Выделение и очистка белка

Выделение и очистка белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантных белков, накапливающихся в рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплениях (RPBLA). Более конкретно это изобретение относится к выделению рекомбинантных слитых белков в рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплениях, которые позволяют отделять их от других органелл клетки-хозяина вследствие различий в плотности, где требуемый рекомбинантный белок можно концентрировать, отделять от других компонентов клетки и легко выделять.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Белковые тельца (PB) представляют собой субклеточные органеллы (или крупные везикулы, окруженные мембраной, с диаметром приблизительно 1-3 микрон), которые специализируются на запасании белка. В природе они образуются в некоторых определенных тканях растений, таких как семена, и служат в качестве основного источника аминокислот для проращивания и роста проростка.

Запасные белки котрансляционно встраиваются в просвет эндоплазматической сети (ER) с помощью сигнального пептида для упаковки либо в ER, либо в вакуоли (Galili et al., 1993 Trends Cell Biol. 3:437-443) и собираются в мультимерные структуры внутри этих субклеточных компартментов, образуя определенные органеллы, называемые происходящими из (ER) белковыми тельцами (PB) или вакуолями запасных белков (PSV) (Okita and Rogers, 1996 Annu. Rev. Plant Physiol Mol. Biol. 47:327-350; Herman and Larkins, 1999 Plant Cell 11:601-613; Sanderfoot and Raikel, 1999 Plant Cell 11:629-642).

Запасные белки двудольных растений представляют собой, главным образом, растворимые белки, такие как белки глобулина или вицилина типа 7S, глобулина или легумина типа 11S, и они депонируются в PSV совместно с другими белками (т.е. ингибиторами протеаз, протеолитическими ферментами, лектинами и т.п.), сахарами и солями.

В противоположность PSV, PB (1-3 микрон) депонируют, главным образом, проламины, которые представляют собой высокогидрофобные запасные белки зерновых (такие как зеины маиса и глиадины пшеницы), и в них отсутствуют другие вспомогательные белки (Herman and Larkins, 1999 Plant Cell 11:601-613).

К настоящему времени в тканях, отличных от семян растений, PB не выявлены, за исключением телец ER. Тельца ER обладают небольшим размером (0,2-0,4 микрометров) и они образуются в листьях Arabidopsis только при повреждении и разжевывании насекомыми, однако они не образуются в нормальных условиях (Matsushima et al., 2003 Plant J. 33:493-502).

Подходы генетической инженерии применяли для исследования образования растительных PB, сборки и направления запасных белков. Было показано, что в случае, когда рекомбинантные белки, главным образом, растительные запасные белки, экспрессируются и упаковываются в Arabidopsis и табаке, ткани растений, которые не содержат PB (такие как вегетативные ткани), производят эти органеллы "de novo" (Bagga et al., 1997 Plant Cell 9:1683-1696 and Bagga et al., 1995 Plant Physiol. 107:13-23, и патенты США No. 5990384, No. 5215912 и No. 5589616; и Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922).

Бета-зеин маиса при экспрессии в трансгенных растениях табака точно направлялся в новые образующиеся происходящие из ER PB в клетках листьев (Bagga et al., 1995 Plant Physiol. 107:13-23). кДНК гамма-зеина маиса и укороченная кДНК гамма-зеина, экспрессируемая в растениях Arabidopsis, также накапливаются в новых происходящих из ER PB в листьях (Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922). Богатые лизином гамма-зеины, экспрессируемые в эндосперме маиса (Torrent et al. 1997 Plant Mol. Biol. 34(1):139-149), накапливаются в PB маиса и колокализуются с эндогенными зеинами. На трансгенных растениях табака, экспрессирующих ген альфа-зеина, было показано, что альфа-зеин не способен образовывать PB. Однако, когда альфа- и гамма-зеин коэкспрессировались, стабильность альфа-зеина повышалась, и оба белка колокализовались в происходящих из ER белковых тельцах (Coleman et al., 1996 Plant Cell 8:2335-2345). Также было описано образование новых PB в трансгенных бобах сои, трансформированных богатым метионином дельта-зеином массой 10 кДа (Bagga et al., 2000 Plant Sci. 150:21-28).

Рекомбинантные запасные белки также накапливаются в подобных PB органеллах в нерастительных системах-хозяевах, таких как ооциты Xenopus, и в дрожжах. Rosenberg et al., 1993 Plant Physiol 102:61-69 описали экспрессию гамма-глиадина пшеницы в дрожжах. Ген экспрессировался правильно, и белок накапливался в происходящих из ER PB. Torrent et al., 1994 Planta 192:512-518 показали, что в ооцитах Xenopus гамма-зеин также запасается в подобных PB органеллах после микроинъекции транскриптов, кодирующих белок, в ооциты. Hurkman et al., 1981 J. Cell Biol. 87:292-299, для альфа-зеинов и Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450, для гамма-глиадинов в ооцитах Xenopus получили сходные результаты.

Одним из фундаментальных достижений в области биотехнологии (генетической инженерии) является возможность генетически воздействовать на организм для получения белка для терапевтического, нутрицевтического или промышленного применения. Получены способы продукции и выделения рекомбинантных белков из бульона для культивирования клеточных культур бактерий, дрожжей, из культур клеток сельскохозяйственных растений и млекопитающих. Описаны различные подходы для экспрессии белка в клетках-хозяевах. Основными целями этих подходов являлись: уровень экспрессии белка, стабильность белка и выделение белка (Menkhaus et al., 2004 Biotechnol. Prog. 20:1001-1014; Evangelista et al., 1998 Biotechnol. Prog. 14:607-614).

Одна стратегия, которая может решить проблему выделения белка, представляет собой секрецию. Однако секреция предполагает иногда низкие уровни экспрессии и нестабильность продукта. Другой стратегией является накопление рекомбинантного белка в наиболее подходящем отделе клетки. Эту стратегию широко использовали посредством направления рекомбинантных белков в ER с помощью конструирования C-концевого удлинения из тетрапептида (HDEL/KDEL) (Conrad and Fiedler, 1998 Plant Mol. Biol. 38:101-109).

Слитые белки, содержащие растительный запасной белок или домены запасного белка, слитые с гетерологичным белком, представляют собой альтернативный подход для направления рекомбинантных белков в ER (WO 2004003207). Одной интересной стратегией слияния является продукция рекомбинантных белков, слитых с олеозинами, составными белками масляных телец растений. Определенные свойства масляных телец дают преимущество в отношении легкого выделения белков с использованием двухфазной системы (van Rooijen and Moloney, 1995 Bio/Technology 13:72-77).

Гетерологичные белки были успешно экспрессированы в растительных клетках (обзоры Horn et al., 2004 Plant Cell Rep. 22:711-720; Twyman et al., 2003, Trends in Biotechnology 21:570-578; Ma et al., 1995, Science 268:716-719; Richter et al., 2000 Nat. Biotechnol. 18:1167-1171) и в некоторых из них, экспрессия рекомбинантного белка была направлена в происходящие из ER PB или PSV (PSV). Yang et al., 2003 Planta 216:597-603 экспрессировали лизоцим человека в семенах риса с использованием специфичных для семян промоторов запасных белков глутелина и глобулина. Результаты иммуноцитохимии показали, что рекомбинантный белок был локализован в ER-PB и что он запасался с эндогенными глобулинами и глутелинами риса. Экспрессию гликопротеина B цитомегаловируса человека (hCMV) в трансгенных растениях табака осуществляли с использованием промотора глутелина риса. Tackaberry et al., 1999 Vaccine 17:3020-3029. Недавно Arcalis et al., 2004 Plant Physiology 136:1-10 экспрессировали сывороточный альбумин человека (HSA) с C-концевым удлинением (KDEL) в семенах риса. Рекомбинантный HSA запасался в PSV с эндогенными запасными белками риса.

Одним препятствием для применения растений в качестве биофабрик является необходимость в проведении большего количества исследований, касающихся последующей переработки. Очистка белка из растений является трудной задачей вследствие сложности растительной системы. Растительные твердые вещества в экстракте являются крупными, плотными и их количество является относительно высоким (9-20 процентов по массе) (см. обзор Menkhaus et al., 2004 Biotechnol. Prog. 20:1001-1014). В настоящее время, способы очистки рекомбинантных белков включают в себя очистку экстрактов, обработку растворителями для удаления липидов и пигментов и очистку белков или пептидов с помощью нескольких колонок для ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Существующие протоколы основаны на применении определенных растворителей или водных растворов как для систем растений-хозяев, так и для рекомбинантного белка. В данной области существует необходимость в эффективных и универсальных способах выделения рекомбинантного белка из трансформированных хозяев. Эта необходимость особенно актуальна в случаях, когда необходимо выделить рекомбинантные белки, продуцируемые в хозяевах-растениях. Разнообразие хозяев и белков и их различные физико-химические характеристики требуют эффективного способа концентрирования и выделения рекомбинантных продуктов. Настоящее изобретение, описанное в настоящем документе, представляет собой один способ упрощения и повышения выделения рекомбинантно экспрессируемых белков из организмов, не относящихся к высшим растениям, таким как грибы и клетки млекопитающих.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к эффективному или универсальному процессу или способу выделения рекомбинантного белка из трансформированных хозяев. Представленная в настоящем описании разработка основана на открытии того факта, что отделение рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений (RPBLA) от белков других органелл клеток-хозяев можно осуществлять с неожиданно хорошим выходом с помощью способа на основе плотности, в частности, с помощью способов центрифугирования со слоем с определенной плотностью или с градиентом плотности.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантного слитого белка, который экспрессируется в качестве RPBLA клеток-хозяев. В соответствии с рассматриваемым способом получают водный гомогенат трансформированных клеток-хозяев, которые экспрессируют слитый белок в качестве RPBLA. Эти RPBLA обладают заранее определенной плотностью, которая может отличаться среди различных слитых белков, но является известной для конкретного слитого белка, подлежащего выделению. Заранее определенная плотность RPBLA, как правило, является более высокой, чем плотность по существу всех эндогенных белков клетки-хозяина, находящихся в гомогенате, и, как правило, составляет от приблизительно 1,1 до приблизительно 1,35 г/мл. В гомогенате образуют части различной плотности с получением части, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA, и части, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA. Часть со сниженной концентрацией RPBLA отделяют от части с относительно повышенной концентрацией RPBLA, таким образом, очищая указанный слитый белок. Часть с относительно повышенной концентрацией RPBLA можно собирать или обрабатывать одним или несколькими реагентами или подвергать одной или нескольким обработкам перед выделением RPBLA или слитого белка, находящегося в нем.

В предпочтительном варианте, слитый белок содержит две связанные друг с другом полипептидные последовательности, в которых одна последовательность представляет собой индуцирующую белковые тельца последовательность (PBIS), в то время как другая последовательность представляет собой последовательность представляющего интерес продукта, такого как молекула лекарственного средства и фермент или сходные с ними. Предпочтительные индуцирующие белковые тельца последовательности представляют собой последовательности соединений проламина, таких как гамма-зеин, альфа-зеин или проламин риса.

В настоящем описании клетки-хозяева представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки высших растений, грибов и дрожжей, клетки животных, такие как клетки млекопитающих и клетки водорослей. Эти клетки могут быть свежими, которые получают непосредственно из свежей биомассы, или они могут быть высушенными, которые получают из высушенной биомассы; под биомассой понимают массу, получаемую из живых организмов или клеток, таких как культуральная среда или живой организм, например, такой как лист растения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На чертежах, являющихся частью этого описания, на фиг.1 представлено схематическое изображение бинарных векторов, используемых для временной (агроинфильтрация) и стабильной трансформации растений табака, представленны в верхней части фигуры. Два вектора, используемые для трансформации дрожжей, представлены в середине фигуры. Векторы, используемые для временной трансфекции культур клеток млекопитающих, представлены в нижней части. RX3, N-концевой домен гамма-зеина массой 27 кДа, 22aZ, альфа-зеин массой 22 кДа, 22aZt, N-концевой домен альфа-зеина массой 22 кДа, rP13, проламин риса массой 13 кДа и CS участок расщепления.

Фиг.2 представлена в четырех частях, фиг.2,A-D. На фиг.2,A представлено запасание слитых белков RX3-T20 и RX3-EGF в листьях трансгенных растений табака. Растворимые белки экстрагировали из листьев табака дикого типа (wt) и трансгенного табака (дорожки 2 и 4), анализировали в SDS-полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозные мембраны, с последующим иммуноблот-анализом с использованием антисыворотки против гамма-зеина. Молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M) и димеры (D) слитых белков указаны стрелками.

На фиг.2,B представлен иммуноблот-анализ слитых белков RX3-T20 и RX3-EGF во фракциях градиента плотности. Очищенные гомогенаты влажных (свежих) листьев трансформированного табака помещали в ступенчатый градиент сахарозы (42%-49%-56%-65% масс./масс.). Накопление слитых белков RX3-EGF и RX3-T20 в гомогенате, супернатанте, интерфазе и фракции осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Каждая дорожка соответствует эквивалентным объемам всех фракций. H, гомогенат; S, супернатант; F42, интерфаза 42-49% масс./масс.; F49, интерфаза 49-56% масс./масс.; F56, интерфаза 56-65% масс./масс.; F65, осадок при 65% сахарозе. Молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M) и димеры (D) слитых белков указаны стрелками.

На фиг.2,C представлен анализ SDS-PAGE и анализ окрашиванием серебром слитого белка RX3-EGF, экспрессируемого pl9RX3EGF в трансформированных листьях табака, во фракциях градиента плотности. Очищенные гомогенаты влажных (свежих) листьев табака в буфере PBP помещали в ступенчатый градиент сахарозы (42%-49%-56%-65% масс./масс.). Накопление слитого белка RX3-EGF в фракциях гомогената, супернатанта, интерфазы и осадка анализировали посредством 15% SDS-PAGE и проявляли окрашиванием серебром. Каждая дорожка соответствует эквивалентным объемам всех фракций. Стрелкой указан белок RX3-EGF. H, гомогенат; S, супернатант; F42, интерфаза с 42-49% масс./масс. сахарозой; F49, интерфаза 49-56% масс./масс.; F56, интерфаза 56-65% масс./масс.; F65, осадок при 65% сахарозе. Молекулярные массы указаны слева.

На фиг.2,D представлены результаты SDS-PAGE и иммуноблотинга в отношении накопления RX3-T20 и RX3-EGF в влажных и сухих листьях табака. Листья табака высушивали при 37°C в течение одной недели и хранили в течение пяти месяцев в контейнере, не содержащем влаги. Растворимые белки, экстрагированные из эквивалентных количеств влажных (W) и сухих (D) трансформированных листьев табака, анализировали с помощью SDS-полиакриламидных гелей и иммуноблота с использованием антисыворотки против гамма-зеина (дорожки 1 и 2). Накопление RX3-EGF и RX3-T20 в плотных структурах в высушенных образцах анализировали фракционированием гомогенатов сухих листьев в градиентах сахарозы (20%-30%-42%-56% масс./масс.). Накопление слитых белков RX3-EGF и RX3-T20 в фракциях супернатанта, интерфазы и осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Наносили эквивалентные количества каждой фракции. S, супернатант; F20, интерфаза с 20%-30% масс./масс. сахарозой; F30, интерфаза с 30%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, осадок при 56% сахарозе.

Фиг.3 представлена в двух частях, фиг.3,A и B. На фиг.3,A представлено накопление RX3-EGF и RX3-T20 в агроинфильтрированных проростках табака. Все растворимые белки анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблота с использованием антисыворотки против гамма-зеина. Wt = контрольные проростки дикого типа; молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M), димеры (D) и тримеры (T) слитых белков указаны стрелками. На фиг.3,B представлено субклеточное фракционирование агроинфильтрированных проростков табака. Очищенные гомогенаты проростков помещали в ступенчатые градиенты сахарозы (20%-30%-42%-56% масс./масс.). Накопление слитых белков RX3-T20 и RX3-hGH во фракциях супернатанта, интерфазы и осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. В каждую дорожку наносили эквивалентные количества каждой фракции. S, супернатант; F20, интерфаза с 20%-30% масс./масс. сахарозой; F30, интерфаза с 30%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, осадок при 56% сахарозе. Молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M) и димеры (D) слитых белков указаны стрелками.

Фиг.4 представлена в трех частях в виде фиг.4,A, B и C. На фиг.4,A представлена концентрация белков RX3-T20 и RX3-EGF после центрифугирования через слой с сахарозой. Очищенные гомогенаты трансгенных листьев табака помещали в слой с сахарозой (42% масс./масс.). После центрифугирования накопление слитых белков RX3-EGF и RX3-T20 в супернатанте и осадке анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Каждая дорожка соответствует эквивалентным количествам фракций. H, гомогенат; S, супернатант; P, слой осадка. Молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M) и димеры (D) слитых белков указаны стрелками.

На фиг.4,B представлена очистка белка RX3-EGF после центрифугирования через слой сахарозы. Очищенные гомогенаты трансгенных листьев табака помещали в слой сахарозы (42% масс./масс.). После центрифугирования образцы белков фракций гомогената, супернатанта и осадка анализировали с помощью 15% SDS-PAGE и окрашивания серебром. Каждая дорожка соответствует эквивалентным количествам фракций. Мономер (M) и димеры (D) RX3-EGF указаны стрелками. H, гомогенат; S, супернатант; P, слой осадка. Молекулярные массы указаны слева.

На фиг.4,C представлена концентрация белка RX3-EGF и очистка после центрифугирования при низкой скорости (LSC). Очищенные гомогенаты экспрессирующих RX3-EGF листьев табака центрифугировали при 1000 × g в течение 10 минут, и осадок (P1, дорожка 2) и супернатант (S, дорожка 1) анализировали с помощью гель-электрофореза и иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Осадок P1 после центрифугирования на низкой скорости (LSC) промывали в буферной содержащей 5% TritonX-100 среде и, после второго центрифугирования, эквивалентные количества осадка P1 после LSC (дорожка 7), супернатант после промывания (W, дорожка 8) и конечный осадок P2 (дорожка 9) анализировали с помощью 15% SDS-PAGE и окрашивания серебром. Эти образцы сравнивали с эквивалентными образцами (дорожки 3-5) из осадка P1 (дорожка 3), полученного после одного центрифугирования в слое сахарозы и подвергнутого такому же процессу промывания, что и осадок LSC. Мономер (M) и димеры (D) RX3-EGF указаны стрелками.

Фиг.5 представлена в двух частях в виде фиг.5,A и B. На фиг.5,A представлено субклеточное распределение рекомбинантных слитых белков RX3-Ct, RX3-EGF и RX3-hGH, накопленных в трансфицированных клетках млекопитающих. Гомогенаты трансфицированных клеток помещали в ступенчатые градиенты сахарозы (20%-30%-42%-56% масс./масс.). После центрифугирования накопление слитых белков RX3-Ct, RX3-EGF и RX3-hGH во фракциях супернатанта, интерфазы и осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Клетки, трансфицированные плазмидой pECFP-N1 (Clontech), экспрессирующей ECGP, вариант GFP с голубой флуоресценцией, использовали в качестве контроля, и ECGP выявляли иммунологическим анализом с использованием антисыворотки против GFP. H, гомогенат; S, супернатант; F20, интерфаза с 20%-30% масс./масс. сахарозой; F30, интерфаза с 30%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, осадок с 56% сахарозой.

На фиг.5,B представлена концентрация белка RX3-EGF, экспрессируемого CHO, после центрифугирования при низкой скорости. Гомогенаты из экспрессирующих RX3-EGF клеток CHO центрифугировали при 2500 × g в течение 10 минут, и осадок (P, дорожка 2) и супернатант (S, дорожка 1) анализировали с помощью гель-электрофореза и иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Молекулярные массы указаны слева.

На фиг.6 представлено субклеточное распределение рекомбинантных слитых белков RX3-EGF и RX3-hGH, запасаемых в трансформированных клетках дрожжей. Лизированные сферопласты из трансформированных дрожжей помещали в ступенчатые градиенты сахарозы (20%-30%-42%-56% масс./масс.). После центрифугирования накопление слитых белков RX3-EGF и RX3-hGH во фракциях супернатанта, интерфазы и осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. H, гомогенат лизированных сферопластов; S, супернатант; F20, интерфаза с 20%-30% масс./масс. сахарозой; F30, интерфаза с 30%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, осадок в 56% сахарозе. Молекулярные массы указаны слева.

На фиг.7,A представлено субклеточное распределение рекомбинантных слитых белков, запасаемых в агроинфильтрированных растениях табака. Очищенные гомогенаты проростков помещали в ступенчатые градиенты сахарозы (20%-30%-42%-56% масс./масс.). Накопление слитых белков rP13-Ct, rP13-EGF и rP13-hGH во фракциях градиента супернатанта, интерфазы и осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против кальцитонина, EGF и hGH. Эквивалентное исследование проводили с использованием двух вариантов гена альфа-зеина. Проводили слияние кальцитонина (Ct) и EGF с N-концевым доменом альфа-зеина (22aZt) и проводили слияние hGH с полным геном альфа-зеина (22aZ). В каждую дорожку помещали эквивалентные количества каждой фракции. S, супернатант; F20, интерфаза с 20%-30% масс./масс. сахарозой; F30, интерфаза с 30%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, осадок в 56% сахарозе.

На фиг.7,B представлены результаты применения очищенных гомогенатов листьев из трансгенных линий табака, помещенных в ступенчатые градиенты сахарозы (10%-42%-56%-62% масс./масс.). Посредством иммуноблота с использованием антител против EGF было показано распределение rP13-EGF и 22aZt-EGF в эквивалентных количествах в каждой фракции. S, супернатант; F10, интерфаза с 10%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, интерфаза с 56%-62% масс./масс. сахарозой; F62, осадок в 62% сахарозе.

На фиг.8 представлено выделение слитого белка RX3-T20 и RX3-EGF из RPBLA. Фракции RPBLA, полученные из слоя с определенной плотностью или ступенчатого градиента, ресуспендировали в присутствии восстанавливающих веществ. Растворенные (S) и нерастворенные белки (P) анализировали с помощью иммуноблота с использованием антисыворотки против гамма-зеина. Молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M), димеры (D) и тримеры (T) слитых белков указаны стрелками.

Настоящее изобретение обладает рядом преимуществ и положительных эффектов.

Одним преимуществом является то, что его применение обеспечивает возможность относительно простой быстрой очистки экспрессируемых белков на основе отличия в плотности экспрессируемого продукта от остальных растворимых веществ клетки.

Таким образом, преимущество этого изобретения состоит в том, что оно обеспечивает способ удаления эндогенных соединений (или нерекомбинантных продуктов) из организма хозяина и культур клеток.

Другим преимуществом этого изобретения является то, что оно обеспечивает надежный и воспроизводимый способ очистки рекомбинантных пептидов или белков из свежей или высушенной биомассы (организм-хозяин).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение, главным образом, относится к последовательной обработке для выделения и очистки представляющих интерес рекомбинантных белков и пептидов из трансформированных организмов или культур клеток. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантного слитого белка, который экспрессируется и запасается в клетках-хозяевах в качестве рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплениях (RPBLA). RPBLA представляют собой скопления рекомбинантного слитого белка, индуцируемые доменами запасных белков, которые образуют внутри клеток отложения с высокой плотностью. Эти плотные отложения могут накапливаться в цитозоле, органеллах системы эндомембран, митохондриях, пластидах, или могут секретироваться. В соответствии с рассматриваемым способом, получают водный гомогенат трансформированных клеток-хозяев, которые экспрессируют слитый белок в качестве RPBLA. Для применения гомогенат предпочтительно является очищенным. В гомогенате образуются части с различной плотностью с получением части, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA, и части, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA. Часть со сниженной концентрацией RPBLA отделяют от части с относительно повышенной концентрацией RPBLA, таким образом, очищая слитый белок. Часть с относительно повышенной концентрацией RPBLA можно, таким образом, собирать или обрабатывать одним или несколькими реагентами или подвергать одному или нескольким процессам перед выделением RPBLA или слитого белка, находящегося в них.

В предпочтительном варианте, слитый белок содержит две связанные друг с другом полипептидные последовательности, в которых одна последовательность представляет собой индуцирующую белковые тельца последовательность (PBIS), в то время как другая последовательность представляет собой последовательность представляющего интерес продукта, такого как молекула лекарственного средства, и фермент или сходные с ними. Предпочтительные PBIS представляют собой последовательности соединений проламина, таких как гамма-зеин, альфа-зеин или проламин риса.

Один аспект настоящего способа включает получение водного гомогената или другого пригодного экстракта (в собирательном значении обозначаемого в настоящем описании как гомогенат) из организма-хозяина или культуры клеток, которая экспрессирует и накапливает требуемый слитый белок в виде рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений (RPBLA). Гомогенат, как правило, предварительно очищают (очищают) перед применением для удаления клеточного дербиса, например, посредством фильтрации. Гомогенат, содержащий подобные белковым тельцам структуры, содержащие слитый белок, (RPBLA), липиды, растворимые белки, органеллы клеток, сахара, пигменты и алкалоиды непосредственно помещают в ступенчатый градиент плотности, и гомогенат разделяют на основе плотности его составляющих, например, посредством центрифугирования. В процессе центрифугирования в гомогенате образуются части с различной плотностью с образованием части, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA, и части, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA. Требуемые содержащие слитый белок RPBLA можно собирать в интерфазе с определенной плотностью. Этот способ дает возможность выделения более приблизительно 90 процентов экспрессируемого рекомбинантного слитого белка с более чем приблизительно 80 процентной чистотой.

Другой аспект этого изобретения относится к способу выделения RPBLA из предпочтительно очищенного гомогената с помощью слоя с однородной плотностью. Здесь, предпочтительно очищенный гомогенат помещают в слой с определенной плотностью так, чтобы эндогенные примеси не проходили через слой, и разделяют центрифугированием так, чтобы плотные RPBLA проходили через слой и их можно было собирать. В гомогенате образуются описанные ранее части с различной плотностью с образованием части, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA (часть под слоем), и части, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA (часть над слоем). Таким образом, плотность рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений выше, чем плотность слоя.

В другом варианте осуществления предпочтительно очищенный гомогенат разделяют непосредственно центрифугированием и в отсутствие сахарозы, или другого дополнительного обеспечивающего плотность раствора. Снова центрифугирование приводит к формированию частей различной плотности, образующихся в гомогенате, с образованием части, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA (осадок), и части, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA (супернатант). Затем для осуществления очистки RPBLA и, таким образом, слитого белка RPBLA можно разделять.

Настоящее изобретение относится к способу выделения рекомбинантных пептидов или белка, экспрессируемых в RPBLA, органеллах, образующихся в трансформированных клетках-хозяевах. В настоящем описании клетки-хозяева представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки высших растений, дрожжей и грибов, клетки животных, таких как культивируемые клетки млекопитающих, клетки из трансгенных животных, яйцеклетки животных и сходные с ними, и клетки водорослей. Эти клетки могут быть свежими, которые получают непосредственно из культуральной среды или живого организма, такого как лист растений или животное, или могут быть высушенными.

Рекомбинантные подобные белковым тельцам скопления обладают заранее определенной плотностью, которая может отличаться для различных слитых белков, но которая известна для конкретного слитого белка, подлежащего выделению. Эта заранее определенная плотность RPBLA, как правило, выше, чем плотность по существу всех эндогенных белков клетки-хозяина, находящихся в гомогенате, и, как правило, составляет от приблизительно 1,1 до приблизительно 1,35 г/мл. Высокая плотность новых RPBLA является следствием универсальной способности рекомбинантных слитых белков собираться в мультимеры и запасаться.

Рассматриваемые RPBLA экспрессируются у эукариот и, как правило, характеризуются их плотностями, как указано выше. При экспрессии в клетках высших растений и животных RPBLA, как правило, обладают сферической формой, имеют диаметры приблизительно 1 микрон (мк) и окружены мембраной.

Слитые белки разделяют по их плотностям, которые обычно бывают выше, чем плотность любого другого белка, находящегося в трансфицированной клетке. Это разделение на основе плотности, как правило, проводят с использованием центрифуги, как широко распространено в биохимических лабораториях по всему миру. Иллюстративная коммерчески доступная центрифуга представляет собой Beckman Coulter Avanti^TM, модель J-25, которую используют здесь для пропускания через один слой и прямого центрифугирования. Ультрацентрифугу Beckman Coulter Optima^TM XL-100K (ротор SW41Ti) использовали для исследований с градиентом. Центрифугирование часто проводят в присутствии дополнительных обеспечивающих неравномерную плотность растворенных веществ, таких как соль, такая как хлорид цезия, или сахар, такой как сахароза. Объединение гомогената и обеспечивающих неравномерную плотность растворенных веществ приводит к образованию смеси гомогенат-раствор.

В конкретном варианте осуществления рекомбинантные слитые белки содержат, или предпочтительно получены из них, индуцирующие белковые тельца последовательности (PBIS), связанные пептидной связью с представляющими интерес продуктами (мишенями) (например, пептиды или белки). PBIS представляют собой белок или аминокислотные последовательности, которые обеспечивает проникновение и/или накопление белка в RPBLA. Иллюстративные неограничивающие примеры PBIS включают запасные белки или модифицированные запасные белки, такие как, например, проламины, или модифицированные проламины, или домены проламина. Проламины рассмотрены в Shewry et al., 2002 J. Exp. Bot. 53(370):947-958.

Гамма-зеин, запасной белок маиса, последовательности ДНК и аминокислотных остатков которого указаны ниже, представляет собой один из четырех проламинов маиса и составляет 10-15 процентов от общего количества белка в эндосперме маиса. Как и другие проламины злаков, альфа- и гамма-зеины биологически синтезируются в мембраносвязанных полисомах с цитоплазматической стороны шероховатого ER, собираются в просвете, а затем депонируются в происходящих из ER PB (Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613; Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:277-234; Torrent et al., 1986 Plant Mol. Biol. 7:93-403).

Гамма-зеин состоит из четырех типичных доменов i) сигнального пептида из 19 аминокислот, ii) домена с повторами, содержащего восемь единиц гексапептида PPPVHL (SEQ ID NO: 1) (53 aa), iii) домена ProX, в котором остатки пролина чередуются с другими аминокислотами (29 aa) и iv) гидрофобного богатого цистеином C-концевого домена (111 aa).

Способность гамма-зеина собираться в происходящие из ER белковые тельца (PB) не ограничивается семенами. Действительно, когда ген гамма-зеина был конститутивно экспрессирован в трансгенных растениях Arabidopsis, запасной белок накапливался в происходящих из ER рекомбинантных PB в клетках мезофилла листьев (Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922). При поиске сигнала, ответственного за накопление гамма-зеина в происходящих из ER PB (проламины не обладают сигналом KDEL), было показано, что богатый пролином N-концевой домен, включающий домен с тандемным повтором, был необходим для поддержания ER и что C-концевой домен был вовлечен в образование PB. Однако механизмы, посредством которых эти домены обеспечивают сборку PB, остаются неизвестными. Поскольку белковые тельца называют так соответственно только в семенах, аналогичные структуры, продуцируемые в других органах растений и в невысших растениях, называются, главным образом, рекомбинантными подобными белковым тельцам скоплениями (RPBLA).

Другие иллюстративные пригодные последовательности, подобные проламину, представлены ниже в таблице, совместно с их номером доступа в GenBank.

НАЗВАНИЕ БЕЛКА	GENBANK ID
α-Зеин (22 кДа)	M86591
Альбумин (32 кДа)	X70153
β-Зеин (14 кДа)	M13507
γ-Зеин (27 кДа)	X53514
γ-Зеин (50 кДа)	AF371263
δ-Зеин (18 кДа)	AF371265
δ-Зеин (10 кДа)	U25674
Глобулин или вицилин типа 7S	NM113163
Глобулин или легумин типа 11S	DQ256294
Проламин 13 кДа	AB016504
Проламин 16 кДа	AY427574
Проламин 10 кДа	AF294580

Кроме того, пригодные последовательности получают, проводя поиск посредством BLAST во всех неизбыточных базах данных CDS в GenBank translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF (за исключением образцов из окружающей среды), как описано в Altschul et al., 1997 Nucleic acids Res. 25:3389-3402, с использованием запроса, такого как SEQ ID NO: 2 (белковая последовательность RX3), SEQ ID NO: 3 (белковая последовательность альфа-зеина), SEQ ID NO: 4 (белковая последовательность проламина риса).

Иллюстративный модифицированный проламин включает (a) последовательность сигнального пептида, (b) последовательность одной или нескольких копий гексапептида PPPVHL (SEQ ID NO: 1) домена с повторами белка гамма-зеина, полный домен, содержащий восемь элементов гексапептида; и (c) последовательность всего или фрагмента домена ProX гамма-зеина. Иллюстративные конкретные модифицированные проламины включают полипептиды, определенные ниже как R3, RX3 и P4, последовательности ДНК и аминокислотных остатков которых также представлены ниже.

Особенно предпочтительные проламины включают гамма-зеин и составляющие его компоненты, как описано в опубликованной заявке WO2004003207, белок rP13 риса и N-концевой фрагмент альфа-зеина маиса массой 22 кДа. Последовательности ДНК и аминокислотных остатков гамма-зеина (27 кДа), белков риса и альфа-зеина представлены в SEQ ID NO: 5 (последовательность ДНК) и SEQ ID NO: 6 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 7 (последовательность ДНК RX3) и SEQ ID NO: 8 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 9 (последовательность ДНК R3) и SEQ ID NO: 10 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 11 (последовательность ДНК P4) и SEQ ID NO 12 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 13 (последовательность ДНК X10) и SEQ ID NO: 14 (белковая последовательность).

rP13 - (белковая последовательность SEQ ID NO: 15 и последовательность ДНК SEQ ID NO: 16) проламин риса массой 13 кДа, гомологичный клону - (GenBank AB016504), Sha et al., 1996 Biosci. Biotechnol. Biochem. 60(2):335-337; Wen et al., 1993 Plant Physiol. 101(3):1115-1116; Kawagoe et al., 2005 Plant Cell 17(4):1141-1153; Mullins et al., 2004 J. Agric. Food Chem. 52 (8):2242-2246; Mitsukawa et al., 1999 Biosci. Biotechnol. Biochem. 63(11):1851-1858.

22aZt - (белковая последовательность SEQ ID NO: 17 и последовательность ДНК SEQ ID NO: 18) N-концевой фрагмент альфа-зеина маиса массой 22 кДа - (GenBank V01475), Kim et al., 2002 Plant Cell 14(3):655-672; Woo et al., 2001 Plant Cell 13(10):2297-2317; Matsushima et al., 1997 Biochim. Biophys. Acta 1339(1):14-22; Thompson et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18(4):827-833.

Примеры представляющих интерес белков включают любой белок, обладающий терапевтическим, нутрицевтическим, биорегулирующим и промышленным прим