Модифицированная аденилатциклаза bordetella, содержащая домен взаимодействия cd11b/сd18 или лишенная домена взаимодействия cd11b/cd18, и ее применение

Модифицированная аденилатциклаза bordetella, содержащая домен взаимодействия cd11b/сd18 или лишенная домена взаимодействия cd11b/cd18, и ее применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к модифицированным аденилатциклазным токсинам Bordetella, которые являются дефектными в отношении связывания CD11b/CD18, и к их применению в приготовлении фармацевтической композиции для лечения коклюша и/или для защиты против инфекции Bordetella. Данное изобретение относится также к специфическим фрагментам аденилатциклазы Bordetella, содержащим домен взаимодействия CD11b/CD18, и к их применению, в частности для нацеливания представляющей интерес молекулы на экспрессирующие CD11b-клетки.

Род Bordetella содержит четыре вида, а именно: Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica и Bordetella avium.

Bordetella являются грамотрицательными коккобациллами, ответственными за респираторные инфекции. Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis точно являются патогенами человека. Bordetella bronchiseptica является патогенной для различных млекопитающих, и более редко для людей, и, в отличие от B.pertussis и Bordetella parapertussis, способна выживать вне хозяина. Bordetella avium является патогенной для птиц.

Наиболее вирулентным видом для людей является B.pertussis, которая является этиологическим агентом коклюша, высококонтагиозного респираторного заболевания детей, характеризующегося бронхопневмонией и пароксизмальным кашлем, прерываемым дыхательными судорожными вдохами во время приступа кашля.

Вакцинацию против коклюша до сих пор проводили наиболее часто с использованием инактивированных целых бактерий. Однако такие вакцины не всегда лишены токсичности ввиду того факта, что факторы вирулентности состоят из белков, секретируемых этими бактериями, а не из самих бактерий. Таким образом, эти белки могут проявлять тяжелые патологические действия, даже после гибели этих бактерий.

Европейский патент ЕР 0424158 (Институт Пастера) описывает применение аденилатциклазы Bordetella в качестве защитных антигенов как против Bordetella pertussis, так и против Bordetella bronchiseptica.

Европейский патент ЕР 0338169 (Институт Пастера) описывает также применение препаратов активной аденилатциклазы из Bordetella parapertussis в качестве защитных агентов против коклюша.

Были также разработаны другие стратегии, в том числе приготовление бесклеточной вакцины с использованием иммуногенных детоксифицированных токсинов Bordetella.

Пример вакцины на основе детоксифицированного токсина pertussis описан в Патенте США SN 6040427 (Locht et al., 2000).

Среди различных токсинов, продуцируемых B.pertussis, аденилатциклаза (также называемая далее термином CyaA) является решающим фактором в стратегии вирулентности этих бактерий во время ранних фаз колонизации дыхательных путей (Goodwin and Weiss, 1990; Khelef et al., 1992). Этот токсин позволяет патогену избегать иммунного надзора хозяина, в основном, посредством интоксикации нейтрофилов и макрофагов, вызыванием ослабления фагоцитов и индукцией апоптоза макрофагов (Confer and Eaton, 1982; Gueirard et al., 1998; Harvill et al., 1999; Khelef and Guiso, 1995; Khelef et al., 1993). Роль CyaA в патогенезе B.pertussis была ясно продемонстрирована на мышиной респираторной модели. Действительно, генетически модифицированные штаммы B. Pertussis, дефектные по экспрессии CyaA, были ослабленными в их способности индуцировать легочные повреждения и вызывать летальную инфекцию (Khelef et al., 1994; Weiss and Goodwin, 1989). С другой стороны, было показано, что CyaA индуцирует защитный иммунитет против колонизации легких B.pertussis на мышиной модели (Betsou et al., 1993; Betsou et al., 1995; Hormozi et al., 1999).

CyaA представляет собой полипептид с длиной 1706 аминокислотных остатков, состоящий из четырех функциональных доменов; домена активности аденилатциклазы (АС) (остатки 1-400), гидрофобного каналообразующего домена (остатки 500-700), кальцийсвязывающего богатого повторами глицина/аспартата домена (остатки 1000-1600) и С-концевого домена, несущего сигнал секреции (остатки 1600-1706). CyaA способна внедряться в эукариотические клетки и перемещать ее каталитический домен в цитоплазму, где, после активации эндогенным кальмодулином, он катализирует превращение АТФ в цАМФ (Ladant and Ullman, 1999). Считается, что накопление цАМФ в цитозоле клетки является ответственным за токсическое действие этого токсина (Rogel et al., 1991). Основными последствиями этой интоксикации являются апоптоз клеток и изменение фагоцитарных способностей и продуцирование супероксида (Confer and Eaton, 1982; Friedman et al., 1987; Khelef et al., 1993; Njamkepo et al., 2000; Pearson et al., 1987).

Полная последовательность аденилатциклазы Bordetella pertussis показана в SEQ ID NO:1.

Полная последовательность аденилатциклазы Bordetella bronchiseptica показана в SEQ ID NO:3.

CyaA требуется кальций для приобретения специфической для перемещения конформации, которая делает возможной доставку каталитического домена в цитозоль клетки (Regel and Hanski, 1992; Rose et al., 1995). Первично, CyaA продуцируется в виде неактивного протоксина, proCyaA, который после посттрансляционной модификации ацилтрансферазой, продуктом гена cyaC, становится активным токсином. Это ковалентное посттрансляционное ацилирование (ацилами жирных кислот) требуется для перемещения этого токсина через мембраны клетки-мишени и доставки его каталитического домена АС, а также для образования гемолитических катион-селективных каналов. Ацилирование proCyaA происходит в двух различных положениях, Lys-983 и Lys-860, которые расположены в консервативных сайтах ацилирования RTX (Barry et al., 1991; Hackett et al., 1994). Хотя ацилирование Lys-860, по-видимому, не является необходимым для активности CyaA, было показано, что ацилирование Lys-983 является решающим (Basar et al., 2001).

CyaA может проникать в широкий диапазон типов клеток, в том числе в эритроциты млекопитающих, лишенные мембранного транспорта (Bellalou et al., 1990; Gray et al., 1999; Rogel and Hanski, 1992). В противоположность этому эффекты токсичности CyaA, такие как нейтрализация фагоцитарной способности и индукция апоптоза, были в основном выявлены на иммунных клетках, а именно нейтрофилах и макрофагах (Confer and Eaton, 1982; Khekef et al., 1993). Кроме того, в мышиной респираторной инфекции было показано, что CyaA проявляет специфическую интоксикацию в отношении альвеолярных макрофагов (Gueirard et al., 1998). В Патенте WO 93/21324 (Институт Пастера, 1993) описана также вакцина, содержащая рекомбинантный аденилатциклазный токсин, продуцируемый B.pertussis, прикрепленный к гетерологичным эпитопам. Недавно было продемонстрировано, что CyaA связывается специфически с клетками-мишенями через интегрин α_Мβ₂ (CD11b/CD18). Это связывание было насыщаемым и полностью ингибируемым моноклональными анти-CD11b-антителами. CyaA проявлял селективную токсичность в отношении CD11b⁺ клеток, показывая, что его взаимодействие с CD11b является необходимым для перемещения каталитического домена и последующего увеличения цАМФ и гибели клеток. Кроме того, чувствительность клеток СНО к цитотоксичности CyaA разительно увеличивалась после экспрессии гетеродимера CD11b/CD18. Кроме того, ионы Са²⁺, которые требуются для перемещения каталитического домена в клетки, были также строго необходимыми для взаимодействия CyaA с CD11b (Guermonprez et al., 2001). Важность CD11b для взаимодействия CyaA с клетками была дополнительно продемонстрирована в системе, где CyaA использовали в качестве вектора для доставки чужеродных антигенов в антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки. Только дендритные клетки субпопуляции CD11c⁺ CD8α-CD11b^high были фактически способны представлять пептидные комплексы МНС класса I, соответствующие эпитопу, инсертированному в рекомбинантный CyaA (Guermonprez et al., 2002).

Белок CD11b является членом большого семейства β₂-интегринов, молекул адгезии лейкоцитов, которое содержит LFA1 (CD11a), МАС-1 (CD11b) и р150,95 (CD11c). Члены этого семейства отличаются их α-цепью, которая экспрессируется в виде облигатного гетеродимера с β-цепью (CD18) (Arnaout, 1990). CD11b, также известный как рецептор типа 3 комплемента (CR3), экспрессируется на макрофагах, нейтрофилах, дендритных клетках, НК-клетках, перитонеальных клетках В-1 и субпопуляции CD8⁺ Т-клеток (Arnaout, 1990; Bell et al., 1999). Он играет ключевую роль в адгезивных функциях лейкоцитов и запускает фагоцитоз покрытых комплементом частиц (Diamond and Springer, 1993). CD11b связывает различные лиганды, такие как молекула внутриклеточной адгезии ICAM-1, фибриноген, коагулянтный фактор Х и компонент C3b инактивированного комплемента (iC3b) (Altieri and Edgington, 1988; Beller et al., 1982; Diamond et al., 1990; Wright et al., 1988).

На основе связывающих свойств CyaA с CD11b/CD18, Европейская заявка на патент ЕР1188446 (Институт Пастера) описывает белковые векторы, содержащие рекомбинантную аденилатциклазу вида Bordetella, для нацеливания представляющей интерес молекулы и, в частности, антигена на дендритные клетки.

Теперь данное изобретение основано на открытии, что один или несколько районов аденилатциклазы Bordetella pertussis, содержащиеся в аминокислотной последовательности, простирающейся от аминокислоты 1166 до аминокислоты 1281 (SEQ ID NO:2) являются решающими для взаимодействия этого токсина с CD11b/CD18. Этот район, необходимый для обеспечения связывающей способности CyaA с CD11b/CD18, может быть дополнительно объединен с другими районами CyaA, действующими в качестве вспомогательных районов.

Это открытие предоставляет возможность получения эффективного и многостороннего вектора доставки молекул, способного нацеливать представляющую интерес молекулу на дендритные клетки. Альтернативно, делеция идентифицированного домена взаимодействия CD11b/CD18- аденилатциклазы может быть использована выгодным образом для конструирования безопасной бесклеточной вакцины для защиты против инфекции Bordetella и, в частности, инфекции Bordetella pertussis.

Данное изобретение обеспечивает также применение идентифицированного домена взаимодействия CD11b/CD18 для получения нейтрализующих антител, способных блокировать взаимодействие нативной аденилатциклазы, продуцируемой инфекционными бактериями, с клеточными рецепторами.

Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение белка, состоящего из аденилатциклазы Bordetella, которая модифицирована в домене взаимодействия CD11b/CD18 делецией, заменой или инсерцией одной или нескольких аминокислот, где указанный белок является дефектным в отношении связывания CD11b/CD18, но является специфически реактивным с антисыворотками, узнающими аденилатциклазу Bordetella дикого типа.

Белок данного изобретения может быть использован в качестве активного начала в вакцине против коклюша. Таким образом, мутация (мутации) в домене взаимодействия CD11b/CD18 предохраняет иммунные клетки от потенциально негативных эффектов, таких как передача сигнала после захватывания интегрина токсоидом, и/или некоторой функциональной интерференции вследствие конкуренции за связывание с CD11b с CyaA-токсоидом, который также служит в качестве рецептора CR3-комплемента.

В данном контексте термин «полипептид» обозначает одну цепь аминокислот, связанных пептидными связями, содержащую по меньшей мере 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 10 аминокислот и более предпочтительно по меньшей мере 50 аминокислот.

Термин «белок» относится к макромолекуле, которая по существу состоит из одного или нескольких полипептидов.

Термин «аденилатциклаза Bordetella» включает в себя, в данном изобретении, кальмодулинзависимую аденилатциклазу, которая природно синтезируется в видах Bordetella и которая является основным фактором вирулентности, обязательным для начальных фаз бактериальной колонизации в легком.

В одном предпочтительном варианте осуществления белок данного изобретения получают модификацией аденилатциклазы Bordetella pertussis, агента коклюша в человеке.

В Bordetella pertussis эта аденилатциклаза синтезируется и секретируется в форме полипептида из 1706 аминокислот (SEQ ID NO:1). Кальмодулинзависимая каталитическая активность локализована в первых 400 аминокислотах, причем этот домен называют далее «N-концевым каталитическим доменом». Как сообщалось ранее, для того чтобы быть активным, указанный аденилатциклазный токсин делают инвазивным и гемолитическим после посттрансляционной модификации посредством коэкспрессии продукта гена CyaC.

Согласно данному изобретению выражение «домен взаимодействия CD11b/CD18» относится к:

а. домену взаимодействия CD11b/CD18 Bordetella pertussis, простирающемуся от аминокислоты 1166 до аминокислоты 1281 аденилатциклазы Bordetella pertussis (SEQ ID NO:2) или

b. домену аденилатциклазы видов Bordetella, соответствующему домену взаимодействия CD11b/CD18 Bordetella pertussis, как идентифицировано сопоставлением последовательности аденилатциклазы указанных видов Bordetella с последовательностью аденилатциклазы Bordetella pertussis с использованием алгоритма для поиска наилучшего локального сопоставления.

Примером алгоритма для поиска наилучшего локального сопоставления является алгоритм BLAST (Altschul et al., 1990).

Домен взаимодействия CD11b/CD18 Bordetella bronchiseptica представлен SEQ ID NO:4.

В данном контексте выражение “дефектный в отношении связывания CD11b/CD18” означает, что белок данного изобретения не конкурирует с аденилатциклазой дикого типа Bordetella за связывание с экспрессирующими CD11b/CD18 α_mβ₂ клетками. «CD11b/CD18 α_mβ₂» или «CD11b/CD18» обозначает клеточный рецептор аденилатциклазы Bordetella (Guermonprez et al., 2001). Примеры анализов связывания для оценки специфического связывания рекомбинантного токсина с экспрессирующими CD11b/CD18 α_mβ₂ клетками описаны в приведенной ниже экспериментальной части. Белок данного изобретения предпочтительно имеет менее чем 50% связывающей аффинности в отношении CD11b/CD18 α_mβ₂, в сравнении с аденилатциклазой Bordetella дикого типа. Наиболее предпочтительно, белок данного изобретения имеет менее чем 10% и более предпочтительно - менее чем 5% анализируемой связывающей аффинности.

В данном контексте выражение “экспрессирующие CD11b-клетки” относится к клеткам, которые экспрессируют CD11b/CD18 α_mβ₂ на их поверхности. В частности, этими клетками являются гранулоциты/нейтрофилы, макрофаги, НК-клетки, субпопуляции CD8⁺ Т-клеток и В-клеток и миелоидные дендритные клетки.

Для обеспечения белка данного изобретения домен взаимодействия CD11b/CD18-аденилатциклазы Bordetella модифицируют инсерцией, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот, причем полученный белок является дефектным в отношении связывания CD11b/CD18.

В одном варианте осуществления данного изобретения домен взаимодействия CD11b/CD18 модифицирован инсерцией в него пептида. Например, последовательность, состоящую из 6-12 остатков, инсертируют в домен взаимодействия CD11b/CD18.

Конкретные варианты осуществления включают в себя аденилатциклазу Bordetella, модифицированную инсерцией между остатками 1166-1167 или между остатками 1281-1282 (число указывает положение этих аминокислот в аденилатциклазе Bordetella pertussis дикого типа) пептида, содержащего 6-12 аминокислот. Примеры инсерций эпитопа FLAG-последовательности в этих положениях описаны в следующей ниже экспериментальной части, и их называют далее CyaA1166/FLAG и CyaA1281/FLAG.

Альтернативно, остатки, которые, как показано, участвуют в связывании CD11b/CD18, могут быть делетированы или заменены нефункциональными остатками.

В одном конкретном варианте осуществления аденилатциклазу Bordetella модифицируют инсерцией, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот в районе, простирающемся от остатка 1208 до 1243 в аденилатциклазе Bordetella pertussis или в соответствующих районах аденилатциклаз других видов Bordetella.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения относятся к белку и включают в себя аденилатциклазу Bordetella pertussis, содержащую делеции одной или нескольких аминокислот или их замену нефункциональными аминокислотами.

В одном предпочтительном варианте осуществления аденилатциклазу Bordetella модифицируют полной делецией домена взаимодействия CD11b/CD18.

Согласно другому конкретному варианту осуществления данного изобретения аденилатциклазу Bordetella pertussis модифицируют делецией аминокислот, простирающихся от положения 1245 до положения 1273, причем эти аминокислоты необязательно заменены нефункциональными аминокислотами, например октапептидом, как приведено в примере экспериментальной части, и этот белок называют далее CyaAΔ1245-1273.

Дополнительно, для гарантии полной безопасности введения в живой организм белка данного изобретения аденилатциклазу Bordetella модифицируют таким образом, что каталитическая активность удаляется. Согласно одному варианту осуществления данного изобретения аденилатциклазу Bordetella дополнительно модифицируют инсерцией, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот в N-концевом каталитическом домене, причем указанная модифицированная аденилатциклаза Bordetella имеет каталитическую активность, которая является уменьшенной в сравнении с каталитической активностью аденилатциклазы Bordetella дикого типа. Предпочтительно эта каталитическая активность составляет менее чем 10% каталитической активности аденилатциклазы Bordetella дикого типа, и более предпочтительно - является незначимой.

Примеры мутантов в N-концевом каталитическом домене описаны в данной области техники (например, в WO 93/21324, Институт Пастера).

Варианты белка данного изобретения включают в себя модифицированную аденилатциклазу вида Bordetella, лишенную по меньшей мере аминокислот 1-300 N-концевого каталитического домена, и предпочтительно лишенную аминокислот 1-373.

Альтернативно, дипептидные инсерции могут быть выполнены в АТФ-связывающий сайт между остатками 188 и 190 аденилатциклазы Bordetella pertussis или соответствующими остатками в аденилатциклазе из других видов Bordetella.

В данном изобретении показано также, что ацилирование аденилатциклазы Bordetella участвует в связывании CD11b/CD18 и последующем перемещении этого токсина в клетку. Таким образом, в одном предпочтительном варианте белка данного изобретения этот белок не является ацилированным. В частности, аденилатциклаза Bordetella дополнительно модифицирована в аминокислотах, которые ацилируются посттрансляционно. Эти аминокислоты соответствуют Lys-983 и Lys-860 аденилатциклазы Bordetella pertussis.

В этом конкретном варианте осуществления этот белок не ацилируется в положении 983 и/или 860 последовательности аденилатциклазы.

В другом варианте осуществления белок данного изобретения является ацилированным.

Белок данного изобретения является предпочтительно иммуногенным, но по существу нетоксичным белком, т.е. белком, который является по меньшей мере дефектным в отношении связывания с рецептором клетки и необязательно в отношении аденилатциклазной активности, но который является все еще специфически узнаваемым антителами против аденилатциклазного токсина.

Данное изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей определенный выше белок, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Согласно одному варианту осуществления указанная композиция является вакциной, подходящей для применения человеку или животному. Эта вакцина предпочтительно способна индуцировать иммунитет против коклюша. Такая вакцина содержит иммунопротективное и нетоксичное количество белка данного изобретения. Указанная композиция может дополнительно содержать один или несколько подходящих праймирующих адъювантов, соответственно. Другие антигены, о которых известно, что их желательно вводить в конъюгации с белком данного изобретения, могут быть также включены в вакцину данного изобретения. Такие дополнительные компоненты включают в себя другой известный защитный антиген Bordetella, столбнячного токсоида и/или дифтерийного токсоида.

Разумеется, данное изобретение относится также к способу иммунизации человека или животного против инфекции Bordetella и/или симптомов, ассоциированных с заболеванием, вызываемым инфекцией Bordetella, предусматривающему введение вакцины данного изобретения такому человеку или животному.

Способ введения вакцины данного изобретения может быть любым подходящим способом, который доставляет иммунопротективное количество белка данного изобретения хозяину. Однако эту вакцину вводят предпочтительно парентерально с использованием внутримышечного или подкожного способа введения. Другие способы введения также могут быть использованы, когда это желательно, такие как пероральное введение или введение посредством других парентеральных способов, т.е. интрадермально, через нос или внутривенно.

Другой аспект данного изобретения относится к применению белка данного изобретения в приготовлении лекарственного средства для лечения у человека или у животного симптомов заболевания, ассоциированных с коклюшем, и/или для защиты человека или животного от симптомов заболевания, ассоциированных с инфекцией Bordetella.

Разумеется, данное изобретение относится дополнительно к способу лечения человека или животного от инфекции Bordetella и/или симптомов, ассоциированных с заболеванием, вызываемым инфекцией Bordetella, предусматривающему введение лекарственного средства данного изобретения такому человеку или животному.

Другим аспектом данного изобретения является полипептид, способный связываться с интегрином CD11b/CD18, причем указанный полипептид является

а. фрагментом аденилатциклазы Bordetella, имеющим 30-500 аминокислот, предпочтительно 50-300 и более предпочтительно - 50-150 аминокислот, причем указанный фрагмент содержит домен взаимодействия CD11b/CD18 указанной аденилатциклазы Bordetella или содержит фрагмент указанного домена взаимодействия CD11b/CD18 дикого типа, достаточный для сохранения способности связывания с CD11b/CD18, или

b. вариантом указанного фрагмента, имеющим по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичность и более предпочтительно - по меньшей мере 90% идентичность с указанным фрагментом, причем указанный вариант сохраняет способность связывания CD11b/CD18.

Аденилатциклаза Bordetella выбрана предпочтительно из аденилатциклаз Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica и более предпочтительно является Bordetella pertussis.

Полипептиды данного изобретения будут выбраны из полипептидов, которые принимают подходящую конформацию для связывания с CD11b/CD18.

В конкретных вариантах осуществления полипептиды данного изобретения могут содержать другие вспомогательные районы аденилатциклазы Bordetella, которые участвуют в оптимальном связывании с CD11b/CD18. Эти районы включают в себя, более конкретно, аминокислотные последовательности, содержащие район, простирающийся от аминокислоты 1416 до аминокислоты 1648.

В одном предпочтительном варианте полипептидом данного изобретения является вариант, определенный выше в b., состоящий из одного или нескольких фрагментов из 10-50 аминокислот домена взаимодействия CD11b/CD18. Например, в одном предпочтительном варианте осуществления указанный полипептид содержит по меньшей мере фрагменты из 10-50 аминокислот района аденилатциклазы B.pertussis, простирающегося от аминокислоты 1208 до аминокислоты 1243 аденилатциклазы B.pertussis.

Процентная идентичность соответствует проценту аминокислот вариантной последовательности, которые являются идентичными последовательности дикого типа при сопоставлении с использованием алгоритма BLAST. Выражение «сохраняет способность связывания с CD11b/CD18» означает, что этот вариант сохраняет по меньшей мере 80% связывающей аффинности в отношении CD11b/CD18 в сравнении с соответствующим фрагментом дикого типа, с которым он мог быть сопоставлен, и предпочтительно по меньшей мере 90% связывающей аффинности в отношении CD11b/CD18.

Согласно одному предпочтительному варианту осуществления указанный полипептид является специфически реактивным с антисыворотками, узнающими аденилатциклазу дикого типа Bordetella, предпочтительно аденилатциклазу Bordetella pertussis. Более предпочтительно, указанный полипептид способен, при введении млекопитающему, индуцировать антитела, специфически узнающие аденилатциклазу Bordetella.

В одном конкретном варианте осуществления указанный полипептид является фрагментом аденилатциклазы Bordetella pertussis. В другом конкретном варианте осуществления указанный полипептид по существу состоит из домена взаимодействия CD11b/CD18 и, более конкретно, домена взаимодействия CD11b/CD18 B.pertussis, простирающегося от аминокислоты 1166 до аминокислоты 1281 аденилатциклазы B.pertussis (SEQ ID NO:2).

В других конкретных вариантах осуществления указанный полипептид дополнительно содержит домен ацилирования аденилатциклазы Bordetella и/или гидрофобный домен. Указанные домены ацилирования включены в соответствующие районы, простирающиеся от остатка 700 до остатка 1000 SEQ ID NO:1, как описано в WO 93/21324, и содержат Lys 983 и/или Lys 860. Гидрофобный домен соответствует району, простирающемуся от остатка 500 до остатка 700 SEQ ID NO:1.

Предпочтительно, указанный полипептид не является токсичным при введении in vivo млекопитающему.

Полипептиды данного изобретения конкурируют за связывание интегрина CD11b/CD18 с аденилатциклазой дикого типа.

Таким образом, данное изобретение относится к применению определенного выше полипептида в приготовлении вакцины или лекарственного средства для предупреждения или лечения, в человеке или в животном, симптомов заболевания, ассоциированных с коклюшем, и/или для защиты человека или животного от заболевания, ассоциированного с инфекцией Bordetella.

Более конкретно, данное изобретение относится к применению указанного полипептида данного изобретения для генерирования защитных антител против инфекции Bordetella.

Уже сообщалось, что аденилатциклаза является эффективным вектором доставки молекул, способным нацеливать различные антигены на дендритные клетки, приводя, в частности, к генерированию сильных CD4⁺, а также CD8⁺ Т-клеточных реакций (ЕР1188446, Институт Пастера).

Данное изобретение относится также к применению полипептидов данного изобретения в получении вектора для нацеливания представляющей интерес молекулы, в частности, на экспрессирующие CD11b-клетки.

Термин “специфически” обозначает в контексте данного изобретения, что этот полипептид при использовании в качестве вектора для представляющей интерес молекулы направляется преимущественно на экспрессирующие CD11b-клетки в соответствии с высокой аффинностью связывания домена взаимодействия CD11b/CD18 с CD11b/CD18, обеспечивая тем самым средство для нацеливания представляющей интерес молекулы на поверхность указанных клеток или в указанные клетки селективным образом относительно других клеток.

В частности, в одном варианте осуществления нацеливание указанной молекулы или пептида является эффективным in vivo. В других вариантах осуществления нацеливание указанной молекулы является эффективным in vitro или ex vivo. Под “in vitro” имеют в виду, что клетки-мишени являются клетками, которые культивируют in vitro. Под “ex vivo” имеют в виду, что клетки-мишени являются клетками, которые были экстрагированы из живого организма, культивируются in vitro и предназначены для повторного введения в живой организм.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает средство, подходящее для создания композиций, подходящих для введения животному- или человеку-хозяину, требующих нацеливания на определенные лейкоциты и, в частности, на миелоидные дендритные клетки, нейтрофилы или макрофаги.

Данное изобретение, более конкретно, относится к вектору для нацеливания представляющей интерес молекулы на экспрессирующие CD11b-клетки, характеризующемуся тем, что указанный вектор содержит полипептид, способный связываться с CD11b/CD18, определенный выше, связанный с указанной представляющей интерес молекулой.

Данное изобретение относится также к способу для нацеливания in vitro представляющей интерес молекулы на экспрессирующие CD11b-клетки, предусматривающему:

а. обеспечение экспрессирующих CD11b-клеток, экстрагированных из живого организма,

b. культивирование указанных экспрессирующих CD11b-клеток с вектором данного изобретения при условиях, подходящих для нацеливания указанного вектора на указанные экспрессирующие CD11b-клетки.

Данное изобретение относится также к экспрессирующим CD11b-клеткам, содержащим представляющую интерес молекулу, получаемым описанным выше способом.

Согласно данному изобретению выражение «представляющая интерес молекула» относится к любой молекуле, предпочтительно к молекуле, которая не является фрагментом аденилатциклазы вида Bordetella.

Представляющие интерес молекулы могут быть также выбраны из нуклеиновых кислот, таких как ДНК, РНК, олигонуклеотиды, антисмысловая ДНК, плазмиды и космиды. Они могут быть также выбраны из пептидов или полипептидов и, в частности, ферментов, коферментов, лигандов рецепторов, гаптенов, антигенов, антител и их фрагментов. Разумеется, специалист в данной области выберет подходящую молекулу в зависимости от желаемого использования.

Представляющие интерес молекулы могут быть выбраны из активного (действующего) начала лекарственного средства, иммунотоксинов, антиоксидантов, антибиотиков, факторов роста, внутриклеточных гормонов, цитокинов, токсинов, нейромедиаторов, антимикробных агентов, в частности антивирусных, антибактериальных, антипаразитарных или противоопухолевых агентов, и, в более общем виде, из любых терапевтических или профилактических представляющих интерес агентов.

В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления представляющая интерес молекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, гликопептидов, липопептидов, полисахаридов, олигосахаридов, нуклеиновых кислот, липидов и химических веществ.

В конкретных вариантах осуществления представляющей интерес молекулой является гетерологичный антиген или эпитоп, причем термин «гетерологичный» относится к антигену или эпитопу, другому, чем антигенная детерминанта аденилатциклазы, содержащаяся в самом векторе.

Представляющую интерес молекулу связывают с полипептидом данного изобретения с получением вектора данного изобретения.

В данном контексте термин «связанный» обозначает любое взаимодействие, делающее возможным физическую ассоциацию представляющей интерес молекулы и данного полипептида. Предпочтительно, это связывание является ковалентным. Оно может быть прямым ковалентным связыванием или непрямым связыванием, использующим связывающий (линкерный) агент для образования конъюгата. Способы химического связывания хорошо известны в данной области. Химическая связь может быть выбрана, например, из малеимидной, пептидной, дисульфидной или тиоэфирной связи. Например, может быть использована дисульфидная связь, использующая N-пиридилсульфонилактивированный сульфгидрил.

Один конкретный способ состоит в добавлении линкера к полипептиду, причем указанный линкер состоит по меньшей мере из одного цистеина, который может быть легко использован для дисульфидной связи. Другой подход состоит в связывании химически биотинильной части молекулы, которая делает возможным связывание других молекул, ассоциированных со стрептавидином.

Множественные молекулы могут быть химически связаны с полипептидом данного изобретения посредством дисульфидной связи с различными остатками цистеина при условии, что это связывание не препятствует взаимодействию с CD11b/CD18.

Кроме того, функциональные свойства экспрессирующих CD11b-клеток определяют применение указанных полипептидов данного изобретения в приготовлении белкового вектора для нацеливания лекарственного средства на эти конкретные клетки. В этом контексте в одном конкретном варианте осуществления, так называемой представляющей интерес молекулой, является активное (действующее) начало лекарственного средства. Указанное активное начало может быть связано химически или генетически с полипептидом данного изобретения. Предпочтительно, представляющей интерес молекулой является противовоспалительное лекарственное средство, которое при связывании с аденилатциклазным токсином направляется специфически к поверхности клеток, участвующих в воспалительной реакции, таких как нейтрофилы.

Поскольку экспрессирующие CD11b-клетки и, более конкретно, миелоидные дендритные клетки, нейтрофилы и макрофаги участвуют в существенных функциях системы иммунной и природной защиты, в частности в воспалительных и специфических иммунных реакциях, в предпочтительном варианте осуществления данного изобретения вектор данного изобретения конструируют, более конкретно, для праймирования реакции CD4⁺- и CD8⁺-клеток, причем указанная реакция следует за нацеливанием представляющей интерес молекулы на экспрессирующие CD11b-клетки, в частности миелоидные дендритные клетки.

В данном контексте представляющая интерес молекула является предпочтительно эпитопом или антигеном или содержит эпитоп или антиген. Более конкретно, представляющая интерес молекула может быть, в частности, антигеном, выбранным из группы, состоящей из антигена полиовируса, антигена вируса ВИЧ, антигена вируса гриппа, вируса лимфоцитарного хориоменингита, эпитопа, антигена папилломавируса человека (HPV), бактериального антигена, например, антигена Mycobacterium tuberculosis.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает средство для праймирования реакции CD4⁺- и CD8⁺-клеток в пациенте, либо нацеливанием in vivo антигена или эпитопа на экспрессирующие CD11b-клетки, либо нацеливанием ex vivo антигена или эпитопа на экстрагированные экспрессирующие CD11b-клетки и повторным введением полученных клеток указанному пациенту.

Таким образом, данное изобретение относится к способу нацеливания in vitro антигена или эпитопа на экспрессирующие CD11b-клетки, предусматривающему

а. обеспечение экспрессирующих CD11b-клеток, экстрагированных из живого организма, и

b. культивирование указанных экспрессирующих CD11b-клеток с вектором данного изобретения, несущим антиген или эпитоп в качестве представляющей интерес молекулы, при подходящих условиях для нацеливания этого вектора на указанные экспрессирующие CD11b-клетки.

Предпочтительно, экспрессирующими CD11b-клетками, экстрагированными из живого организма, являются миелоидные дендритные клетки.

Данное изобретение обеспечивает также экспрессирующие CD11b-клетки, содержащие гетерологичный антиген или эпитоп, получаемые описанным выше способом.

Таким образом, данное изобретение относится к продукту клеточной терапии для иммунизации человека или животного против антигена, характеризующемуся тем, что он содержит эффективное количество экспрессирующих CD11b-клеток, содержащих гетерологичный антиген или эпитоп, получаемых описанным выше способом, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Далее, данное изобретение относится к применению экспрессирующих CD11b-клеток, содержащих указанный антиген или эпитоп, получаемых описанным выше способом, в получении продукта клеточной терапии для иммунизации человека или животного против антигена.

Более конкретно, данное изобретение относится к способу иммунизации пациента против антигена, предусматривающему

а. экстрагирование экспрессирующих CD11b-клеток из указанного пациента,

b. культивирование in vitro указанных экспрессирующих CD11b-клеток с вектором данного изобретения, несущим антиген или эпитоп в качестве представляющей интерес молекулы, при условиях, подходящих для нацеливания указанного вектора на указанные клетки,

с. повторное введение эффективного количества указанных клеток, содержащих указанный вектор, указанному пациенту для праймирования CD4⁺ и/или CD8⁺ реакции,

для иммунизации посредством этого указанного пациента относительно указанного антигена.

Согласно предпочтительному варианту осуществления данного изобретения указанными экспрессирующими CD11b-клетками являются миелоидные дендритные клетки.

Таким образом, данное изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей вектор данного изобретения, несущий эпитоп или антиген в качестве представляющей интерес молекулы, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Согласно одному варианту осуществления указанной композицией является вакцина, пригодная для введения человеку или животному. Предпочтительно, эта вакцина способна индуцировать иммунитет против полиовируса, ВИЧ или вируса лимфоцитарного хориоменингита. Конечно, тип индуцированного иммунитета будет зависеть от выбранного антигена, который переносится данным вектором. В другом варианте осуществления эта вакцина способна индуцировать иммунитет против коклюша.

Такие вакцины содержат иммунопротективное и нетоксичное количество вектора данного изобретения. Указанная композиция может дополнительно содержать подходящие праймирующие адъюванты, соответственно.

Данное изобретение относится также к способу иммунизации человека