.

В другом варианте осуществления изобретения комбинированная вакцина содержит ослабленный изолят L.intracellularis, ATCC, регистрационный номер АТСС РТА-4926, и антигенный материал из Salmonella choleraesuis и Erysipelothrix spp.; и фармацевтически приемлемый носитель. Еще в одном варианте осуществления изобретения комбинированная вакцина содержит ослабленный изолят L.intracellularis isolate, регистрационный номер АТСС РТА-4926, и антигенный материал из Salmonella choleraesuis и Erysipelothrix rhusiopathiae; и фармацевтически приемлемый носитель.

В следующем варианте осуществления изобретения комбинированная вакцина содержит ослабленный изолят L.intracellularis, регистрационный номер АТСС РТА-4926, антигенный материал по меньшей мере из одного другого патогена, включая (но, не ограничиваясь ими) Clostridium spp. (например, Clostridium tetani), вирус гриппа лошадей (EIV) (например, EIV-1, EIV-2), вирус герпеса лошадей (EHV) (например, EHV-1, EHV-2, EHV-3, EHV-4, EHV-5, EHV-6, EHV-7), альфавирус (например, вирус восточного энцефалита, вирус западного энцефалита, вирус венесуэльского энцефалита) или вирус Западного Нила, и фармацевтически приемлемый носитель.

Вакцины, предлагаемые в изобретении, как правило, вводят чувствительным животным, предпочтительно свинье, в виде одной или нескольких доз. Живую или убитую вакцину можно вводить 1 или 2 раза с 2-недельными интервалами. Ослабленную живую вакцину предпочтительно вводят в виде одной дозы. Предпочтительными путями введения ослабленных живых изолятов являются внутримышечный, оральный или интраназальный пути введения, а для убитой вакцины наиболее предпочтительным является введение путем внутримышечной или подкожной инъекции.

Препятствием для эффективной диагностики РРЕ является время, необходимое для культивирования вызывающих заболевание бактерий. В результате создания настоящего изобретения в настоящее время имеется возможность разработки диагностических средств, обеспечивающих быстрый и точный анализ присутствия L.intracellularis в биологических образцах, взятых из организма свиньи и других животных, чувствительных к РРЕ.

Бактерии L.intracellularis европейского происхождения, предлагаемые в настоящем изобретении, или компоненты, полученные из этих бактерий, можно применять в качестве антигена в ELISA или другом иммуноанализе, таком как метод непрямой иммунофлуоресценции ("IFA"), для обнаружения антител к L.intracellularis в сыворотке или другой общей воде организма животных, в отношении которых имеется предположение, что они заражены бактериями. В настоящее время предпочтительным иммуноанализом является IFA, описанный ниже в примере. В альтернативном варианте бактерии, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в анализе методом Вестерн-блоттинга.

Предпочтительным протоколом ELISA, предлагаемым в изобретении, является следующий протокол:

1. Добавляют антиген в количестве 0,1 мл/лунку, разведенный в буфере для сенсибилизации. Инкубируют в течение 18 ч при 4°С.

2. Промывают 3 раза ЗФР.

3. В каждую лунку планшета добавляют 0,25 мл блокирующего буфера. Инкубируют в течение 1-2 ч при 37°С.

4. Промывают 3 раза буфером для отмывки.

5. Разбавляют сыворотку блокирующим буфером и добавляют 0,1 мл в первые лунки планшета. Осуществляют серийные разведения в соотношении 1:2 в следующих лунках планшета. Инкубируют в течение 1 ч при 37°С.

6. Промывают 3-5 раз буфером для отмывки.

7. Разбавляют конъюгат блокирующим буфером и добавляют по 0,1 мл в лунки планшета и инкубируют в течение 1 ч при 37°С.

8. Промывают 3-5 раз буфером для отмывки.

9. Добавляют субстрат.

10. Измеряют абсорбцию света с помощью спектрофотометра.

11. Лунки, в которые не добавляли антиген, используют в качестве контролей.

12. В каждом тесте следует использовать также свиную сыворотку в качестве положительного и отрицательного контроля.

Предпочтительным протоколом Вестерн-бл