Способ получения биоспецифического полимерного сорбента для выделения протеиназ

Способ получения биоспецифического полимерного сорбента для выделения протеиназ

Реферат

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения биоспецифического полимерного собента, который используют для удаления протеолических ферментов из крови и других биологических жидкостей с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая сепсис, гнойный перитонит, панкреатит, бронхиальную астму и т.п.

Известен способ получения биоспецифического полимерного сорбента для выделения протеиназ путем взаимодействия ингибитора трипсина из сои с активированным сшитым полисахаридом - сефарозой [Gilliam Е.В., Kitto G.B., Isolation of starfish trypsin by affinity chromatography, Comparative Biochemistry and Physiology, 1976, V.54, №1, p.21-26].

Недостатком известного способа является невысокая эффективность сорбции, составляющая 0,2 мг фермента на 1 мг химически связанного с полимером ингибитора.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения биоспецифического полимерного сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-1,5 мас.%, овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты, 7,0-20,0 мас.%, гидрофильного мономера и 0,7-15,0 мас.% бифункционального сшивающего агента [Авторское свидетельство СССР №1137388 A, G01N 33/50, Бюл. №4, 1985]. В качестве гидрофильного мономера используют акриламид, метакриламид или N-винилпирролидон. Эффективность сорбента при сорбции протеиназ из крови собаки или плазмы крови человека составляет 0,8-1,0 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида.

Недостатком известного способа является невысокая эффективность сорбции при извлечении протеиназ из крови. Причина этого заключается в том, что оптимум pH действия овомукоида равен 8,0, то есть максимальной емкостью сорбент обладает при извлечении протеиназ из раствора с pH 8,0.

Однако pH крови отличается от этой величины и составляет примерно 7,4.

Задачей изобретения является повышение эффективности сорбента при сорбции протеиназ из крови и плазмы.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является повышение эффективности сорбента при сорбции протеиназ из крови и плазмы.

Технический результат достигается тем, что в способе получения биоспецифического полимерного сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-1,5 мас.%, овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты, 7,0-20,0 мас.%, гидрофильного мономера, состоящего из акриламида, метакриламида или N-винилпирролидона, и 0,7-15,0 мас.% бифункционального сшивающего агента, в гидрофильный мономер дополнительно вводят N-этилбромид диметиламиноэтилметакрилат, взятый в количестве 45-55 мас.%, по отношению к массе гидрофильного мономера.

В качестве сшивающего агента используют N,N-метиленбисакриламид (БИС) или диэфир метакриловой кислоты и полиоксиэтиленгликоля со степенью полимеризации 3 (ТГМ-3) или диэфир метакриловой кислоты и полиоксиэтиленгликоля со степенью полимеризации 13 (ТГМ-13).

Используемый овомукоид является гликопротеином с молекулярной массой 31000 и содержит два центра связывания трипсина и один центр связывания химотрипсина, то есть в пределе 1 мг овомукоида может связывать до 1,5 мг трипсина и до 0,7 мг химотрипсина.

Овомукоид выделяют из белка утиных яиц по методике [Шульгин М.Н., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В. Свойства утиного овомукоида, очищенного методом аффинной хроматографии на трипсинсефарозе, Биохимия, 1981, т.46, №3, с.473-480].

N-этилбромид диметиламиноэтилметакрилата (ЭБ-ДМА) получают добавлением 0,035 моля диметиламиноэтилметакрилата по каплям при перемешивании к 0,8 моля этилбромида при 0°C в присутствии ингибитора полимеризации - гидрохинона в количестве 1 мас.%. Образующийся осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Температура плавления ЭБ-ДМА равна 103°C.

Механизм действия N-этилбромид диметиламиноэтилметакрилата (ЭБ-ДМА) заключается в придании сшитому полимеру положительного заряда, что приводит к изменению локального значения pH у активного центра овомукоида и обеспечивает смещение эффективного оптимума pH действия овомукоида с 8,0 до 7,35-7,45.

Пример 1.

В 91 мл бикарбонатного буфера (рН 8,0) растворяют 1,0 г овомукоида. К раствору при 0°C добавляют 0,01 мл хлорангидрида акриловой кислоты (ХААК). Реакционную смесь перемешивают при 0°C в течение 15 минут. К раствору добавляют 3,85 г акриламида, 3,15 г ЭБ-ДМА, 1,0 г БИС и инициатор полимеризации - 0,01 г персульфата аммония и 0,2 мл 0,4%-го раствора N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина. Через раствор в течение 10 минут пропускают азот для удаления растворенного кислорода. Полимеризацию проводят выдерживанием реакционной смеси при 10°C в течение 20 минут.

Полученный сорбент измельчают продавливанием через сито с диаметром пор 1,0 мм и промывают водой до полного удаления непрореагировавших веществ.

Полноту удаления контролируют спектрофотометрически.

Количество связанного овомукоида определяют по разнице между исходной концентрацией овомукоида и его концентрацией в промывных водах. Оно равно 4,2 мг на 1 г сорбента. Затем сорбент выдерживают в физиологическом растворе (0,9%-ный раствор NaCl).

Для изучения свойств сорбента его помещают в колонку объемом 30 мл и через колонку пропускают 250 мл плазмы крови человека, содержащей трипсин.

Количество сорбированного трипсина определяют путем смывания его с колонки водным раствором с pH 1,5.

Состав исходного раствора и свойства сорбента приведены в таблице.

Примеры 2-12.

Процесс проводят по примеру 1, используя различные исходные соединения и их количества.

Состав исходной смеси и свойства сорбентов приведены в таблице.

№ примера	Исходная смесь*, г/100 г раствора (мас.%)	Содержание овомукоида в сорбенте, мг/г	Емкость сорбента, мг трипсина/г сорбента	Эффективность сорбции, мг трипсина/мг овомукоида
Овомукоид	Мономер	ЭБ-ДМА	Сшивающий агент
1	1,0 ХААК	3,85 АА	3,15	1,0 БИС	2,6	3,35***	1,28
2	1,0 ХААК	3,15 АА	3,85	0,7 БИС	1,9	2,26***	1,19
3	1,0 ХААК	3,5 АА	3,5	0,7 БИС	1,3	1,70***	1,21
4	1,0 ХААК	10,0 АА	10,0	1,5 БИС	2,8	3,13**	1,12
5	0,1 ХААК	5,5 АА	4,5	15,0 ТГМ-13	0,9	1,33***	1,47
6	0,8 ХАМАК	6,75 АА	8,25	10,0 ТГМ-13	2,3	3,00**	1,30
7	1,5 ХААК	5,0 МАА	5,0	8,0 ТГМ-3	3,2	3,81***	1,19
8	1,5 ХАМАК	4,0 ВП	4,0	10,0 БИС	2,0	2,55***	1,28
9	0,5 ХААК	3,5 ВП	3,5	1,5 БИС	1,1	1,63***	1,48
10	0,1 ХАМАК	4,5 МАА	5,5	5,0 ТГМ-3	0,6	0,86**	1,43
11	1,5 ХААК	7,5 АА	7,5	1,5 БИС	2,4	2,90***	1,21
12	1,2 ХААК	7,5 АА	7,5	1,5 БИС	1,5	1,85***	1,23
* ХААК - хлорангидрид акриловой кислоты, ХАМАК - хлорангидрид метакриловой кислоты, АА - акриламид, МАА - метакриламид, ВП - N-винилпирролидон.
** Сорбция из крови собак.
*** Сорбция из плазмы крови человека.

Видно, что введение в состав сорбента положительно заряженного мономера приводит к повышению эффективности сорбции протеиназ из биологических жидкостей на 20-50% по сравнению с прототипом (с 0,8-1,0 до 1,19-1,47 мг фермента/мг овомукоида).

Предельные количества мономеров при получении сорбента определяются тем обстоятельством, что именно при таком содержании звеньев мономеров в сорбенте оптимум pH действия овомукоида равен pH раствора, из которого проводится сорбция.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет получать биоспецифические сорбенты протеиназ с повышенной эффективностью сорбции протеиназ из биологических жидкостей.

Кроме того, поскольку основной вклад в стоимость сорбента вносит овомукоид, то использование предлагаемого способа позволит более эффективно использовать овомукоид и существенно снизить стоимость проведения операции сорбции.

Способ получения биоспецифического полимерного сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-1,5 мас.% овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты, 7,0-20,0 мас.% гидрофильного мономера, состоящего из акриламида, метакриламида или N-винилпирролидона, и 0,7-15,0 мас.% бифункционального сшивающего агента, отличающийся тем, что в гидрофильный мономер дополнительно вводят N-этилбромид диметиламиноэтилметакрилат, взятый в количестве 45-55 мас.% по отношению к массе гидрофильного мономера.