Выделенное антитело против специфического мембранного антигена простаты (psma) и способ ингибирования роста клеток, экспрессирующих psma

Выделенное антитело против специфического мембранного антигена простаты (psma) и способ ингибирования роста клеток, экспрессирующих psma

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к дефукозилированным антителам к PSMA человека с усиленной способностью направлять клеточную цитотоксичность по отношению к экспрессирующим PSMA клеткам. Изобретение также направлено на клетки-хозяева, экспрессирующие анти-PSMA антитела без фукозильных остатков. Предлагаются также способы применения антител изобретения для ингибирования роста клеток, экспрессирующих PSMA, и ингибирования роста опухолевых клеток с экспрессией PSMA при различных раковых заболеваниях.

Уровень техники

Заболеваемость раком простаты у мужчин занимает лидирующую позицию и является одной из основных причин их смертности. Традиционные методы лечения включают в себя хирургические операции, гормоно- и химиотерапию, а также лучевую терапию. Однако эти методы малоэффективны в случае развития метастаз. Поэтому очень важна идентификация генов и/или их продуктов, представляющих собой диагностические и прогностические маркеры заболевания, а также являющихся мишенями при терапии. Простатоспецифический антиген (PSA) является одним из таких маркеров и используется при клинической диагностике и определении стадии развития опухоли при раке простаты. Однако PSA не дает возможности дифференцировать доброкачественную гиперплазию простаты (ВРН) от простатита и рака простаты в диапазоне 4-10 нг/мл, что требует проведения дополнительных цитологических и/или гистологических исследований для установления точного диагноза (Barren, R.J. et al. (1998) Prostate 36:181-188).

Простатоспецифический мембранный антиген (PSMA) - это трансмембранный гликопротеин II типа массой примерно 110 kD, состоящий из 750 аминокислотных остатков и имеющий примерно 54% гомологии с рецептором трансферрина. PSMA имеет три структурных домена: внутриклеточный - 19 аминокислотных остатков, трансмембранный - 24 аминокислотных остатка и наружный - 707 аминокислотных остатков. PSMA обладает нейрокарбоксипептидазной и фолатгидролазной активностью и, как сообщается, участвует в нейроэндокринной регуляции роста и дифференциации клеток простаты (Heston, W.D. (1996) Urologe-Ausgabe A. 35:400-407). PSM' - это локализованный в цитоплазме белок, полученный в результате альтернативного сплайсинга PSMA.

PSMA преимущественно экспрессируется эпителиальными клетками простаты. Уровень его экспрессии возрастает при раке простаты, особенно в слабодифференцированных, метастатических и резистентных к гормональной терапии карциномах (Gregorakis, А.К. et al. (1998) Seminars in Urologic Oncology 16:2-12; Silver, D.A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85). В тканях вне простаты, например в тонком кишечнике, слюнной железе, слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки, проксимальных почечных канальцах и тканях мозга, наблюдается низкий уровень экспрессии PSMA (Silver, D.A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85). PSMA также экспрессируется эндотелиальными клетками капилляров в околоопухолевой области и внутри опухоли определенной степени злокачественности, в том числе в клетках почечной карциномы и карциномы толстой кишки, но не экспрессируется в кровеносных сосудах нормальных тканей. Сообщалось, что PSMA участвует в ангиогенезе опухолей (Silver, D.A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85).

Описаны антитела против внеклеточного (наружного) домена PSMA (См., например, Liu, H. et al. (1997) Cancer Res. 57:3629-3634; Murphy, G.P. et al. (1998) J. Urol. 160:2396-2401; Wang, S. et al. (2001) Int. J. Cancer 92:871-876; Kato, K. et al. (2003) Int. J. Urol. 10:439-444; US Patent No. 6,150,508 and US Patent No. 6,107,090). Недавно получены антитела против человеческого и гуманизированного PSMA (См., например, Bander, N.H. et al. (2003) Semin. Oncol. 30:667-676; PCT Publication WO 02/098897; PCT Publication WO 01/09192; PCT Publication WO 03/064606; PCT Publication WO 03/034903; and US Application No. 2004/0033229). Эти антитела используются для окрашивания клеток рака простаты. (См., например, Yao, D. et al. (2002) Semin. Urol. Oncol. 20:211-218; Bander, N.H. et al. (2003) J. Urol. 170:1717-1721). Антитела против PSMA используются также при терапевтическом лечении рака простаты, обычно в виде конъюгата с хемотерапевтическими агентами или радиоактивными изотопами. (См., например, Nanus, D.M. et al. (2003) J. Urol. 170:S84-89; Milowsky, M.I. et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:2522-2531; Henry, M.D. et al. (2004) Cancer Res. 64:7995-8001).

В настоящее время ощущается потребность в улучшенных антителах против PSMA, которые могут быть использованы при терапии и эффективны при лечении и/или предотвращении заболевания, включая экспрессию PSMA. Особенно это касается антител, обладающих цитотоксическим эффектом без конъюгации с хемотерапевтическими агентами или радиоактивными изотопами.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение направлено на изолированные дефукозилированные антитела (то есть на антитела без остатков фукозы), которые связываются с человеческим PSMA и демонстрируют улучшенную опосредованную (направляемую) антителами клеточную цитотоксичность (ADCC) по отношению к клеткам, экспрессирующим PSMA, по сравнению с недефукозилированной формой антител (то есть с антителами, содержащими остатки фукозы). Изобретение направлено также на методы лечения разнообразных заболеваний, при которых наблюдается экспрессия PSMA, с использованием антител и композиций настоящего изобретения.

Дефукозилированные антитела настоящего изобретения связываются с PSMA и ингибируют рост клеток, экспрессирующих PSMA, усиливая опосредуемую антителами клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии человеческих клеток-эффекторов (например, моноцитов или моноядерных клеток), по сравнению с фукозилированной формой антител. Таким образам, антитела настоящего изобретения обеспечивают лучшую эффективность при лечении заболеваний, характеризующихся экспрессией PSMA.

В соответствии с одним из аспектов изобретение направлено на изолированные антитела против простатоспецифического мембранного антигена, не имеющие фукозильных остатков. Предпочтительно, чтобы антитела усиливали зависящую от антител клеточную цитотоксичность по отношению к клеткам, экспрессирующим РSМА на поверхности, по сравнению с формой антигена, содержащего остатки фукозы. В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, антитела без фукозильных остатков имеют значения EC₅₀ ADCC активности против клеток рака простаты LNCaP 0,05 мкг/мл или меньше, или 0,04 мкг/мл или меньше, или 0,03 мкг/мл или меньше, или 0,02 мкг/мл или около 0,018 мкг/мл или меньше. В соответствии с другим предпочтительным аспектом изобретения антитела без фукозильных остатков характеризуются значениями ЕС₅₀ ADCC активности против клеток рака простаты LNCaP, которые, по крайней мере, в 3 раза ниже (или, по крайней мере, в 4 раза ниже, или в 5 раз ниже, или в 6 раз ниже), чем те же значения для антител, имеющих фукозильные остатки.

Предпочтительно, если дефукозилированные антитела настоящего изобретения представляют собой моноклональные антитела. В соответствии с одним из аспектов изобретение направлено на гуманизированные или химерные моноклональные антитела. Предпочтительно, если гуманизированные или химерные антитела получают из антител мыши против PSMA, выбранных из следующей группы: 3F5.4G6, 3D7.1.1, 4Е10-1.14, 3Е11, 4D8, 3Е6, 3С9, 2С7, 1G3, 3С4, 3С6, 4D4, 1G9, 5С8В9, 3G6, 4С8В9, Е99, J415, J533 и J591. В соответствии с другим аспектом изобретение направлено на человеческие моноклональные антитела.

В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения человеческое моноклональное антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи человека и вариабельный участок легкой цепи человека, где:

(а) вариабельный участок тяжелой цепи человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-9; и

(b) вариабельный участок легкой цепи человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 10-18.

В соответствии с различными аспектами изобретения следующие комбинации тяжелых и легких цепей являются предпочтительными:

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

В соответствии с другим аспектом изобретения моноклональное антитело содержит:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 19-27;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 28-36;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 37-45;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 46-54;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 55-63; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 64-72.

В различных аспектах настоящего изобретения следующие комбинации тяжелой цепи и легкой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 являются предпочтительными:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 19;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 28;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 37;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 46;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 55; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 64;

или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 20;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 29;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 38;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 47;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 56; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 65;

или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 21;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 30;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 39;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 48;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 57; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 66;

или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 22;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 31;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 40;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 49;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 58; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 67; или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 23;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 32;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 41;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 50;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 59; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 68; или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 24;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 33;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 42;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 51;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 60; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 69; или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 25;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 34;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 43;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 52;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 61; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 70; или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 26;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 35;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 44;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 53;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 62; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 71; или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 27;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 36;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 45;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 54;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 63; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 72.

В соответствии с еще одним аспектом изобретение направлено на дефукозилированные человеческие анти-PSMA антитела, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт или производное гена человека V_H 5-51 или V_H 3-30.3. Изобретение также направлено на дефукозилированные анти-PSMA антитела человека, содержащие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт или производное гена человека V_k L6, 04/014 или L18. Кроме того, изобретение направлено на дефукозилированные человеческие антитела против PSMA, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт или производное гена человека V_H 5-51 или V_H 3-30.3, и вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт или производное гена человека V_k L6, 04/014 или L18.

В соответствии с еще одним аспектом изобретение направлено на химерных цыплят, содержащих гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, кодирующие анти-PSMA антитела, такие как анти-PSMA антитела, экспрессированные в зародышах химерных цыплят, где эти антитела не содержат фукозильных остатков. Предпочтительно, гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов являются генами тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов человека.

В соответствии с еще одним аспектом изобретение направлено на клетку-хозяин, содержащую гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, кодирующие анти-PSMA антитела, где указанная клетка не содержит фукозилтрансферазу, так что экспрессируемые указанной клеткой анти-PSMA антитела не содержат остатков фукозы. Предпочтительно, чтобы гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина представляли собой гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека. Предпочтительно, если фукозилтрансфераза - это FUT8. Предпочтительно, чтобы клетка-хозяин относилась к линии СНО.

В соответствии с еще одним аспектом изобретение направлено на метод ингибирования роста клеток PSMA+. Метод включает приведение клеток в контакт с дефукозилированными антителами против PSMA в условиях, достаточных для индукции зависящей от антител клеточной цитотоксичности (ADCC) указанных клеток. Клетки могут быть, например, опухолевыми клетками. Предпочтительно, чтобы анти-PSMA антитела представляли собой антитела человека.

Изобретение направлено также на метод ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, где эти опухолевые клетки или эндотелиальные клетки сосудов, расположенных поблизости от опухоли, экспрессируют PSMA. Указанный метод включает назначение субъекту дефукозилированных анти-РSМА антител в количестве, эффективном для ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта. Предпочтительно, чтобы анти-PSMA антитела представляли собой антитела человека. В соответствии с предпочтительными аспектами опухолевые клетки представляют собой опухолевые клетки карциномы простаты.

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из следующего далее подробного описания и примеров, которые не ограничивают область изобретения. Содержание всех ссылок, записей генетического банка (Genbank), патентов и опубликованных патентных заявок, процитированных в настоящей заявке, явным образом включены в нее по ссылке.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 4А3, 7F12, 8С12, 8А11 и 16F9 (SEQ ID NOs: 1-5, соответственно) в соответствие (выравнивание) с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_H 5-51 (SEQ ID NO: 73).

На Фиг.2 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи 4А3, 7F12 и 8С12 (SEQ ID NOs: 10-12, соответственно) в соответствие с аминокислотной последовательности зародышевой линии человека V_k L6 (SEQ ID NO: 74).

На Фиг.3 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи 8А11 и 16F9 (SEQ ID NOs: 13 и 14, соответственно) в соответствие с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_k 04/014 (SEQ ID NO: 75).

На Фиг.4 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 78) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 9) вариабельного участка тяжелой цепи 1С3 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 27), CDR2 (SEQ ID NO: 36) и CDR3 (SEQ ID NO: 45) и указаны отклонения от зародышевых линий V, D и J.

На Фиг.5 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 82) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 18) вариабельного участка легкой цепи 1С3 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 54), CDR2 (SEQ ID NO: 63) и CDR3 (SEQ ID NO: 72) и указаны отклонения от зародышевых линий V и J.

На Фиг.6 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 79) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 6) вариабельного участка тяжелой цепи 2А10 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 24), CDR2 (SEQ ID NO: 33) и CDR3 (SEQ ID NO: 42) и указаны отклонения от зародышевых линий V и J.

На Фиг.7 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 83) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 15) вариабельного участка легкой цепи 2А10 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 51), CDR2 (SEQ ID NO: 60) и CDR3 (SEQ ID NO: 69) и указаны отклонения от зародышевых линий V и J.

На Фиг.8 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 80) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 7) вариабельного участка тяжелой цепи 2С6 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 34) и CDR3 (SEQ ID NO: 43) и указаны отклонения от зародышевых линий V, D и J.

На Фиг.9 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 84) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 16) вариабельного участка легкой цепи 2С6 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 52), CDR2 (SEQ ID NO: 61) и CDR3 (SEQ ID NO: 70) и указаны отклонения от зародышевых линий V и J.

На Фиг.10 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 81) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 8) вариабельного участка тяжелой цепи 2F5 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 26), CDR2 (SEQ ID NO: 35) и CDR3 (SEQ ID NO: 44) и указаны отклонения от зародышевых линий V, D и J.

На Фиг.11 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 85) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 17) вариабельного участка легкой цепи 2F5 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 53), CDR2 (SEQ ID NO: 62) и CDR3 (SEQ ID NO: 71) и указаны зародышевые отклонения V и J.

На Фиг.12 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 2А10, 2С6 и 2F5 (SEQ ID NOs: 6-8, соответственно) в соответствие с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_H 5-51 (SEQ ID NO: 73).

На Фиг.13 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 1С3 (SEQ ID NO: 9) в соответствие с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_H 3-30.3 (SEQ ID NO: 76) и аминокислотной последовательностью зародышевой лини JH6b (SEQ ID NO: 86).

На Фиг.14 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи 2С6 (SEQ ID NO: 16) в соответствие с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_k L6 (SEQ ID NO: 74) и аминокислотной последовательностью зародышевой линии JK3 (SEQ ID NO: 87).

На Фиг.15 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи 1С3, 2А10 и 2F5 (SEQ ID NOs: 18, 15 и 17, соответственно) в соответствие с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_k L18 (SEQ ID NO: 77) и аминокислотной последовательностью зародышевой линии JK4 (SEQ ID NO: 88).

На Фиг.16 показана диаграмма векторов экспрессии Ov7.5 и Ov15. Указаны положения регуляторных последовательностей 5' и 3' векторов Ov. В 3'-конец вектора включена кассета, содержащая EGFP и пиромицин (Puro), которая управляется промотором (Сх), функционирующим в клетках всех типов и облегчающим выделение стабильно трансфектированных линий клеток cES и идентификацию вклада клеток cES в химеры. Подробно МАb-кассета проиллюстрирована в нижней части диаграммы. Тонкая черная линия соответствует последовательностям интронов и нетранслируемым последовательностям, производным от цепей L и Н человека (хотя последовательности интронов не представлены в конструкте Ov15Mab7F12). SiG_VL: последовательность сигнального пептида L-цепи; VL: последовательность гена V L-цепи; Ск: последовательность постоянного участка Каппа L-цепи; IRES: внутренняя рибосомальная последовательность ввода; SiG_VH: последовательность сигнального пептида Н-цепи; VH: последовательность гена V Н-цепи; СН1, Н, СН2 и СН3: кодирующие последовательности доменов СН1, Hinge(шарнира), СН2 и СН3 гамма 1 Н-цепи.

На Фиг.17 и 18 собраны структуры олигосахаридных цепей анти-PSMA антител 7F12, экспрессированные в зародышах цыпленка. Определение проводилось на масс-спектрометре MALDI TOF. Темными кружками отмечена манноза, светлыми кружками - гексозы (манноза или галактоза), темными квадратами - N-ацетилглюкозамин. Вертикальная линия указывает, что последняя гексоза может быть связана с или маннозой, или с N-ацетилглюкозаминовыми остатками вдоль линии.

Фиг.19, 20 представляют собой графики, показывающие результаты измерения ADCC с использованием экспрессируемого клетками СНО антитела 7F12 и экспрессированного организмом цыплят 7F12, по сравнению с изотипическим контролем. Результаты выражены в процентах лизиса.

На Фиг.19 представлены результаты, полученные с использованием IL-2 стимулированных эффекторных клеток.

На Фиг.20 представлены результаты, полученные с использованием свежевыделенных эффекторных клеток периферической крови человека.

На Фиг.21 представлена столбиковая диаграмма, показывающая результаты экспериментов, где ADCC активность экспрессируемых клетками СНО антител 7F12 и экспрессированных организмом цыплят 7F12 была блокирована антителами против CD16, по сравнению с изотипным контролем.

На Фиг.22 и 23 представлен график, показывающий результаты ADCC-анализов фукозилированной и дефукозилированной форм 2А10 mAb ("дефукозилированная") и 2А10 mAb ("родительская") и изотипного контроля.

На Фиг.22 и 23 представлены два независимых эксперимента с использованием клеток-мишеней LNCaP-C42b и стимулированных IL-2 эффекторных клеток.

На Фиг.24 представлены результаты, полученные с использованием клеток LNCaP-C42b и свежевыделенных эффекторных клеток периферической крови человека.

Фиг.25 представляет собой столбиковую диаграмму с результатами анализов ADCC активности для дефукозилированной и фукозилированной форм антител 2А10 mAb ("дефукозилированная") и 2А10 mAb ("родительская") по сравнению с изотипическим контролем и контролем в отсутствие антител, причем в этих анализах ADCC активность была блокирована анти-CD16 антителами.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение направлено на усовершенствованные композиции антител и основанные на их использовании улучшенные методы терапии для лечения и диагностики спектра заболеваний, ассоциированных с экспрессией PSMA и/или клетками, экспрессирующими PSMA. Антитела настоящего изобретения не содержат фукозильных остатков на своих углеводных цепях. Более того, антитела демонстрируют улучшенную направляемую антителами клеточную цитотоксичность (ADCC), связанную с уничтожением клеток PSMA+.

В соответствии с конкретными аспектами антитела настоящего изобретения представляют собой гуманизированные или полностью человеческие антитела и особенно полезны для терапевтического лечения заболеваний людей, связанных с РSМА-экспрессирующими клетками. Методы применения анти-PSMA антител без фукозильных остатков для терапевтического лечения (то есть для лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с экспрессией PSMA) также охватываются настоящим изобретением.

Чтобы лучше понять настоящее изобретение, необходимо определить некоторые термины. Это сделано далее. В ходе подробного описания будут введены также дополнительные определения.

Термины "простатоспецифический мембранный антиген" и "PSMA" используются здесь взаимозаменяемо и включают любые варианты, изоформы и межвидовые гомологи человеческого PSMA, естественно экспрессирующиеся клетками и связывающиеся с описанными здесь антителами 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3. Выданный Генбанком номер полной аминокислотной последовательности человеческого белка PSMA - это NP_004467. Полная последовательность кДНК, кодирующая человеческий белок PSMA, получила номер Генбанка NM_004476.

В настоящем изобретении термины "антитела без остатков фукозы" и "дефукозилированные антитела" используются взаимозаменяемо и означают антитела, углеводные фрагменты которых не содержат фукозильных остатков или у которых фукозильные остатки были удалены. Антитела без фукозильных остатков можно получить, например, экспрессией антитела в клетке или системе экспрессии, которая не прикрепляет фукозильные остатки к углеводной цепи антитела или минимизирует прикрепление, или путем химической модификации антитела, удаляющей фукозильные остатки с углеводной цепи (например, обработкой антитела фукозидазой). Термины "без остатков фукозы" и "дефукозилированные" не ограничены механизмами получения антител с измененной структурой углеводов.

В настоящем изобретении термины "антитела, экспрессирующие остатки фукозы" и "фукозилированные антитела" используются взаимозаменяемо и означают антитела, углеводные фрагменты которых содержат фукозу.

Термин "иммунный ответ" означает действие, например, лимфоцитов, антиген представляющих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, образующихся в упомянутых выше клетках или в печени (включая антитела, цитокины и комплемент), которое приводит к селективному повреждению, разрушению или выведению из человеческого организма внешних патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случае аутоиммунного заболевания или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей.

В настоящем изобретении термин "эффекторные клетки" означает иммунные клетки, вовлеченные в эффекторную фазу иммунного ответа, а не в когнитивную фазу или фазу активации иммунного ответа. Примеры иммунных клеток включают клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например лимфоциты (например, В- и Т-клетки, в том числе цитолитические Т-клетки (CTL)), клетки-киллеры, клетки-природные киллеры, макрофаги, моноциты, эозинофилы, нейтрофилы, полиморфоядерные клетки, гранулоциты, тучные клетки и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические рецепторы Fc и выполняют специфические иммунные функции. В соответствии с предпочтительными аспектами эффекторная клетка способна индуцировать зависящую от антител опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC), например, такой способностью обладают нейтрофилы. Например, экспрессирующие FcR моноциты и макрофаги принимают участие в специфическом уничтожении клеток-мишеней и представлении антигенов другим компонентам иммунной системы или в связывании с клетками, которые представляют антигены. В соответствии с другими аспектами эффекторная клетка может фагоцитировать антиген-мишень или клетку-мишень. Экспрессия конкретного FcR эффекторной клеткой может регулироваться гуморальными факторами, такими как цитокины. Например, показано, что экспрессия FcαRI усиливается под действием G-CSF или GM-CSF. Такая усиленная экспрессия усиливает эффекторную функцию клеток-носителей FcαRI по отношению к мишеням. Эффекторная клетка может фагоцитировать или лизировать антиген-мишень или клетку-мишень.

"Клетка-мишень" или "целевая клетка" означает любую клетку или патоген, чье уничтожение было бы благоприятно для субъекта (например, человека или животного), и на которое может быть направлена композиция (например, антитела) настоящего изобретения. Например, клеткой-мишенью может быть клетка, экспрессирующая или сверхэкспрессирующая PSMA.

Термин "зависящая от антитела клеточная цитотоксичность" или "ADCC" означает опосредуемую клетками цитотоксическую реакцию, когда клетка-мишень PSMA+ со связанным анти-PSMA антителом распознается эффекторной клеткой с Fc рецепторами и затем лизируется без обязательного участия комплемента.

В контексте настоящего изобретения термин "усиливает ADCC" (например, применительно к клеткам) означает любое заметное усиление лизиса клеток при их взаимодействии с анти-PSMA антителами без фукозильных остатков, по сравнению с уничтожением этих клеток при взаимодействии с фукозилированными анти-РSМА антителами в присутствии эффекторных клеток (например, при отношении клетки-мишени:эффекторные клетки = 1:50), например усиление лизиса клеток по меньшей мере, приблизительно, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300% или 325%.

Термин "антитело" в контексте настоящего изобретения включает целые антитела и их любые антиген-связывающие фрагменты (антиген-связывающие участки) или отдельные цепи. "Антитело" означает гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными мостиками, или его антиген-связывающий участок. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (обозначается V_H) и постоянный участок тяжелой цепи. Постоянный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов, С_H1, С_H2 и С_H3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (обозначается V_L) и постоянного участка легкой цепи. Постоянный участок легкой цепи состоит только из одного домена, C_L. Участки V_H и V_L можно также разделить на участки гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR) и перемежающимися с более консервативными участками, так называемыми каркасными участками (FR). Каждый V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в следующем порядке, начиная от аминоконца и до карбоксильного конца: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные участки тяжелых и легких цепей содержат домен связывания, взаимодействующий с антигеном. Три постоянных участка антитела могут опосредовать связывание иммуноглобулина с хозяйскими тканями или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (CIq) классической системы комплемента.

Термин "антиген-связывающий участок антитела" (или просто "участок антитела") здесь означает один или несколько фрагментов антитела, обладающих способностью специфически связываться с антигеном (например, с PSMA). Показано, что антиген-связывающая функция антитела может осуществляться фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов антитела, подходящих под определение "антиген-связывающих участков", включают: (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, С_L и С_H1; (ii) фрагмент F(ab')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два домена Fab, связанных дисульфидными мостиками в области петли, (iii) фрагмент Fd, содержащий домены V_H и С_H1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V_L и V_H одного "плеча" антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), содержащий домен V_H; и (vi) изолированный (CDR). Более того, хотя два домена фрагмента Fv, V_L и V_H, кодируются двумя различными генами, их можно объединить с использованием рекомбинантных методов и синтетического линкера, в результате чего они будут образовываться как одна белковая цепочка, в которой пара участков V_L и V_H формирует одновалентные молекулы (называемые одноцепочечными Fv (scFv); см., например., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также попадают под определение "антиген-связывающего участка антитела". Фрагменты этих антител получают традиционными методами, известными специалистам в соответствующей области; их проверка на применимость осуществляется так же, как и в случае интактных антител.

Термин "рекомбинантное человеческое антитело" здесь означает все человеческие антитела, которые готовят, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными методами, в том числе (а) выделенные из животных (например, из мышей) антитела, трансгенные или трансхромосомальные с включением генов иммуноглобулина человека или приготовленные с помощью гибридом (далее этот метод описан подробно), (b) антитела, выделенные из клеток-носителей, которые были трансформированы так, чтобы экспрессировать антитела человека, например, из трансфектом, (с) антитела, взятые из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, и (d) антитела, приготовленные, экспрессированные, созданные или выделенные другими способами, предполагающими сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека на другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные участки, в которых области каркаса и CDR являются производными от иммуноглобулина зародышевых линий человека. В соответствии с некоторыми аспектами, однако, рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвержены мутагенезу in vitro (или, в случае использования последовательностей животных, трансгенных по отношению к Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности участков V_H и V_L рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и производны от человеческих зародышевых последовательностей V_H и V_L и родственны им, могут и не встречаться в зародышевых человеческих антителах в природе.

Термин "моноклональное антитело" или "композиция моноклональных антител" здесь означает препарат молекул антитела одного молекулярного состава. Композиция моноклональных антител демонстрирует простую (одиночную) специфичность с