Конъюгаты "производное калихеамицина-носитель"

Конъюгаты "производное калихеамицина-носитель"

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам получения конъюгатов "мономерное цитотоксическое лекарственное средство/носитель" ("конъюгатов") с высокой нагрузкой лекарственного средства и, в основном, с низким содержанием низкоконъюгированной фракции (LCF). Более конкретно, настоящее изобретение относится к конъюгатам "анти-CD22 антитело-мономерный калихеамицин". Настоящее изобретение также относится к указанным конъюгатам настоящего изобретения, к способам очистки этих конъюгатов, к фармацевтическим композициям, содержащим указанные конъюгаты, и к использованию этих конъюгатов.

Предпосылки создания изобретения

Конъюгаты лекарственных средств, разработанные для системной фармакотерапии, представляют собой мишень-специфические цитотоксические агенты. Указанная фармакотерапия основана на связывании терапевтического агента с молекулой-носителем, обладающей специфичностью к определенной популяции клеток-мишеней. Антитела с высокой аффинностью по отношению к антигенам являются природными распознающими цель молекулами. Благодаря доступности высокоаффинных моноклональных антител использование доставляемых антителом терапевтических средств является особенно перспективным. Токсическими веществами, которые были конъюгированы с моноклональными антителами, являются токсины, низкомолекулярные цитотоксические лекарственные средства, модификаторы биологических ответов и радионуклиды. Конъюгаты "антитело-токсин" часто называют иммунотоксинами, а иммуноконъюгаты, состоящие из антител и низкомолекулярных лекарственных средств, таких как метотрексат и адриамицин, называют хемоиммуноконъюгатами. Иммуномодуляторы содержат модификаторы биологических ответов, которые, как известно, обладают регуляторными функциями, такие как лимфокины, факторы роста и комплемент-активирующий фактор яда кобры (CVF). Радиоиммуноконъюгаты, которые состоят из радиоактивных изотопов, могут быть использованы в качестве терапевтических средств для индуцирования гибели клеток под действием их излучения, либо они могут быть использованы для визуализации. Предполагается, что опосредованная антителом специфическая доставка цитотоксических лекарственных средств в опухолевые клетки не только повышает их противоопухолевую эффективность, но также и предотвращает неспецифическое поглощение этих лекарственных средств нормальными тканями, и, тем самым, повышает их терапевтические индексы.

Настоящее изобретение относится к иммуноконъюгатам, включающим антитело в качестве нацеливающего носителя и обладающим специфичностью к антигенным детерминантам, присутствующим на поверхности злокачественных клеток, конъюгированным с цитотоксическим лекарственным средством. Настоящее изобретение относится к конъюгатам "цитотоксическое лекарственное средство - антитело", где указанное антитело обладает специфичностью к антигенным детерминантам, присутствующим на клетках, ассоциированных со злокачественными В-клеточными опухолями, лимфопролиферативными расстройствами и хроническими воспалительными заболеваниями. Настоящее изобретение также относится к способам продуцирования иммуноконъюгатов и к их использованию в терапии.

Различные терапевтические средства, полученные на основе указанных антител и предназначенные для лечения различных заболеваний, включая рак и ревматоидный артрит, были апробированы для клинического применения, либо они находятся на стадии клинических испытаний по их использованию в качестве лекарственных средств для лечения злокачественных опухолей, включая В-клеточные злокачественные опухоли, такие как не-ходжскинская лимфома. Одним из таких терапевтических средств на основе антител является ритуксимаб (Rituxan™), немеченное химерное антитело, которое содержит область γ1 (+mγ1V-область) человеческого антитела, и которое является специфичным к поверхностно-клеточному антигену CD20, экспрессируемому на В-клетках. Эти терапевтические средства основаны на использовании антител и обладают опосредованной комплементом цитотоксичностью (CDCC) или антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC), направленной против В-клеток, либо эти терапевтические средства основаны на использовании радионуклидов, таких как ¹³¹I или ⁹⁰Y, и получение и применение таких терапевтических средств связано с определенными проблемами для врачей-клиницистов и пациентов. Поэтому необходимость в получении иммуноконъюгатов, которые не имели бы недостатков современных терапевтических средств, полученных на основе антител и используемых для лечения различных злокачественных опухолей, включая гемопоэтические злокачественные опухоли, такие как не-ходжкинская лимфома (НХЛ), и которые можно было бы легко и эффективно продуцировать, а также повторно использовать без индуцирования иммунного ответа, все еще остается актуальной.

Иммуноконъюгаты, содержащие член семейства эффективных антибактериальных и противоопухолевых агентов, известных под общим названием калихеамицины или комплекс LL-E33288 (см. патент США №4970198 (1990)), были разработаны для лечения миелом. Наиболее эффективным из калихеамицинов является агент, обозначенный γ₁, который в настоящем описании будет просто обозначаться гамма. Эти соединения содержат метилтрисульфид, который может быть подвергнут реакции взаимодействия с соответствующими тиолами с образованием дисульфидов и с одновременным введением функциональной группы, такой как гидразид или другой функциональной группы, которая может быть использована для присоединения производного калихеамицина к носителю (см., патент США №5053394). Использование конъюгатов "мономерное производное калихеамицина/носитель" в современной терапии рака различных типов ограничено из-за недостаточной доступности специфических нацеливающих агентов (носителей), а также из-за несовершенства технологий конъюгирования, которые, в случае увеличения количества производного калихеамицина, конъюгированного с носителем (то есть увеличения нагрузки конъюгата лекарственным средством), приводят к образованию белковых агрегатов. Поскольку более высокая нагрузка лекарственного средства приводит к увеличению внутренней эффективности конъюгата, то желательно, чтобы нагрузка лекарственным средством была как можно выше, насколько это позволяют условия для сохранения аффинности белка-носителя. Присутствие агрегированного белка, который может быть неспецифически токсичным и иммуногенным и который, поэтому, должен быть удален при терапевтическом применении, затрудняет процесс крупномасштабного производства этих конъюгатов и снижает выход продуктов. Количество калихеамицина, нагруженного на белок-носитель (нагрузка лекарственного средства), количество агрегата, образующегося в результате реакции конъюгирования, и выход получаемого в итоге очищенного мономерного конъюгата являются взаимосвязанными факторами. Поэтому компромисс между более высокой загрузкой лекарственного средства и выходом конечного мономера может быть достигнут путем выбора соответствующего количества реакционно-способного производного калихеамицина, добавляемого в реакционную смесь для конъюгирования.

Тенденция конъюгатов цитотоксического лекарственного средства, а в частности, конъюгатов калихеамицина образовывать агрегаты, является особенно проблематичной в том случае, когда реакцию конъюгирования осуществляют с использованием линкеров, как описано в патентах США №№5877296 и 5773001, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В этом случае большой процент продуцируемых конъюгатов находится в агрегированной форме, что значительно затрудняет очистку конъюгатов стандартными способами (СМА-способами) для их последующего терапевтического использования. В случае некоторых белков-носителей, конъюгаты даже с весьма умеренной нагрузкой невозможно фактически получить, за исключением разве что в лабораторных масштабах. Следовательно, разработка усовершенствованных методов получения конъюгатов цитотоксических лекарственных средств, таких как калихеамицинов, с носителями, которые обеспечивали бы минимизацию агрегации, а поэтому позволяли бы получать конъюгаты, по возможности, с большей нагрузкой лекарственным средством и в то же время с высоким выходом продукта, является крайне необходимой.

Используемые ранее методы конъюгирования для получения препаратов "мономерное производное калихеамицина/носитель" с высокой нагрузкой лекарственным средством/высоким выходом и низкой степенью агрегации были описаны в литературе (см. патенты США №5712374 и США №5714586, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). И хотя эти способы позволяют получать конъюгированные препараты со значительно пониженным содержанием агрегатов, однако, позже было обнаружено, что эти способы дают возможность получать конъюгаты, имеющие неприемлемо высокие уровни (45-65% ВЭЖХ, % площади) низкоконъюгированной фракции (LCF), то есть фракции, состоящей, в основном, из неконъюгированного антитела. Присутствие LCF в данном продукте означает неэффективное использование антитела, поскольку оно не содержит цитотоксического лекарственного средства. Это антитело может также конкурировать с конъюгатом "калихеамицин-носитель" за связывание с мишенью и, тем самым, потенциально снижать степень доступности этой мишени, что приводит к снижению эффективности цитотоксического лекарственного средства. Поэтому, желательно разработать усовершенствованный способ конъюгирования, который обеспечивал бы значительное снижение уровней LCF и давал бы приемлемые минимальные уровни агрегации, но, при этом, не оказывал бы значительного влияния на физические свойства указанного конъюгата.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам получения конъюгатов "производное мономерного цитотоксического лекарственного средства/носитель" ("конъюгатов") с высокой нагрузкой лекарственным средством и, в основном, с низким содержанием низкоконъюгированной фракции (LCF). В частности, настоящее изобретение относится к получению конъюгатов "мономерное производное калихеамицина/носитель", к указанным конъюгатам, к композициям, к способу очистки таких конъюгатов и к использованию этих конъюгатов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам получения конъюгата "мономерное производное калихеамицина - анти-CD22 антитело" (СМС-544).

В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу получения конъюгатов, обеспечивающему значительное снижение уровней LCF (ниже 10%) но, при этом, не оказывающему значительного воздействия на физические или химические свойства указанного конъюгата. Настоящее изобретение также относится к дополнительно усовершенствованному способу конъюгирования, который, по сравнению с уже описанными способами, позволяет не только значительно снизить уровни LCF, а также значительно снизить степень агрегации по сравнению с ранее описанными способами и значительно увеличить нагрузку конъюгата лекарственным средством. Конъюгаты настоящего изобретения имеют формулу:

Pr(-X-W)_m,

где Pr представляет собой белковый носитель;

X представляет собой линкер, включающий продукт реакции любой реакционно-способной группы, которая может взаимодействовать с белковым носителем;

W представляет собой цитотоксическое лекарственное средство;

m означает среднюю нагрузку для продукта очищенного конъюгата, такую, при которой указанное цитотоксическое лекарственное средство составляет 7-9% по массе конъюгата; и

(-X-W)_m представляет собой производное цитотоксического лекарственного средства.

В одном из вариантов, конъюгаты настоящего изобретения получают способом настоящего изобретения, включающим стадии: (1) добавления производного цитотоксического лекарственного средства к белковому носителю, где указанное производное цитотоксического лекарственного средства составляет 4,5-11% по массе белкового носителя; (2) инкубирования цитотоксического лекарственного средства и белкового носителя в ненуклеофильном и совместимом с белком буферном растворе, имеющем рН в пределах примерно от 7 до 9, с продуцированием конъюгата "мономерное цитотоксическое лекарственное средство/носитель", где указанный раствор, кроме того, содержит (а) органический сорастворитель и (b) добавку, содержащую, по крайней мере, одну С₆-С₁₈-карбоновую кислоту или ее соль, и где указанное инкубирование осуществляют при температуре в пределах примерно от 30°С до 35°С в течение периода времени примерно от 15 минут до 24 часов; и (3) хроматографии конъюгата, полученного на стадии (2), для отделения конъюгатов "производное мономерного цитотоксического лекарственного средства/белковый носитель", имеющих нагрузку цитотоксическим лекарственным средством, составляющую в пределах 4-10 мас.%, и содержание низкоконъюгированной фракции (LCF), составляющее ниже 10%, от неконъюгированного белкового носителя, производного цитотоксического лекарственного средства и агрегированных конъюгатов.

В одном из вариантов осуществления изобретения белковый носитель указанного конъюгата выбран из группы, состоящей из гормонов, факторов роста, антител, фрагментов антител, миметиков антител и их генетически или ферментативно сконструированных аналогов.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанным белковым носителем является антитело. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное антитело выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, химерного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела, одноцепочечного антитела, Fab-фрагмента и F(ab)₂-фрагмента.

В другом варианте осуществления изобретения указанное гуманизированное антитело направлено против антигена клеточной поверхности CD22.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое антитело, которое включает вариабельную область легкой цепи 5/44-gLl (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область тяжелой цепи 5/44-gH7 (SEQ ID NO: 27).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое антитело, содержащее легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое антитело, содержащее тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое антитело, содержащее легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, и тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.

В другом варианте осуществления изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое антитело, которое представляет собой вариант антитела, полученный в соответствии с протоколом осуществления аффинного созревания и обладающий повышенной специфичностью к человеческому CD22.

В другом своем аспекте цитотоксическое лекарственное средство, используемое для генерирования конъюгата "мономерное цитотоксическое лекарственное средство/носитель" настоящего изобретения, представляет собой ингибитор полимеризации тубулина, алкилирующий агент, который связывается с ДНК и разрушает ее, ингибитор синтеза белка или ингибитор тирозинкиназы.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное цитотоксическое лекарственное средство выбрано из калихеамицинов, тиотепы, таксанов, винкристина, даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, эсперамицинов, актиномицина, аутрамицина, азасеринов, блеомицинов, тамоксифена, идарубицина, доластатинов/ауристатинов, гемиастерлинов и маутанзиноидов.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным цитотоксическим лекарственным средством является калихеамицин. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным калихеамицином является гамма-калихеамицин или производное N-ацетил-гамма-калихеамицина.

В еще одном аспекте настоящего изобретения указанное цитотоксическое лекарственное средство имеет функциональную 3-меркапто-3-метилбутаноилгидразидную группу и конъюгировано с белковым носителем посредством гидролизуемого линкера, способного высвобождать цитотоксическое лекарственное средство из указанного конъюгата после его связывания и проникновения в клетки-мишени.

В предпочтительном варианте этого аспекта указанным гидролизуемым линкером является 4-(4-ацетилфенокси)бутановая кислота (AcBut).

В еще одном аспекте настоящего изобретения в процессе конъюгирования используется октановая кислота или ее соль или декановая кислота или ее соль в качестве добавки для снижения степени агрегации и увеличения нагрузки лекарственным средством.

В еще одном аспекте настоящего изобретения конъюгаты настоящего изобретения очищают методом хроматографического разделения.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанным методом хроматографического разделения, используемым для разделения конъюгата "производное мономерного лекарственного средства - носитель", является эксклюзионная хроматография (SEC).

В другом варианте осуществления изобретения методом хроматографического разделения, используемым для разделения конъюгата "производное мономерного лекарственного средства - носитель", является ВЭЖХ, ЖЭХБ или хроматография на Сефакриле S-200.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения методом хроматографического разделения, используемым для разделения конъюгата "производное мономерного лекарственного средства - носитель", является гидрофобная хроматография (ГФХ). В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения ГФХ осуществляют с использованием в качестве хроматографической среды фенилсефарозы 6 Fast Flow, бутилсефарозы 4 Fast Flow, октилсефарозы 4 Fast Flow, Toyopearl Ether-650M, метиловой ГФХ-среды Macro-Prep или трет-бутиловой ГФХ-среды Macro-Prep. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения ГФХ осуществляют с использованием в качестве хроматографической среды бутилсефарозы 4 Fast Flow.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату "производное мономерного цитотоксического лекарственного средства/носитель", полученному способом настоящего изобретения. В предпочтительном варианте этого аспекта используемым цитотоксическим лекарственным средством является калихеамицин, а используемым носителем является антитело.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное антитело выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, химерного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела, одноцепочечного антитела, Fab-фрагмента и F(ab)₂-фрагмента. В более предпочтительном аспекте изобретения используется гуманизированное антитело, направленное против антигена клеточной поверхности CD22.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое антитело, которое включает вариабельную область легкой цепи 5/44-gLl (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область тяжелой цепи 5/44-gH7 (SEQ ID NO: 27).

В другом варианте осуществления изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое антитело, содержащее легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое антитело, содержащее тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое антитело, содержащее легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, и тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.

В еще одном варианте осуществления изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое антитело, которое представляет собой вариант антитела, полученный в соответствии с протоколом осуществления аффинного созревания и обладающий повышенной специфичностью к человеческому CD22.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным калихеамицином является гамма-калихеамицин или N-ацетил-гамма-калихеамицин.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное производное калихеамицина имеет функциональную 3-меркапто-3-метилбутаноилгидразидную группу.

В другом варианте осуществления изобретения линкером, используемым для конъюгирования указанного лекарственного средства с указанным носителем, является гидролизуемый линкер, способный высвобождать цитотоксическое лекарственное средство из конъюгата после его связывания и проникновения в клетки-мишени. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным гидролизуемым линкером является 4-(4-ацетилфенокси)бутановая кислота (AcBut).

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату "производное мономерного калихеамицина/анти-CD22 антитело", имеющему формулу: Pr(-X-S-S-W)_m, где: Pr представляет собой анти-CD22 антитело; X представляет собой гидролизуемый линкер, включающий продукт реакции любой реакционно-способной группы, которая может взаимодействовать с антителом; W представляет собой радикал калихеамицина; m означает среднюю нагрузку для очищенного продукта конъюгирования, такую, при которой указанный калихеамицин составляет 4-10% по массе конъюгата; a (-X-S-S-W)_m представляет собой производное калихеамицина, полученное способом настоящего изобретения.

В одном из вариантов этого аспекта указанное антитело выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, химерного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела, одноцепочечного антитела, Fab-фрагмента и F(ab)₂-фрагмента.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным антителом является анти-CD22 антитело, которое обладает специфичностью к человеческому CD22 и включает тяжелую цепь, где вариабельный домен содержит CDR, имеющую, по крайней мере, одну из последовательностей, представленных на фиг.1 и обозначенных H1 (SEQ ID NO: 1) для CDR-H1, Н2 (SEQ ID NO: 2), Н2′ (SEQ ID NO: 13), Н2′′ (SEQ ID NO: 15) или Н2′′′ (SEQ ID NO: 16) для CDR-H2; или Н3 (SEQ ID NO: 3) для CDR-H3; и легкую цепь, где вариабельный домен содержит CDR, имеющую, по крайней мере, одну из последовательностей, представленных на фиг.1 и обозначенных L1 (SEQ ID NO: 4) для CDR-L1, L2 (SEQ ID NO: 5) для CDR-L2 или L3 (SEQ ID NO: 6) для CDR-L3.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения анти-CD22 антитело включает тяжелую цепь, где вариабельный домен содержит CDR, имеющую, по крайней мере, одну из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1 для CDR-H1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16 для CDR-H2, или SEQ ID NO: 3 для CDR-H3, и легкую цепь, где вариабельный домен содержит CDR, имеющую, по крайней мере, одну из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 4 для CDR-L1, SEQ ID NO: 5 для CDR-L2 или SEQ ID NO: 6 для CDR-L3.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения анти-CD22 антитело содержит SEQ ID NO: 1 для CDR-H1; SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16 для CDR-H2; SEQ ID NO: 3 для CDR-H3; SEQ ID NO: 4 для CDR-L1; SEQ ID NO: 5 для CDR-L2 или SEQ ID NO: 6 для CDR-L3.

В другом варианте осуществления изобретения гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое анти-CD22 антитело, которое содержит вариабельный домен, включающий человеческие акцепторные каркасные области и не человеческие донорные CDR.

В другом варианте осуществления изобретения гуманизированное анти-CD22 антитело имеет человеческую акцепторную каркасную область, где области вариабельного домена тяжелой цепи указанного антитела основаны на человеческой консенсусной последовательности подгруппы I и включают не человеческие донорные остатки в положениях 1, 28, 48, 71 и 93. В другом варианте осуществления изобретения, указанное гуманизированное антитело, кроме того, включает не человеческие донорные остатки в положениях 67 и 69.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения CDR-привитое гуманизированное антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий человеческую акцепторную каркасную область, основанную на человеческой консенсусной последовательности подгруппы I, и кроме того, включающий не человеческие донорные остатки в положениях 2, 4, 37, 38, 45 и 60. В другом варианте осуществления изобретения, указанное CDR-привитое антитело, кроме того, включает не человеческий донорный остаток в положении 3.

В другом варианте осуществления изобретения CDR-привитое антитело включает вариабельную область легкой цепи 5/44-gL1 (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область тяжелой цепи 5/44-gH7 (SEQ ID NO: 27).

В другом варианте осуществления изобретения указанное CDR-привитое антитело включает легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, и тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное CDR-привитое антитело содержит легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, и тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.

В еще одном варианте осуществления изобретения указанным CDR-привитым анти-CD22 антителом является вариант антитела, полученный в соответствии с протоколом осуществления аффинного созревания и обладающий повышенной специфичностью к человеческому CD22.

В другом варианте осуществления изобретения указанным анти-CD22 антителом является химерное антитело, содержащее последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, представленные в SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно.

В еще одном варианте осуществления изобретения указанное анти-CD22 антитело содержит гибридную CDR с усеченной донорной последовательностью CDR, где на месте отсутствующей части донорной CDR находится другая заменяющая ее последовательность, в результате чего образуется функциональная CDR.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным производным цитотоксического лекарственного средства является либо гамма-калихеамицин, либо производное N-ацетил гамма-калихеамицин.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения стабильной лиофилизированной композиции конъюгата "производное мономерного цитотоксического лекарственного средства/носитель". В предпочтительном варианте осуществления изобретения стабильную лиофилизированную композицию конъюгата "производное мономерного цитотоксического лекарственного средства/носитель" получают путем (а) растворения указанного конъюгата "производное мономерного цитотоксического лекарственного средства/носитель" до конечной концентрации 0,5-2 мг/мл в растворе, содержащем криозащитный агент в концентрации 1,5-5 мас.%, полимерный наполнитель в концентрации 0,5-1,5 мас.%, электролиты в концентрации 0,01-0,1М, агент, способствующий растворению в концентрации 0,005-0,05 мас.%, забуферивающий агент в концентрации 5-50 мМ, необходимой для доведения конечного рН раствора до 7,8-8,2, и воду; (b) распределения вышеуказанного раствора по сосудам при температуре от +5°С до +10°С; (с) замораживания указанного раствора при температуре замораживания от -35°С до -50°С; (d) проведения предварительной стадии лиофилизации замороженного раствора для его первичной сушки под давлением 20-80 мкПа и при температуре хранения от -10°С до -40°С в течение 24-78 часов; и (е) проведения вторичной сушки лиофилизированного продукта стадии (d) под давлением 20-80 мкПа и при температуре хранения от +10°С до +35°С в течение 15-30 часов.

В одном из вариантов осуществления изобретения, криозащитный агент, используемый для лиофилизации конъюгата "цитотоксическое лекарственное средство/носитель", выбран из альдита, маннита, сорбита, инозита, полиэтиленгликоля, альдоновой кислоты, уроновой кислоты, альдаровой кислоты, альдоз, кетоз, аминосахаров, альдитов, инозитов, глицеральдегидов, арабинозы, ликсозы, пентозы, рибозы, ксилозы, галактозы, глюкозы, гексозы, идозы, маннозы, талозы, гептозы, глюкозы, фруктозы, глюконовой кислоты, сорбита, лактозы, маннита, метил-α-глюкопиранозида, мальтозы, изоаскорбиновой кислоты, аскорбиновой кислоты, лактона, сорбозы, глюкаровой кислоты, эритрозы, треозы, арабинозы, аллозы, альтрозы, гуллозы, идозы, таллозы, эритрулозы, рибулозы, ксилулозы, псикозы, тагатозы, глюкуроновой кислоты, глюконовой кислоты, глюкаровой кислоты, галактуроновой кислоты, маннуроновой кислоты, глюкозамина, галактозамина, сахарозы, трегалозы, нейраминовой кислоты, арабинанов, фруктанов, фуканов, галактанов, галактуронанов, глюканов, маннанов, ксиланов, левана, фукоидана, карагенана, галактокаролозы, пектинов, пектиновых кислот, амилозы, пуллулана, гликогена, амилопектина, целлюлозы, декстрана, пустулана, хитина, агарозы, кератина, хондротина, дерматана, гиалуроновой кислоты, альгиновой кислоты, ксантановой камеди, крахмала, сахарозы, глюкозы, лактозы, трегалозы, этиленгликоля, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, глицерина и пентаэритритола.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным криозащитным агентом является сахароза, которая присутствует в концентрации 1,5 мас.%.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный полимерный наполнитель, используемый в процессе лиофилизации, выбран из декстрана 40 или гидроксиэтилированного крахмала 40, и присутствует в концентрации 0,9 мас.%.

В другом варианте осуществления изобретения электролитом, используемым в растворе для лиофилизации, является хлорид натрия, который присутствует в концентрации 0,05М.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения в процессе лиофилизации используется агент, повышающий растворимость. Указанным агентом, повышающим растворимость, предпочтительно, является поверхностно-активное вещество. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным поверхностно-активным веществом является полисорбат 80, который присутствует в концентрации 0,01 мас.%.

В одном из вариантов осуществления изобретения используемым забуферивающим агентом является трометамин, который присутствует в концентрации 0,02М. При этом, предпочтительно, чтобы в начале лиофилизации рН раствора составлял 8,0. Раствор, содержащий конъюгат "цитотоксическое лекарственное средство/носитель", распределяют по сосудами при температуре +5°С до начала лиофилизации.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения раствор в сосудах замораживают при температуре -45°С; затем проводят предварительную стадию лиофилизации для первичной сушки замороженного раствора под давлением 60 мкПа и при температуре хранения -30°С в течение 60 часов; после этого проводят вторую стадию сушки лиофилизированного продукта под давлением 60 мкПа и при температуре хранения +25°С в течение 24 часов.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей терапевтически эффективную дозу конъюгата "производное мономерного цитотоксического лекарственного средства/носитель", полученного способом настоящего изобретения.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанным носителем в конъюгате "производное мономерного цитотоксического лекарственного средства/носитель" является белковый носитель, выбранный из гормонов, факторов роста, антител и миметиков антител.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным белковым носителем является человеческое моноклональное антитело, химерное антитело, человеческое антитело или гуманизированное антитело.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное гуманизированное антитело направлено против антигена клеточной поверхности CD22.

В особенно предпочтительном варианте этого аспекта изобретения указанное анти-CD22 антитело обладает специфичностью к человеческому CD22 и включает тяжелую цепь, где вариабельный домен содержит область CDR, имеющую, по крайней мере, одну из последовательностей, представленных на фиг.1 и обозначенных H1 (SEQ ID NO: 1) для CDR-H1, Н2 (SEQ ID NO: 2), Н2′ (SEQ ID NO: 13), Н2′′ (SEQ ID NO: 15) или Н2′′′ (SEQ ID NO: 16) для CDR-H2, или Н3 (SEQ ID NO: 3) для CDR-H3; и легкую цепь, где вариабельный домен содержит CDR, имеющую, по крайней мере, одну из последовательностей, представленных на фиг.1 и обозначенных L1 (SEQ ID NO: 4) для CDR-L1, L2 (SEQ ID NO: 5) для CDR-L2 или L3 (SEQ ID NO: 6) для CDR-L3.

В другом предпочтительном варианте изобретения анти-CD22 антитело включает тяжелую цепь, где вариабельный домен содержит CDR, имеющую, по крайней мере, одну из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1 для CDR-H1; SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16 для CDR-H2; или SEQ ID NO: 3 для CDR-H3, и легкую цепь, где вариабельный домен содержит CDR, имеющую, по крайней мере, одну из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 4 для CDR-L1, SEQ ID NO: 5 для CDR-L2 или SEQ ID NO: 6 для CDR-L3.

В еще одном предпочтительном варианте изобретения анти-CD22 антитело содержит SEQ ID NO: 1 для CDR-H1; SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16 для CDR-H2; SEQ ID NO: 3 для CDR-H3; SEQ ID NO: 4 для CDR-L1; SEQ ID NO: 5 для CDR-L2; SEQ ID NO: 6 для CDR-L3.

В особенно предпочтительном варианте изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое гуманизированное анти-CD22 антитело, которое включает вариабельную область легкой цепи 5/44-gL1 (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область тяжелой цепи 5/44-gH7 (SEQ ID NO: 27).

В другом особенно предпочтительном варианте изобретения указанным гуманизированным анти-CD22 антителом является CDR-привитое антитело, которое обладает специфичностью к человеческому CD22 и содержит легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, и тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанным CDR-привитым антителом является вариант антитела, обладающий повышенной специфичностью к человеческому CD22 и полученный в соответствии с протоколом осуществления аффинного созревания.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанным мономерным цитотоксическим лекарственным средством является калихеамицин, предпочтительно выбранный из гамма-калихеамицина или N-ацетил-калихеамицина.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанная композиция может, но необязательно, содержать дополнительный биологически активный агент. Таким биологически активным агентом может быть цитотоксическое лекарственное средство, фактор роста или гормон.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума с пролиферативным расстройством, предусматривающему введение такому индивидууму терапевтически эффективной дозы композиции настоящего изобретения. Указанная композиция может быть введена подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутриартериально, интрамедуллярно, интратекально, трансдермально, чрескожно, интраназально, местно, внутрикишечно, интравагинально, подъязычно или ректально. В предпочтительном варианте изобретения композицию настоящего изобретения вводят внутривенно.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанную композицию вводят индивидууму, страдающему пролиферативным расстройством, таким как рак. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным раковым заболеванием является злокачественная В-клеточная опухоль. Указанной злокачественной В-клеточной опухолью может быть лейкоз или лимфома, экспрессирующая антиген клеточной поверхности CD22.

В еще одном варианте изобретения указанным раковым заболеванием является карцинома или саркома.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения В-клеточной злокачественной опухоли, предусматривающему введение пациенту с указанной злокачественной опухолью терапевтически эффективной композиции, содержащей конъюгат "цитотоксическое лекарственное средство - анти-CD22 антитело" настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанной В-клет