Способ определения фрагментации днк в бактериях

Способ определения фрагментации днк в бактериях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Данное изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, относится к микробиологии, сфера применения которого находится в области здравоохранения (медицине, ветеринарии, связанных с окружающей средой и фундаментальных исследованиях).

Это изобретение относится к способу определения целостности (интактности) ДНК в микроорганизме, при условии, что гибель клеток означает фрагментацию ДНК, и к набору для оценивания целостности (интактности) ДНК в микроорганизмах.

Уровень техники

Микробы могут погибать вследствие различных причин. В случае бактерий, которые являются организмами, представляющими особый интерес для здоровья, конечный механизм гибели вследствие действия антибиотических агентов фактически неизвестен, наиболее вероятно, вследствие очевидности этой проблемы. Антибиотики влияют на важные процессы клетки, что рано или поздно приведет к гибели этой клетки. Несмотря на знание начального механизма действия конкретного антибиотика, иногда невозможно ясно различить бактериостатическое или бактерицидное действие. Эта картина гибели клеток особенно осложняется вследствие недавнего описания присутствия малой доли стойких (персистирующих) клеток, неуязвимых для бактерицидных антибиотиков, несмотря на то, что они являются мутантными и не растут в присутствии антибиотика. Указанные стойкие (персистирующие) клетки объясняются, по-видимому, высокой устойчивостью биопленок и стационарных культур к гибели под действием химиотерапевтических агентов.

Кроме того, исследования профилей транскрипции всех генов Escherichia coli продемонстрировали существование группы генов, которые индуцируются, и других генов, которые репрессируются обычным образом после действия антибиотиков, причем механизм действия является очень различающимся. Это было подтверждено с использованием ампициллина, ингибитора синтеза клеточных стенок и с использованием офлоксацина, фторхинолона, блокирующего ДНК-гиразу и топоизомеразу IV, с индуцированном прямого повреждения в ДНК (Kaldalu N, Mei R, Lewis K. Killing by ampicillin and ofloxacin induces overlapping changes in Escherichia coli transcription profile. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:890-896).

Эти сведения предполагают, что гибель клеток в бактериях, например, после действия бактерицидного антибиотика может быть программированным процессом, подобным феномену апоптоза, присутствующему в высших организмах. Сходный феномен был описан в одноклеточных дрожжах в качестве реакции на действие фунгицидных агентов. Автолиз бактериальных клеток самоперевариванием клеточной стенки автолизинами после воздействия антибиотиками или неблагоприятными условиями окружающей среды может быть выражением программированной гибели клеток дефектных организмов (Lewis К. Programmed Death in Bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 2000; 64:503-514).

Начиная с истоков микробиологии, большинство исследований химиотерапевтического действия оценивали рутинным образом оценкой роста клеток как способности продуцирования колоний в полутвердой культуральной среде или вызывания помутнения в жидкой среде. Кроме того, что эта система является относительно продолжительной, она оценивает поведение не каждой клетки, а группы в целом и применима только для микроорганизмов, способных культивироваться in vitro. Для исследования стадии жизни каждой клетки необходимо использовать микроскопические и цитометрические способы (Lecoeur H. Nuclear apoptosis detection by flow cytometry: influence of endogenous nucleases. Exp CeIl Res 2002; 277:1-14; Steensma DP, Timm M, Witzig ТЕ. Flow cytometric methods for detection and quantification of apoptosis. Methods Mol Med 2003; 85:323-332).

Возможной, хотя и не обычной, оценкой является оценка проницаемости клеточной стенки и клеточной мембраны с использованием витальных красителей. Клетка окрашивается витальным красителем, только если она имеет изменение барьера, изолирующего ее от наружной среды, что обычно связано с лизисом посредством осмотического шока. Независимо от того, является ли это изменение прямым повреждением, через ферментные системы или через потерю целостности мембраны, ДНК хромосомы микроорганизма должна фрагментироваться в процессе гибели клетки. Однако целостность (интактность) хромосомной ДНК не оценивалась в качестве параметра микробной гибели в последовательных исследованиях клетки за клеткой in situ. Это объясняется отсутствием легкого, надежного и воспроизводимого способа для определения целостности хромосомной ДНК с малым размером относительно размера клеток высших организмов.

Имеются различные хорошо установившиеся методологии in situ для оценивания целостности ДНК клеток высших организмов в отношении индуцированного повреждения и гибели клеток посредством апоптоза или некроза. Мечению ДНК-разрывов in situ введением в них меченых нуклеотидов с использованием таких ферментов, как терминальная трансфераза (TUNEL) или ДНК-полимераза (ник-трансляция in situ, ISNT), придается особое значение среди таких методологий (Didenko V, ed. In situ detection of DNA damage. Humana Press, Totowa, New Yersey, 2002).

Эти методологии основаны на применении ферментов к клеткам, фиксированным на предметных стеклах, причем эти ферменты действуют на 3'-ОН-концы этих разрывов, т.е. без химических модификаций. По указанной причине их эффективность является беспорядочной, так как метятся только разрывы, доступные для такого фермента, что означает относительно низкую воспроизводимость этих результатов. Имеется только одна работа, в которой используется способ TUNEL для детектирования разрывов ДНК в Escherichia coli и архебактерии Haloferax volcanii (Rohwer F and Azam F. Detection of DNA Damage in Prokaryotes by Terminal Deoxyribonucleotide Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling Appl Environ Microbiol 2000; 66:1001-1006).

Это исследование демонстрирует возможность детектирования фрагментации бактериальной ДНК после инфицирования фагом. Однако разрывы, вызываемые непосредственно пероксидом водорода, в некоторых условиях не детектировались. Это может быть обусловлено неспособностью этого фермента метить разрывы с модифицированными 3'-ОН-концами, которая является проблемой этого способа. Кроме того, для выполнения этих способов клетки должны быть фиксированы, что влияет на способность мечения. Кроме того, эти реагенты являются дорогими, следовательно, эти способы применяются только в исследовательских испытаниях, и их невозможно применять для рутинной оценки повреждения и деградации ДНК. Эти способы являются относительно продолжительными и сложными, таким образом их обычно не применяют в микробиологии, и не было описано другое исследование в отношении этих способов.

Другим микроскопическим способом для последовательного исследования целостности ДНК клетки за клеткой in situ является кометный анализ (индикации генотипического воздействия) или электрофорез отдельных клеток (Olive PL, Durand RE. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry 2005; 66:1-8).

Эукариотические клетки включают в агарозный микрогель на предметном стекле и подвергают действию лизирующих растворов для экстракции мембран и белков. Таким образом получают нуклеоиды, т.е. депротеинизированные ядра, в которых петли ДНК релаксированы вследствие нарушения компактности. Эти нуклеоиды подвергают электрофорезу в резервуаре, заполненном буферным раствором, так что нити ДНК мигрируют в направлении анода, образуя изображение кометы с головой и хвостом в направлении электрофоретической миграции. Эти кометы окрашивают флуоресцентным красителем для наблюдения с использованием флуоресцентной микроскопии. Если ядро имеет фрагментацию ДНК, будет мигрировать большое количество ее фрагментов, концентрирующихся в хвосте кометы. Этот способ является вполне чувствительным, но относительно дорогим и сложным тестом для обычной клинической лаборатории. Действительно, он требует некоторых редких инструментов: источника энергоснабжения и резервуара и системы для улавливания (сбора) и анализа изображений. Ввиду вышеописанного он используется только для исследовательских целей. Имеется только одна опубликованная работа, в которой кометный способ использовали при нейтральном рН в бактерии Escherichia coli (Singh NP, Stephens RE, Singh H, Lai H. Visual quantification of DNA double-strand breaks in bacteria. Mutat Res 1999; 429:159-168).

Этот способ является продолжительным и сложным, требующим множественных инкубирований, и интерпретация этих изображений в отношении разрывов ДНК является неясной. Таким образом, не была описана ни одна другая работа с использованием этого способа в бактериях.

Из приведенного выше описания делается вывод, что все еще существует потребность в надежном способе, который может быть использован рутинным и простым образом для исследования in situ целостности хроматина/ДНК в микроорганизмах. Должна быть разработана и адаптирована некоторая методология, которая является гораздо более быстрой и более эффективной для оценки гибели бактерий с приданием особого значения гибели клеток, которая генерируется деградацией ДНК или претворяется в деградацию ДНК. Таким образом, это является областью, в которой вряд ли были обеспечены какие-либо новшества. Этот способ должен быть надежным, легким в выполнении, дешевым и доступным для базовой лаборатории. Кроме того, он должен давать однородные результаты между различными лабораториями и должен быть пригоден для автоматизации. Анализ диффузии ДНК является в некоторой степени сходным с анализом электрофореза отдельных клеток, позволяющим оценивать ее фрагментацию. Клетки, погруженные в инертный агарозный гель на предметном стекле, подвергают лизису. Если эти клетки имеют фрагментированную ДНК, эти фрагменты диффундируют в агарозный матрикс из исходного ядра, и наблюдаются широкие ореолы периферической диффузии фрагментов ДНК (Vasquez M, Tice RR. Comparative analysis of apoptosis versus necrosis using the single cell gel (SCG) assay. Environ Mol Mutagen 1997; 29:53). Этот способ применяли к эукариотическим клеткам, в основном соматического типа. Клетки, обнаруживающие диффузию фрагментов ДНК, соответствовали клеткам, которые погибали вследствие апоптотического процесса (Singh NP. A simple methodfor accurate estimation of apoptotic cells. Exp Cell Res 2000; 256:328-337).

Некоторые варианты этого анализа были успешно применены к клеткам спермы человека и клеткам спермы других видов животных этой исследовательской группой и были названы Дисперсией Хроматина Спермы (SCD-тестом), (Rodriguez S, Goyanes V, Segrelles E, Blasco M, Gosάlvez J Fernández JL. Critically short telomeres are associated with sperm DNA fragmentation. Fértil Steril 2005; 84:843-845; Enciso M, López-Fernάndez C, Fernández JL, Garcia P, Gosάlbez A, Gosάlvez J. A new method to analyze boar sperm DNA fragmentation under bright-field or fluorescence microscopy. Theriogenology 2006; 65:308-316).

Основные отличия этого варианта способа данного изобретения относительно способа, описанного для клеток спермы, являются следующими:

- Первая инкубация с раствором кислоты не является необходимой, необходимым является только лизис.

- Раствор для лизиса клеток спермы является неактивным в микроорганизмах, подобных бактериям. Тритон Х-100 является неактивным для лизиса этих микроорганизмов. Для этой цели для лизиса рекомендуется содержание более сильного детергента со способностью денатурирования белков, такого как ДСН, и добавление ЭДТА в качестве хелатообразующего (комплексообразующего) агента, способствующего дестабилизации клеточных стенок.

Технически эти отличия означают лизис бактериальной стенки, сохраняющей целостность ДНК. Этот последний момент является важным, так как, поскольку бактериальная ДНК является относительно недостаточной в отношении белков в сравнении с ДНК эукариотических клеток, она могла бы быть более чувствительной к ятрогенному повреждению, вызываемому во время манипулирования и обработки.

Использование высокочувствительных флуоресцентных красителей, таких как красители семейства SYBR, например SIBR Gold, позволяет различать нить ДНК нуклеоидов микроорганизма и, в частности, точно наблюдать малые фрагменты ДНК, диффундируемые в агарозе в случае фрагментации такой ДНК. Это невозможно с использованием классических флуорохромов ДНК, таких как пропидийиодид (PI), этидийбромид, акридиновый оранжевый Hoechst 33258 или 33342 или DAPI.

Другим дополнительным преимуществом является то, что необходимое время инкубации при лизисе является гораздо более коротким, что приводит к гораздо более быстрой методологии в сравнении с методологией, описанной в случае клеток спермы.

В данном изобретении существенной является стабилизация ДНК-нуклеоида микроорганизма для возможности наблюдения с использованием флуоресцентного микроскопа. Этот малый нуклеотид является очень хрупким, отделяющимся и прогрессирующим образом и быстро деградирующим в жидкой среде окрашивания после воздействия на него света флуоресцентного микроскопа. Это является существенной технической проблемой, которая не встречается в случае нуклеоидов клеток спермы или других типов клеток высших организмов с гораздо большей массой. В случае микроорганизмов для стабилизации нуклеоида и прочного прикрепления его к предметному стеклу проводят стадию инкубации при сухом интенсивном нагревании. Таким образом, после высушивания этого предметного стекла с нуклеоидом, перед окрашиванием, его инкубируют в микроволновой печи при высоком напряжении (750-1000 В) в течение 10 минут. Затем оно может быть окрашено и использовано для просмотра. Другой возможностью является инкубирование этого предметного стекла в термостате при высокой температуре, 80-100°С, в течение часов. Однако применение микроволновой печи в сильной степени ускоряет этот процесс, способствуя быстрому проведению этого технического протокола. Эта стадия стабилизации является важной в этом изобретении, так что этот способ имеет высокую дополнительную ценность в приготовлении коммерческого конечного продукта.

Из приведенного выше описания может быть сделан вывод, что способ данного изобретения приводит к изображениям нуклеоида микроорганизма, которые могут ясно различать нуклеоиды, содержащие фрагментированную ДНК. Таким образом, с использованием указанного способа определение уровней фрагментации ДНК пробы является простым и надежным, что делает возможным его применение рутинно и при низкой стоимости. Его применение возможно в различных клинических и базовых микробиологических лабораториях с пробами микроорганизмов.

Однако анализ с этими характеристиками никогда не применялся для определения целостности (интактности) ДНК микроорганизмов. Адаптация и приспособление этой методологии для оценивания геномов с относительно малым размером, после предварительно достигнутого лизиса бактериальных стенок для возможности диффузии ДНК в случае фрагментации этой ДНК представляли бы чрезвычайный потенциальный интерес. После этого был бы доступен относительно простой и быстрый инструмент, который мог бы позволить последовательное оценивание in situ, клетки за клеткой, присутствия разрывов ДНК в бактериях и других микроорганизмах репродуцируемым образом. Просмотр на микроскопическом уровне фрагментированной молекулы ДНК после действия литических агентов может быть использован для быстрого анализа гибели бактериальных клеток. Эти интересные и многочисленные потенциальные приложения указанной методологии в исследовательских, больничных, ветеринарных или защищающих окружающую среду применениях подробно описаны ниже:

- мониторинг агентов с потенциальной способностью прямого или опосредованного повреждения и фрагментирования ДНК, которые являются физическими (ионизирующими излучениями, ультрафиолетовыми излучениями), химическими (антисептическими, антибиотическими, химиотерапевтическими и антимикробными агентами в целом), биологическими и ферментативными (репаративными ферментами, рестрикционными ферментами, кодируемыми дополнительными модулями или фагами);

- мониторинг чувствительности как к известным, так и новым антимикробным лекарственным средствам;

- определение эффективности агентов, способных повреждать и фрагментировать ДНК, в зависимости от различных экспериментальных условий и условий окружающей среды;

- мониторинг стресса на уровне ДНК в природных популяциях микроорганизмов или в различных лабораторных условиях (нутриентов, старения, вариаций физико-химических агентов, таких как температура, рН, осмотическое давление, свет и т.д.);

- анализ чувствительности к индукции повреждения ДНК различных линий дикого типа и мутантных линий, например штаммов, устойчивых к антимикробным агентам, а также их репарации.

Сущность изобретения

Целью данного изобретения является разработка способа простой, быстрой и точной оценки целостности (интактности) ДНК микроорганизмов, который может быть включен в рутинную работу любой микробиологической исследовательской лаборатории.

Таким образом, первая цель этого изобретения состоит в обеспечении способа оценки целостности ДНК микроорганизма, предусматривающего следующие стадии:

a) иммобилизацию микроорганизма на предметном стекле, без фиксации, посредством включения его в инертную среду;

b) обработку лизисным раствором для экстракции клеточных стенок, мембран и белков с сохранением ДНК этого микроорганизма;

c) стабилизацию ДНК-нуклеоида этого микроорганизма на этом предметном стекле; и

d) окрашивание и оценивание целостности ДНК.

Микроорганизмы сначала включают в среду, подобную водной суспензии, предпочтительно в инертном микрогеле, в частности в агарозном микрогеле, который может быть приготовлен на подходящем носителе, например на стеклянном покровном стекле.

Выбор лизисного раствора является решающим для достижения целей этого изобретения. Важно использовать анионогенные или катионогенные денатурирующие белок детергенты, такие как додецилсульфат натрия (ДСН), алкилбензолсульфонат, N-лаурилсаркозин (саркозил), гидратированную соль гликолевой кислоты и их смеси, предпочтительно с использованием ДСН. Они являются детергентами, вызывающими высокую деструкцию мембран с лизисными эффектами, и одновременно они являются активными денатурирующими белок агентами. Их используют в денатурирующем электрофорезе, в котором белки подвергаются миграции, и гарантируют полную денатурацию (потерю трехмерной структуры). Их активность в детергентах является высокой. Применение неионогенного не денатурирующего белок детергента, т.е. детергента, солюбилизирующего эти белки, но не денатурирующего их, обычно не является эффективным для эффективного лизиса во многих микроорганизмах. Включение этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) является важным, так как она действует как хелатирующий катион Mg⁺⁺ агент, причем такие катионы стабилизируют наружную мембрану бактерий, в частности, в оболочке грамотрицательных бактерий. Могут быть также включены литические белки, как клеточной стенки, так и белков.

Предпочтительно этот лизисный раствор содержит другие агенты, благоприятствующие дестабилизации клеточных стенок и последующей экстракции. Было подтверждено, что эффективным является раствор, который содержит 0,001-2 М дитиотреитол (ДТТ), 0,001-2 М 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол (Трис), 0,001-2 М ЭДТА и 0,1-3% ДСП, при рН 6,5-10,5. Особенно предпочтительным является раствор, содержащий приблизительно 0,1 М ДТТ, приблизительно 0,01 М Трис, приблизительно 0,05 М ЭДТА и приблизительно 2% ДСН, при рН приблизительно 10.

После лизиса ДНК-нуклеоиды должны быть стабилизированы на предметном стекле таким образом, что они не деградируют и не становятся отделяемыми после подвергания действию света флуоресцентного микроскопа. Наиболее быстрой и наиболее эффективной системой является инкубация этого предметного стекла, после его дегидратации, в банях с увеличивающейся концентрацией спирта и сушка в микроволновой печи. Генерируемое нагревание прочно прикрепляет этот нуклеоид к предметному стеклу. Эта стадия является важной, специфической стадией данного изобретения. Могут быть испытаны различные мощности в течение различных периодов времени. Одной возможностью является использование максимальной мощности в течение 2-15 минут. Другой возможностью, которая является менее рекомендуемой, так как она увеличивает продолжительность этого способа, является инкубирование сухого предметного стекла в печи или сушильном шкафу при высокой температуре, 40-100°С, в течение одного или нескольких часов.

Способ по данному изобретению имеет стадию оценивания целостности ДНК микроорганизмов, после стадий а), b) и с). Хотя имеются несколько альтернатив для этого оценивания, предпочтительно оно должно быть визуальным. Для этой цели этот способ предпочтительно включает в себя стадию окрашивания пробы после стадий а), b) и с). При условии относительно малого размера ДНК микроорганизмов указанное окрашивание должно проводиться с высокочувствительным красителем с использованием микроскопа с линзой высокого увеличения (обычно 100Х). Таким образом, системы на основе флуоресцентной микроскопии, использующие ДНК-специфические флуорохромы, в частности системы, обеспечивающие наилучшую чувствительность и стабильность, являются предпочтительными. Этот перечень является экстенсивным и непрерывно растет. В качестве примеров могут быть упомянуты GelRed, EvaGreen и другие производные цианина, такие как красители семейства SIBR, красители PicoGreen, варианты ТОТО, YOYO, BOBO, POPO, JOJO, LOLO, SYTOX, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, PO-PRO, LO-PRO и т.д.

Оценивание этих результатов может проводиться наблюдателем, относящим каждый наблюдаемый нуклеоид к предварительно установленной шкале повреждений. Может быть также предпочтительным оценивание с использованием системы для сбора данных цифровых изображений, сопряженная с программным обеспечением (программой), количественно определяющим уровень повреждения.

Второй целью данного изобретения является изготовление набора для оценивания целостности ДНК микроорганизмов, в основном содержащей:

a) предобработанные стеклянные предметные стекла для удерживания и сохранения микрогеля с микроорганизмами;

b) раствор для смешивания и включения этих микроорганизмов в микрогели;

c) лизисный раствор для экстракции стенок, мембран и белков и

d) флоурохром для окрашивания ДНК.

Этот набор позволяет проводить описанный выше способ.

Третьей целью данного изобретения является разработка программного обеспечения (программы) для автоматизированного измерения уровней фрагментации ДНК микроорганизма.

Описание чертежей

Фигура 1 показывает нуклеоиды из культуры клеток Escherichia coli, полученные после применения способа, описанного в этом изобретении. Интактные нуклеоиды являются компактными, выравненными на предметном стекле, причем непрерывность растворов, предполагающая фрагментацию ДНК, не наблюдается. Нуклеоид с массивно фрагментированной ДНК (выше) из спонтанно мертвых клеток наблюдается иногда в этой культуре.

Фигура 2 показывает различные прогрессирующие степени повреждения ДНК Escherichia coli: а: интактный нуклеоид (уровень 0).

b) Нуклеоид с отдельными периферическими фрагментами относительно большого размера, после разрывов ДНК (уровень 1, низкая степень повреждения).

c): Более релаксированный нуклеоид, занимающий большую поверхность, с отдельными периферическими фрагментами относительно большого размера, после разрывов ДНК (уровень 2, среднее повреждение).

d: Гораздо более релаксированный и обширный нуклеоид, с большим количеством периферических фрагментов, после разрывов ДНК (уровень 3, высокая степень повреждения).

е: Нуклеоид с массивной фрагментацией ДНК, образованный многочисленными малыми фрагментами, которые диффундировали в агарозный матрикс, после лизиса, определяя более широкую поверхность диффузии (уровень 4, массивное повреждение).

Фигура 3 показывает способ DBD-FISH для детектирования разрывов ДНК, гибридизации зонда тотальной геномной ДНК Escherichia coli, меченого Су3 (А). Этот нуклеоид с диффузией фрагментов имеет интенсивное мечение, в то время как остальные нуклеоиды обнаруживают только очень дискретное фоновое мечение. Эту ДНК окрашивали контрастно при помощи DAPI (В).

Фигура 4 показывает применение способа этого изобретения к пробе Acinebacter baumannii. Показаны два интактных нуклеоида с ДНК, разрушенной во фрагменты.

Фигура 5 показывает массивную фрагментацию ДНК Escherichia coli после подвергания этих бактерий действию 10 мМ пероксида водорода в течение 10 минут.

Фигура 6 показывает повреждение ДНК Escherichia coli, наблюдаемое после различных периодов инкубации с ципрофлоксацином (1 мкг/мл). а: 0 минут, b: 2,5 минуты, с: 5 минут, d: 15 минут, е: 40 минут. Начальный уровень повреждения наблюдается уже после 5 минут, увеличиваясь прогрессирующим образом с более продолжительными периодами инкубации.

Фигура 7. Нуклеоиды Escherichia coli, наблюдаемые после инкубирования с ампициллином (300 мкг/мл) в течение 20 минут (а) и после 24 часов (b). Фрагменты ДНК не наблюдаются после 20 минут, тогда как после 24 часов фон покрыт фрагментами ДНК.

Фигура 8 показывает графики, изображающие среднее развитие площади (в пикселах, y-ось) ореола диффузии фрагмента или релаксацию петли нуклеоида Escherichia coli (А) и капсулы (В), относительно времени после инкубации с 10 микрограммами на мл ципрофлоксацина, 40 минут (х-ось).

Фигура 9 показывает диаграмму рутины, которой следует придерживаться для постепенного измерения и процесса принятия решения в отношении фрагментации бактериальной ДНК с генерированием конечного сообщения.

Фигура 10 показывает пробу трех процессов для сегментирования и определения границ ROI, проводимых с использованием цифрового сбора данных, показывающих бактериальную область, включающую в себя 3 бактерии с нормальной ДНК и 2 бактерии с фрагментированной ДНК (верхнее левое изображение). Остальные изображения соответствуют электронным фильтрам исходного изображения, которые могут быть полезны в качестве стратегии, которая должна проводиться для более легкого различения обоих типов клеток.

Фигура 11 показывает среднюю интегрированную плотность в 9 разных экспериментальных сериях, в которых выбирали бактерии с нефрагментированной ДНК (1) и бактерии с фрагментированной ДНК (2). Верхняя часть этой фигуры показывает средние величины на эксперимент, в то время как нижняя часть показывает общее среднее на группу в соответствии с нефрагментированной ДНК (1) против фрагментированной ДНК (2) в качестве критерия.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Как будет подробно описано ниже, способ и набор данного изобретения являются простой и надежной системой для определения частоты встречаемости микроорганизмов с фрагментированной ДНК.

Способ этого изобретения, который позволяет оценивать целостность (интактность) ДНК микроорганизма, предусматривает стадии:

a) иммобилизации микроорганизма на предметном стекле, без фиксации, посредством заключения его в инертную среду;

b) обработки лизисным раствором для экстракции клеточных стенок, мембран и белков;

c) стабилизации ДНК нуклеоида на предметном стекле и

d) окрашивания и оценивания целостности ДНК.

Способ этого изобретения вместе с некоторыми вариантами и необязательными стадиями подробно описан ниже. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что имеются другие варианты осуществления и возможности, при условии сохранения этих описанных важных аспектов.

А) Первой стадией является приготовление пробы. Посредством обычных в данной области способов получают и подтверждают определенную концентрацию микроорганизмов в жидкой пробе. Подходящая концентрация для этого анализа находится в диапазоне 0,1-20 миллионов микроорганизмов на миллилитр. Если эта проба является избыточно концентрированной, ее доводят до этой подходящей концентрации разведением ее культуральной средой или забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) или т.п., подходящим в соответствии с этим микроорганизмом.

Эту обработку рекомендуется проводить в условиях низкой яркости света для предотвращения фотоиндуцируемого повреждения ДНК во время манипулирования и инкубации. Проба должна быть помещена на носитель для ее обработки в соответствии со способом этого изобретения и облегчения ее оценивания. Этим носителем является предпочтительно стеклянное предметное стекло, которое покрыто стандартной агарозной пленкой. Для этой цели готовят стандартный агарозный раствор 0,2-1% в дистиллированной воде в сосуде Коплина или подобном сосуде. Его покрывают перфорированной пластиковой пластиной и помещают в микроволновую печь. Микроволновую печь доводят до мощности 300-1000 В, предпочтительно 500 В, перемешивая этот контейнер время от времени для лучшего растворения агарозы. Этот способ может также проводиться с использованием термостатической бани. Когда этот раствор агарозы становится полностью прозрачным, он может быть легко помещен в вертикальные сосуды с содержанием 10-250 мл. Эти сосуды должны быть предварительно отрегулированы в бане при 60-100°С, предпочтительно при 70°С, для поддержания раствора агарозы в жидком состоянии.

Предметные стекла должны быть чистыми. Их погружают вертикально, удерживая их пинцетом в зоне дна 1-60 секунд, вынимая их и погружая опять один-десять раз, пока не образуется гомогенная пленка на предметном стекле. Их помещают горизонтально на ровную и холодную поверхность при 1-15°С, предпочтительно при 4°С, изготовленную, например, из стекла или металла. Эту пластину с предметными стеклами вводят в холодильник при 4°С по меньшей мере на 30 минут, пока не будет подтверждено, что раствор агарозы желатинировался на поверхности предметного стекла. Эти лотки удаляют из холодильника и поверхность этих предметных стекол, которая находилась в контакте с этой пластиной, очищают промакательной бумагой. Затем эти предметные стекла вводят горизонтально в сушильный шкаф при диапазоне температур 37-100°С и выдерживают, пока агароза не высохнет полностью и не образует тонкую пленку, прикрепленную к стеклу. Обработанные таким образом предметные стекла могут быть использованы немедленно или могут храниться в хорошо закрытом боксе при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.

Для облегчения обработки пробы, содержащей микроорганизмы, ее вводят в среду с признаками, сходными с признаками суспензии, такую как, например, агарозный микрогель. В этом случае раствор агарозы с низкой точкой плавления/низкой точкой желатинирования при концентрации 0,5-2% в дистиллированной воде или забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР). Эту агарозу расплавляют с использованием микроволновой печи или термостатируемой бани и затем поддерживают между 30°С и 37°С в пробирке, введенной в термостатированную баню или сушильный шкаф. В пробирке Эппендорфа или подобной пробирке эту пробу и раствор агарозы осторожно смешивают, так что последний находится при концентрации 0,3-1%; например, 70 микролитров раствора агарозы +30 микролитров этой пробы. Важно, чтобы температура агарозы не была выше 37°С, чтобы микроорганизмы не повреждались.

Наконец, для получения пробы на носителе покрытые предметные стекла помещают на ровной и холодной стеклянной или металлической поверхности с температурой в диапазоне 1-15°С, предотвращающей образование воздушных пузырьков. Рекомендуется помещение микропипеткой капли 5-200 микролитров этой смеси с помещением покровного стекла на верхнюю часть этой капли. В качестве меры предосторожности рекомендуется обработка каждой пробы в двух повторностях и рекомендуется использование контрольной пробы каждый раз при применении этого способа. Пластину с предметными стеклами вводят в холодильник при 4°С на 2-30 минут, пока не произойдет подходящее желатинирование агарозы. После того как произошло желатинирование, покровные стекла осторожно удаляют внутри холодильника, предотвращая повреждение этого микрогеля.

В) После того как эти пробы были подходящим образом приготовлены для их легкого и повторяемого манипулирования, их обрабатывают в соответствии со способом этого изобретения при помощи лизисной стадии обработки для экстракции стенок, мембран и белков. Для этой цели каждое предметное стекло погружают в вертикальном положении в сосуд, содержащий лизирующий раствор.

В предпочтительном варианте осуществления этот раствор образован: 0,001-2 М, предпочтительно 0,01-0,8 М, дитиотреитолом (ДТТ); 0,001-2 М, предпочтительно 0,005-0,4 М, 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиолом (Трис); 0,001-2 М, предпочтительно 0,01-1 М, этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и 0,1-3%, предпочтительно 0,5-2,5% додецилсульфатом натрия (ДСН). Этот раствор доводят до рН 6,5-10,5, предпочтительно 10, с доведением при помощи, например, NaOH.

Имеются другие альтернативные лизисные растворы с другими дополнительными добавками, или концентрации и периоды инкубации и температуры описанного раствора могут варьироваться при условии сохранения его основных функциональных признаков. Так, в качестве альтернатив ДТТ имеются соединения, такие как бета-меркаптоэтанол и другие восстанавливающие агенты. В качестве альтернативы Трису могут быть использованы другие буферные растворы, такие как HEPES, Mops, Pipes. В качестве альтернативы ЭДТА могут быть использованы другие хелатообразующие агенты, такие как ЭГТА и т.д. В качестве альтернативы ДСН могут быть использованы катионогенные или анионогенные детергенты, как упоминалось выше.

В соответствии с используемыми раствором и типом пробы эти препараты инкубируют в лизисном растворе 1-120 минут, предпочтительно 1-35 минут, особенно предпочтительным является период времени приблизительно 5 минут; и при температуре 1-45°С, предпочтительно 18-40°С, особенно предпочтительной является температура 37°С.

После обработки лизисным раствором эти препараты могут быть промыты для удаления остатков этих растворов. Для этой цели предметные стекла вводят горизонтально в промывной раствор, который является как можно более мягким, свободным от хелатообразующих агентов или детергентов. Например, они могут быть погружены в вертикальном положении в сосуд, содержащий избыточное количество дистиллированной воды, или буферного раствора, или физиологического солевого раствора, на период времени 1 минута-60 минут.

Затем эту пробу дегидратируют. Для этой цели могут быть использованы увеличивающиеся концентрации спирта. Например, предметные стекла снимают и погружают в горизонтальном положении в сосуды с серией увеличивающихся концентраций этанола, между 5 и 100%, на 30 секунд - 60 минут в каждом случае, и затем препаратам дают высыхать на воздухе. Температура спиртов может находиться в диапазоне -20°С - комнатная температура. Может быть предпочтительным использование спиртов при -20°С для улучшения осаждения ДНК в течение 5 минут в каждом случае. В качестве альтернативы этим инкубациям в серии этанола эти препараты могут быть дегидратированы инкубированием в растворах разных спиртов, например метанола, или с использованием сушки на воздухе или сушки в сушильном шкафу. Важно, что это предметное стекло должно быть сухим, так чтобы ДНК прикреплялась к нему, поскольку она обычно становится отделенной после подвергания действию луча света флуоресцентного микроскопа. Для этой цели рекомендуется оставлять его высыхать при высокой температуре в течение продолжительного действия. Например, рекомендуется инкубировать его при 80°С в течение по меньшей мере 60 минут.

После их полного высыхания эти уже обработанные предметные стекла, содержащие пробу, могут храниться в расфасовочных боксах при комнатной температуре, в темноте, в течение месяцев. Это облегчает разделение процесса обработки в соответствии с этим изобретением и последующей стадии оценивания целостности ДНК микроорганизмов. Эта расфасовка позволяет повторяемое оценивание при разных интервалах нескольких проб одного и того же микроорганизма.

С) После сушки решающими являются стабилизация и прочное прикрепление ДНК-нуклеоида к предметному стеклу, так как обычно он становится отделенным после подвергания воздействию луча света флуоресцентного микроскопа. Для этой цели сухие предметные стекла инкубируют в микроволновой печи при мощности 300-1000 В, предпочтительно при 500 В, в течение 5-10 минут. Альтернативно, хотя и менее рекомендуемо вследствие его продолжительности, является инкубирование этих предметных стекол в печи или сушильном шкафу при высокой температуре в течение одного или нескольких часов. После полного высыхания эти уже обработанные предметные стекла, содержащие пробу, могут храниться в расфасовочных боксах при комнатной тем