Дополненные матриксы для лечения переломов костей

Дополненные матриксы для лечения переломов костей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящая заявка относится к дополненным матриксам и их применению для консолидации и заживления переломов костей.

Уровень техники

По статистике, ежегодно у 5-6 миллионов людей в Европе и Соединенных Штатах Америки происходят переломы костей из-за различных травм, в том числе связанных со спортивной или другой физической активностью, а также с остеопорозом. Для лечения большинства этих повреждений достаточно ручной репозиции и внешней иммобилизации (например, с помощью гипсовой повязки). Однако примерно 20-25% переломов требуют оперативного вмешательства в условиях стационара.

Перелом - это, по определению, нарушение целостности наружного компактного слоя кости, обычно в результате внешнего механического воздействия. Полный перелом - это такое нарушение целостности, когда разлом проходит сквозь всю структуру кости с образованием двух или более отдельных костных отломков. Костные фрагменты не обязательно должны быть разделены пространственно, чтобы травма считалась переломом. В некоторых случаях надкостница удерживает фрагменты кости в изначальном, анатомически нормальном положении. В других случаях конечность сгибается в месте перелома, и отломки разрывают надкостницу, а иногда даже и окружающие мышцы и кожу. При пулевых или осколочных ранениях и при травмах в результате серьезных аварий большие части кости иногда бывают раздроблены или значительно смещены. Основные цели лечения переломов - прочное сращение и восстановление функции кости без деформации. Скорейшее достижение этих целей тем более важно, что оно связано с проблемами инвалидности и стоимости лечения. Между тем достижение обеих целей - и прочного сращения кости, и восстановления функции - проблематично у значительной части пациентов из-за преклонного возраста, плохого общего состояния здоровья, типа и локализации перелома. В частности, при остеопорозе консолидация перелома, скорее всего, будет долгой, при этом велик риск несращения перелома. Для остеопороза, являющегося заболеванием всего скелета, характерны снижение костной массы и структурные нарушения костной ткани, что приводит к повышенной ломкости костей и увеличению длительности консолидации и вероятности несращения.

Костные трансплантаты и их заменители широко используются для различных ортопедических манипуляций при разрушении костей, медленном сращении или несращении переломов, а также в качестве имплантируемого материала для фиксации отломков. При тяжелых или осложненных переломах костные трансплантаты и их заменители используются для того, чтобы укрепить кость перед тем, как окончательно ее стабилизировать шиной или гипсовой повязкой. Трансплантационный материал может быть аутогенным аллогенным, или ксеногенным; могут использоваться деминерализованный костный матрикс (ДКМ), синтетические материалы, а также смеси всех этих материалов. Костные трансплантационные материалы можно разделить на остеокондуктивные, остеоиндуктивные и остеогенные. Остеокондуктивные материалы сами не образуют кость; вместо этого они стимулируют миграцию близлежащих живых костных клеток внутрь трансплантационного материала. Остеоиндуктивные материалы стимулируют формирование костной ткани организмом пациента. Остеогенные материалы состоят только из остеобластов и мезенхимных стволовых клеток, которые генерируют костную ткань. Некоторые материалы сочетают в себе названные выше свойства.

Аутотрансплантатом называется любая ткань или кость, взятая из организма самого пациента для использования в качестве трансплантата в месте повреждения. Чаще всего костные трансплантаты получают из подвздошного гребня. Хотя у аутотрансплантатов много преимуществ: они биосовместимы, безопасны, содержат сосудистую сеть и обладают остеоиндуктивными свойствами, - у них есть и серьезные недостатки. Чтобы получить аутотрансплантат, нужна еще одна хирургическая операция, а значит, возможны и послеоперационные осложнения: кровопотеря, инфицирование, болевой синдром. Применять аутотрансплантаты дорого из-за более длительной госпитализации и дополнительных операций. Объем аутотрансплантата для каждого данного пациента ограничен, а боли после операции по забору трансплантационного материала часто сильнее, чем боль, вызванная самим переломом. Несмотря на эти недостатки, аутотрансплантат считается "золотым стандартом" костного трансплантационного материала. Аллотрансплантат - это трупный костный материал, участок ткани, полученный из той или иной кости, которому можно затем искусственно придать желаемую структуру и форму. Аллотрансплантаты лишь в минимальной степени остеоиндуктивны, количество их ограничено, а пациенты подвергаются риску инфицирования донорскими патогенами. Существуют синтетические заменители -"стандартные", "серийные" искусственные трансплантаты, разрабатываемые как альтернатива аутогенному костному материалу. В качестве синтетических заменителей костного материала для трансплантации применяют различные виды керамики и самоотверждаемые полимеры, имитирующие свойства человеческой кости, например гидроксиапатит, полиметилметакрилат, коллаген, трикальцийфосфат и другие фосфаты кальция, сульфаты кальция. Эти материалы плохо поддаются обработке и лишены остеоиндуктивных свойств.

В последние годы большое внимание уделялось разработке заменителей костного материала с остеоиндуктивными свойствами, которые были бы полноценной "стандартной" альтернативой аутотрансплантатам. ДКМ - один из примеров остеоиндуктивного заменителя костного трансплантата. Однако ДКМ, будучи аллогенным материалом, имеет те же недостатки, что любая аллогенная кость. Другие примеры - OP-1® (Stryker Corp.), который выделяет рекомбинантный костный морфогенетический белок 7 (BMP7) из коллагенового матрикса, и заменитель костного трансплантата INFUSE® (Medtronic Sofamor Danek), в котором рекомбинантный белок BMP2 содержится в коллагеновой губке. Помимо того, что получение костных морфогенетических белков дорого и требует больших затрат времени, оба материала выделяют белки из коллагенового матрикса в слишком высоких концентрациях. Коллагеновые матриксы, получаемые из тканей крупного рогатого скота, имеют все недостатки, связанные с риском использования ксеногенного материала, и плохо поддаются обработке, необходимой для хирургических манипуляций с ними (в частности, их трудно подогнать по форме к поврежденному участку кости), а высокие концентрации попадающих в организм пациента костных морфогенетических белков могут иногда привести к кальцификации органов или образованию костей в других частях тела.

В других видах матрикса, применяемого для местного лечения костных дефектов, используется паратиреоидный гормон (ПТГ) человека или его производные в составе фибриновых пломбировочных композиций, образующихся in situ из инъецируемых компонентов. Паратиреоидный гормон - это пептид, состоящий из 84 аминокислотных остатков, синтезируемый и секретируемый паращитовидными железами. Полноразмерный гормон регулирует уровень кальция в крови и обновление костной ткани. Он является мощным анаболическим фактором прямого действия по отношению к предшественникам остеобластов и анаболическим фактором непрямого действия по отношению к остеокластам. Регулируя баланс остеобластов и остеокластов, ПТГ тем самым непосредственно воздействует на обновление костного материала и последующее высвобождение кальция в кровоток. Результаты многих исследований на животных говорят о том, что ПТГ может оказывать анаболическое действие в отношении плотности костного вещества (ПКВ). Действие ПТГ на клетки опосредовано его связыванием с поверхностными рецепторами. Эти рецепторы обнаружены на остеобластах - клетках, ответственных за образование новой кости.

Есть данные о том, что N-концевой домен ПТГ человека, состоящий из 34 аминокислотных остатков, биологически эквивалентен полноразмерному гормону. Первые данные о ПТГ_1-34 и его действии появились в патенте США № 4086196. Известно, что ПТГ_1-34 - полностью биологически активный вариант ПТГ с усеченной аминокислотной последовательностью, лишенный дисульфидных связей и выраженной третичной структуры. У него прослеживается умеренно выраженная вторичная структура, в том числе несколько альфа-спиралей. В многочисленных клинических исследованиях больные остеопорозом получали курс ПТГ для увеличения общей костной массы. В большинстве случаев ПТГ или ПТГ_1-34 требовалось вводить - в чистом виде или в сочетании с другими биологически активными веществами - ежедневно в течение многих месяцев. Более подробно ПТГ и ПТГ_1-34 описаны в международной заявке WO 03/052091, содержание которой включено в настоящее описание в виде ссылки. Другие усеченные варианты: 1-25, 1-31 и 1-38 - также обладают биологической активностью ПТГ.

В то время как системное действие ПТГ исследовали достаточно интенсивно, его местный эффект оставался почти без внимания. В международной заявке WO 03/052091 описаны матриксы для местного введения ПТГ. Гормон, ковалентно связанный с синтетическим или натуральным матриксом (в частности, фибриновым или полиэтиленгликолевым), высвобождается точно в заданном месте, причем этот процесс контролируется.

Однако в международной заявке WO 03/052091 нет описания матриксов, которые можно было бы применить для консолидации переломов костей, особенно тяжелых переломов, с высоким риском замедленного сращения или несращения.

Поэтому цель настоящего изобретения - создать матрикс, применимый для местного лечения переломов костей.

Сущность изобретения

Неожиданно было обнаружено, что матрикс, содержащий ПТГ (далее "дополненный матрикс"), можно применять для местного введения ПТГ в месте перелома для консолидации и заживления последнего.

Таким образом, настоящее изобретение связано с композицией следующего состава:

а) пептид, выбранный из группы, включающей в себя ПТГ и пептид слияния ПТГ;

б) гранулярный материал, представляющий собой кальцийсодержащее минеральное вещество;

в) композиция, способная образовывать фибриновый матрикс в физиологических условиях, содержащая компонент-предшественник фибриногена и компонент-предшественник тромбина и где ПТГ или пептид слияния ПТГ присутствуют в диапазоне концентраций от 0,01 до 2 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, образующих матрикс, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, образующих матрикс, не включена в указанный интервал значений.

Настоящее изобретение связано также с дополненным матриксом следующего состава:

а) ПТГ или пептид слияния ПТГ;

б) гранулярный материал, представляющий собой кальцийсодержащее минеральное вещество;

в) фибрин,

в который включен вышеупомянутый ПТГ или пептид слияния ПТГ в диапазоне концентраций от 0,01 до 2 мг/мл фибринового матрикса, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса не включена в указанный интервал значений.

В настоящем изобретении вышеупомянутые композиция и дополненный матрикс применяются для изготовления лекарственного средства, предназначенного для местного введения при лечении переломов костей.

В предпочтительном варианте осуществления паратиреоидный гормон встраивается в матрикс таким образом, чтобы он мог оттуда высвобождаться, и дополненный матрикс наносится на место перелома либо непосредственно там образуется. В предпочтительных вариантах ПТГ ковалентно связан с матриксом. В одном из вариантов матрикс является фибриновым матриксом. В качестве паратиреоидного гормона может применяться ПТГ_1-84 (нативный гормон), ПТГ_1-38, ПТГ_1-34, ПТГ_1-31, ПТГ_1-25 или же любой модифицированный или аллельный вариант ПТГ, проявляющий те же свойства, что и вышеупомянутые пептиды, т.е. так же стимулирующий остеогенез (далее "ПТГ"). Предпочтительным типом ПТГ является ПТГ_1-34. В предпочтительном варианте в качестве ПТГ используется пептид слияния (далее "пептид слияния ПТГ"), содержащий по меньшей мере два домена, где первый домен содержит ПТГ, а второй домен содержит субстратный домен, способный к образованию ковалентных поперечных сшивок с матриксом во время или после его образования.

В одном из вариантов дополненный фибриновый матрикс образуется из композиции, содержащей а) гранулярный материал, б) композицию, содержащую фибриноген и тромбин, из которой может образовываться фибриновый матрикс, и в) ПТГ в диапазоне концентраций от 0,01 до 2 мг/мл фибринового матрикса, что является оптимальным для сращения и консолидации переломов костей, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса не включена в указанный интервал значений.

Предложен набор, содержащий упомянутую композицию, где по меньшей мере один из компонентов, образующих матрикс, хранится отдельно от других формирующих матрикс компонентов.

Композиции и дополненные матриксы предпочтительно применяются для сращения и консолидации переломов костей, особенно при повышенном риске замедленного сращения или несращения. Предпочтительные показания для их применения включают в себя переломы запястья (дистальные переломы лучевой кости), длинных костей, таких как большеберцовая, и бедра.

Краткое описание чертежей

Биологическая активность вариантов ПТГ показана на Фиг. 1. Клетки, трансфицированные репортерным геном, сцепленным с промотором гена рецептора ПТГ, обрабатывали одинаковым количеством ПТГ_1-34, ТГ-pl-ПТГ_1-34 (описан ниже) или ПТГ, содержащим 84 аминокислотных остатка, который соответствует международному стандарту ПТГ. Измеряли ингибирование экспрессии репортерного гена люциферазы и сравнивали его степень со степенью ингибирования в трансфицированных клетках, находящихся в среде без ПТГ (контроль).

Результаты измерения высвобождения ПТГ из фибринового матрикса показаны на Фиг. 2.

На Фиг. 3 показаны результаты теста на стабильность у подопытных животных с сегментарными дефектами большеберцовой кости при лечении с помощью дополненного матрикса, представленные как степень консолидации перелома (в баллах).

На Фиг. 4 показаны результаты теста на стабильность у подопытных животных с сегментарными дефектами большеберцовой кости при лечении с помощью дополненного матрикса, представленные как процент животных, у которых суставы остаются нестабильными.

Подробное описание изобретения

Ниже описаны дополненные матриксы, содержащие встроенный ПТГ, способный высвобождаться из них, и, необязательно, гранулярное вещество. ПТГ встраивается посредством либо ковалентного связывания с матриксом, либо нековалентного взаимодействия с матриксом и/или гранулами. Эти дополненные матриксы сокращают время заживления по сравнению со способами, в которых применяют аутотрансплантаты, или стимулируют консолидацию переломов костей, которые иначе не могли бы консолидироваться. Матриксы биосовместимы и биоразлагаемы и могут формироваться как in vitro, так и in vivo, в процессе имплантации. ПТГ можно включить в матрикс при полном сохранении его биологической активности. ПТГ может быть включен таким образом, чтобы он высвобождался из матрикса. Для этого применяются методы, позволяющие регулировать способ, время и степень высвобождения ПТГ, с использованием матрикса в качестве носителя с регулируемым высвобождением ПТГ для консолидации переломов костей.

Определения

"Сайт адгезии или сайт прикрепления клеток" означает здесь пептидную последовательность, с которой связывается молекула, например, рецептор прикрепления на поверхности клетки. Неограничивающими примерами сайтов адгезии являются последовательности RGD из фибронектина и YIGSR (SEQ ID NO. 1) из ламинина. Адгезивные сайты могут необязательно встраиваться в матрикс путем включения субстратного домена, образующего поперечные сшивки с фибриновым матриксом.

"Биологическая активность" означает здесь функциональные процессы, в которых участвует рассматриваемый белок. В некоторых вариантах осуществления это процессы, количественно оцениваемые по интенсивности взаимодействия одного полипептида с другим. Сюда также входит оценка влияния рассматриваемого белка на рост, дифференцировку, гибель, миграцию и прикрепление клеток, взаимодействие с другими белками, ферментативную активность, фосфорилирование и дефосфорилирование белков, транскрипцию или трансляцию.

"Перелом кости" означает здесь нарушение целостности или разлом по всей структуре кости, в результате которого образуется два или более отдельных отломков.

"Кальцийсодержащее минеральное вещество" означает здесь гомогенные вещества природного происхождения, содержащие ионы кальция. Пример кальцийсодержащего минерального вещества - гидроксиапатит (Са₅[(ОН)(РO₄)₃]) - основной компонент зубов и костей.

"Поперечное связывание" означает здесь образование ковалентных сшивок.

"Замедленное сращение" означает здесь ситуацию, когда перелом не консолидировался в течение 3-4 месяцев - времени, считающегося достаточным для нормальной консолидации перелома. При этом подразумевается, что, хотя и медленно, кость в конце концов срастется без какого-либо дополнительного вмешательства, хирургического или нехирургического. Однако в отдаленные сроки замедленное сращение может иногда перейти в несращение.

"Фибриновый матрикс" означает здесь продукт формирования поперечных сшивок между большей частью молекул предшественников - фибриногена и тромбина - в присутствии источника кальция и фактора XIIIa, с образованием трехмерной сети.

"Матрикс" означает здесь материал, предназначенный для связывания с биологическими системами с целью лечения, усиления или замещения ткани или функции ткани постоянно или временно, в зависимости от природы материала. Матрикс может служить устройством для локального введения включенного в него ПТГ и/или каркасом для врастания в него клеток. Описанные здесь матриксы образуются из жидких компонентов-предшественников, которые способны сформировать подобие каркаса в требуемом месте внутри организма. Термины "матрикс", "гель" и "биоматериалы" используются здесь как синонимы. Термины "матрикс" и "гель" означают композиции, образующиеся при смешивании предшественников. Таким образом, термины "матрикс" и "гель" охватывают все полимерные сети, частично или полностью скрепленные поперечными сшивками. Они могут быть жидкими, полужидкими (в виде пасты) или твердыми. В зависимости от типа предшественников, матрикс может набухать в воде, но не растворяться в ней, т.е. может образовывать гидрогель, который сохраняется в организме в течение какого-то времени.

"Компоненты-предшественники или полимеры природного происхождения" относятся здесь к веществам, встречающимся в природных условиях.

"Несращение" относится здесь к ситуации, когда в течение 3-6 месяцев с момента травмы (в зависимости от типа и локализации перелома кости) ежемесячное рентгеновское исследование не обнаруживает никаких признаков консолидации перелома.

"ПТГ" означает здесь ПТГ_1-84 человека, а также все усеченные, модифицированные и аллельные варианты ПТГ, стимулирующие остеогенез, в частности, будучи включенными в фибриновый матрикс (в предпочтительном варианте осуществления - путем ковалентного связывания). Предпочтительные варианты ПТГ с усеченной аминокислотной последовательностью - ПТГ_1-38, ПТГ_1-34, ПТГ_1-31 и ПТГ_1-25. Наиболее предпочтительный вариант - ПТГ_1-34. В предпочтительном варианте осуществления применяется ПТГ человека, хотя можно, вероятно, применять ПТГ и из других источников, например крупного рогатого скота.

"Пептид слияния ПТГ" означает здесь пептид, содержащий по крайней мере первый и второй домены. Один домен содержит ПТГ, предпочтительно ПТГ_1-34, а другой - субстратный домен, способный к образованию поперечных ковалентных сшивок с матриксом во время или после его образования. Между первым и вторым доменами может также располагаться сайт ферментативной или гидролитической деградации.

"Надкостница" означает здесь внешний слой кости, образующий плотный волокнистый слой, покрывающий всю кость, за исключением участков, участвующих в формировании сустава; он содержит сосудистую сеть и питает внешние слои костной ткани.

"Физиологический" здесь относится к условиям, существующим в организме позвоночных. В частности, физиологическими условиями называют такие характеристики организма человека как температуру и pH. Физиологическими температурами в данном случае называют диапазон температур от 35 до 42°C, главным образом, в районе 37°C.

"Заживление и консолидация переломов костей" означает здесь воссоединение концов костных отломков и восстановление структуры кости.

"Дополненные матриксы" или биоматериалы означают здесь матрикс с включенным в него ПТГ.

I. Дополненные матриксы

А. Материал матрикса

Чтобы ткань восстановилась или регенерировала, на раневую поверхность должны мигрировать клетки, которые затем вырабатывают компоненты внеклеточного матрикса (формируют матрикс), с последующим формированием окончательной структуры ткани. Часто в этой морфогенетической реакции должно участвовать много различных клеточных популяций, нередко при участии сосудистых и нервных клеток. Показано, что матрикс при этом значительно увеличивается в размере и что в некоторых случаях он необходим для осуществления реакции.

Делались попытки разработать матриксы из синтетических или природных материалов или из смеси тех и других. Было обнаружено, что фибриновый матрикс, описанный в международной заявке WO 03/052091, можно применять при лечении переломов костей.

Матрикс формируется в результате поперечных сшивок - ионных, ковалентных, либо тех и других - между молекулами предшественников и/или набухании одного или нескольких полимерных материалов (матриксов) с образованием полимерных сетей, внутри которых остается достаточно пространства для прорастания или миграции в него клеток. В одном из вариантов осуществления матрикс формируют белки, предпочтительно белки, в норме присутствующие в организме пациента, которому имплантирован матрикс. Наиболее предпочтительный белок для матрикса - фибрин, хотя можно применять и матриксы, построенные из других белков, например коллагена и желатина. Для формирования матрикса можно также применять полисахариды и гликопротеиды.

Фибриновые матриксы

Фибрин - природный материал, применяемый для различных целей в медицине и биологических исследованиях. Матриксы, построенные из фибрина, описаны в качестве субстрата для прорастания клеток в патенте США № 6331422, выданном Hubbell et al. Фибрин применяется в качестве пломбировочного материала благодаря его способности связываться со многими тканями и его роли в естественном заживлении ран. Он также применяется в качестве пломбировочного материала для прикрепления трансплантатов сосудов и сердечных клапанов. Кроме того, фибриновые матриксы применяются как устройства точечного введения лекарственных средств и для регенерации нервной ткани. Фибриновый матрикс применяется как механическая основа для регенерации тканей и врастания клеток, но лишь немногие аминокислотные последовательности в его мономере непосредственно стимулируют эти процессы.

Процесс полимеризации фибриногена с образованием фибрина также подробно охарактеризован. Сначала протеаза расщепляет димерную молекулу фибриногена по двум симметричным сайтам. Существует несколько протеаз, способных расщеплять фибриноген: тромбин, пептидаза, протеаза III, - и каждая из них разрезает белковую молекулу по своему сайту. После расщепления фибриногена начинается стадия автополимеризации, на которой мономеры фибрина собираются вместе и образуют полимерный гель с нековалентными поперечными сшивками. Самосборка становится возможной, когда расщепление протеазой открывает доступ к сайтам связывания. Когда сайты связывания в середине молекулы раскрываются, они могут связываться с другими сайтами на концах пептидных цепей фибриногена. Таким образом формируется полимерная сеть. Фактор XIIIa - трансглутаминаза, активируемая при протеолизе фактора XIII тромбином - может затем образовывать ковалентные поперечные сшивки в полимерной сети. Существуют другие трансглутаминазы, возможно, также участвующие в формировании ковалентных поперечных связей и трансплантации в фибриновую сеть.

Когда фибриновый матрикс с поперечными сшивками уже сформирован, последующая деградация жестко контролируется. Одна из ключевых молекул, контролирующих деградацию фибрина, - ингибитор α₂-плазмина. Его эффект опосредован поперечной сшивкой с α-цепью фибрина при воздействии фактора XIIIa. За счет прикрепления ингибитора к матриксу он может накапливаться в матриксе в больших концентрациях. Тогда ингибитор препятствует связыванию плазминогена с фибрином и инактивирует плазмин. Ингибитор α₂-плазмина содержит субстрат - остаток глутамина. Точная аминокислотная последовательность идентифицирована как NQEQVSPL (SEQ ID NO. 2), и первый глутамин в ней служит активным аминокислотным остатком для поперечных сшивок.

Показано, что двухдоменные пептиды, которые содержат последовательность субстрата фактора XIIIa и биологически активную пептидную последовательность, могут встраиваться внутрь фибринового матрикса посредством поперечных сшивок и что этот биологически активный пептид сохраняет свою активность in vitro.

Концентрация тромбина может варьироваться в зависимости от медицинских показаний и веществ, добавляемых в фибриновый матрикс. В одном из предпочтительных вариантов осуществления фибриновый матрикс содержит фибриноген в концентрациях от 5 до 65 мг/мл матрикса, предпочтительно - 15-60 мг/мл матрикса, а в наиболее предпочтительном варианте - 30-45 мг/мл фибринового матрикса. Концентрация тромбина находится в диапазоне от 0,5 до 5 МЕд/мл фибринового матрикса, предпочтительно - 1,25-3,25 МЕд/мл матрикса, а в наиболее предпочтительном варианте - 1,5-2 МЕд/мл фибринового матрикса. Кроме того, источник ионов кальция также помогает формировать фибриновый матрикс. Предпочтительный источник ионов кальция - CaCl₂ · 2H₂O в диапазоне концентраций от 0,5 до 5 мг/мл фибринового матрикса; более предпочтительный диапазон концентраций - 2-3,5 мг/мл матрикса, а наиболее предпочтительный - 2,5-3 мг/мл фибринового матрикса. В этой композиции не учитывается вода, которой смачиваются любые добавляемые в фибриновый матрикс гранулы, эта вода остается в порах гранул в течение всего времени формирования матрикса, и поэтому не участвует в разбавлении и не влияет на концентрации фибриногена и тромбина в фибриновом матриксе. МЕд означает международную единицу (МЕд) тромбина и, по определению, составляет 0,0853 мг тромбина, соответствующего Первому международному стандарту тромбина человека.

Компоненты-предшественники фибриновых матриксов

В предпочтительном варианте осуществления фибриновый матрикс образуется из двух компонентов-предшественников, которые могут применяться в виде растворов. Первый компонент, который, как правило, является раствором, содержит фибриноген в диапазоне концентраций предпочтительно от 10 до 130 мг/мл раствора предшественника (более предпочтительный диапазон концентраций - 50-110 мг/мл раствора, наиболее предпочтительный - 60-90 мг/мл раствора предшественника). Если для образования матрикса нужно добавить тромбин, добавляется второй компонент-предшественник, тоже, как правило, в виде раствора. Этот раствор содержит тромбин в диапазоне концентраций, предпочтительно, от 1 до 10 МЕд/мл раствора предшественника (более предпочтительный диапазон концентраций - 2,5-6,5 МЕд/мл раствора, наиболее предпочтительный - 3-5 МЕд/мл раствора предшественника). Кроме того, один из растворов предшественников содержит источник ионов кальция. Предпочтительный источник ионов кальция - CaCl₂ · 2H₂O в диапазоне концентраций от 1 до 10 мг/мл раствора предшественника; более предпочтительный диапазон концентраций - 4-7 мг/мл раствора, а наиболее предпочтительный - 5-6 мг/мл раствора предшественника. Необязательно, добавляется еще фермент, катализирующий образование матрикса, например, фактор XIIIa. Его предпочтительная концентрация - от 0,5 до 100 МЕд/мл раствора предшественника; более предпочтительный диапазон концентраций - 1-60 МЕд/мл раствора, а наиболее предпочтительный - 1-10 МЕд/мл раствора предшественника.

Б. Сайты прикрепления клеток

Взаимодействие клеток с окружающей средой опосредовано взаимодействиями белков с белками, белков с олигосахаридами или белков с полисахаридами на поверхности клеток. Биологически активные сигналы, получаемые клеткой, связываются белками внеклеточного матрикса. Эта плотная сеть необходима для поддержания жизнедеятельности клеток; известно, что многие белки матрикса регулируют прикрепление, распластывание, миграцию и дифференцировку клеток. Среди наиболее активных белков - ламинин, витронектин, фибронектин, фибрин, фибриноген и коллаген. Ламинин был предметом многочисленных исследований, показавших, что он играет решающую роль в развитии и регенерации нервов in vivo и нервных клеток in vitro, а также в ангиогенезе. Идентифицированы отдельные аминокислотные последовательности, которые непосредственно взаимодействуют с клеточными рецепторами, приводя к адгезии, распластыванию или передаче сигнала.

Обнаружено, что ламинин является полидоменным белком, состоящим из трех аминокислотных цепей с несколькими доменами, связывающими рецепторы. Среди этих доменов - последовательности YIGSR (SEQ ID NO. 1) B1-цепи, LRGDN (SEQ ID NO. 3) A-цепи и PDGSR (SEQ ID NO. 4) B1-цепи ламинина. Идентифицировано также несколько других последовательностей узнавания для клеток. Это, например, IKVAV (SEQ ID NO. 5) A-цепи и RNIAEIIKDI (SEQ ID NO. 6) B2-цепи ламинина. Наиболее предпочтительна последовательность RGD фибронектина.

В более предпочтительном варианте осуществления в матрикс встраивают пептидные сайты адгезии клеток, а именно, пептиды, которые связываются с рецепторами адгезии на поверхности клеток. В число этих рецепторов адгезии входят рецепторы, описанные выше. Особенно предпочтительны последовательности RGD фибронектина и YIGSR (SEQ ID NO. 1) ламинина. Сайты прикрепления клеток могут быть включены в матриксы природного происхождения. Они могут встраиваться, например, за счет смешивания цистеинсодержащего пептида прикрепления клеток с предшественником, молекула которого содержит сопряженную ненасыщенную группу, например, полиэтиленгликоль-акрилат, полиэтиленгликоль-акриламид или полиэтиленгликоль-винилсульфонат. Это может быть сделано незадолго (например, за несколько минут) до смешивания с остатком компонента-предшественника, содержащего нуклеофильную группу, например, тиол-содержащего предшественника. Если сайт прикрепления клетки не содержит цистеина, можно химически синтезировать этот сайт, включив в него цистеин. На этой стадии пептид адгезии встраивают в один из концов молекулы предшественника, обогащенной реакционно-способными группами за счет сопряженной ненасыщенности; когда в систему добавляют компонент с множественными тиоловыми группами, образуется поперечно связанная сеть.

Концентрация сайтов адгезии, находящихся внутри матрикса и ковалентно связанных с ним, может влиять на скорость клеточной инфильтрации. Например, в случае данного гидрогеля, RGD можно включить в матрикс в концентрациях, оптимальных для того, чтобы стимулировать врастание и миграцию клеток. Оптимальный диапазон концентраций таких сайтов адгезии, как RGD, - от 0,04 до 0,05 мМ, предпочтительнее - 0,05 мМ, особенно для матрикса, содержание воды в котором находится в пределах между равновесным и 92 весовыми процентами после окончания поглощения воды.

В. ПТГ

Здесь термин "ПТГ" относится как к последовательности ПТГ_1-84 человека, так и ко всем усеченным, модифицированным и аллельным вариантам ПТГ, стимулирующим остеогенез, будучи ковалентно связанными с биоразлагаемыми природными или синтетическими матриксами. Предпочтительные варианты ПТГ с усеченной аминокислотной последовательностью - ПТГ_1-38, ПТГ_1-34, ПТГ_1-31 и ПТГ_1-25. Наиболее предпочтительным вариантом является ПТГ_1-34. В предпочтительном варианте осуществления применяется ПТГ человека, хотя можно, вероятно, применять ПТГ и из других источников, например, крупного рогатого скота. Для заживления и консолидации переломов костей ПТГ следует применять в диапазоне концентраций от 0,01 до 2 мг/мл матрикса, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса не включена в указанный интервал значений.

Предпочтительный диапазон концентраций ПТГ - от 0,1 до 1,7 мг/мл матрикса, более предпочтительный - от 0,3 до 1,5 мг/мл матрикса и наиболее предпочтительный - от 0,4 до 1,1 мг/мл матрикса, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса не включена в указанный интервал значений. В предпочтительном варианте осуществления применяется фибриновый матрикс.

Г. Пептиды слияния ПТГ

В предпочтительном варианте осуществления ПТГ - это пептид слияния ПТГ, содержащий по меньшей мере два домена, где первый домен содержит ПТГ, а второй домен содержит субстратный домен, способный к образованию поперечных ковалентных сшивок с матриксом во время или после его образования. Субстратный домен является субстратом для фермента. В предпочтительном варианте это субстрат трансглутаминазы ("домен субстрата трансглутаминазы"); в более предпочтительном - тканевой трансглутаминазы ("домен субстрата тканевой трансглутаминазы"), и в самом предпочтительном - фактора XIIIa ("домен субстрата фактора XIIIa"). Трансглутаминазы катализируют реакции переноса ацила между γ-карбоксиламидной группой глутаминовых остатков в молекуле белка и ε-аминогруппой лизиновых остатков, в результате образуются мостики из N-ε-(γ-глутамил)лизиновых изопептидных боковых цепей. Аминокислотная последовательность пептида слияния ПТГ может быть еще доработана: в нее можно включить сайт ферментативного или гидролитического расщепления, который бы позволил высвобождать ПТГ без изменения - или с минимальным изменением - первичной структуры.

Домены субстратов трансглутаминаз, особенно субстратные домены фактора XIIIa, служат для связывания пептидов слияния с матриксами природного происхождения, такими как фибриновый матрикс. В случае применения совместно с фибриновым матриксом, сайт деградации пептида слияния должен быть, в предпочтительном варианте, ферментативно деградируемым, чтобы высвобождение ПТГ регулировалось специфическими для клетки процессами, такими как строго локализованный протеолиз.

Субстратным доменом, образующим поперечные сшивки, может быть GAKDV (SEQ ID NO. 7), KKKK (SEQ ID NO. 8), YRGDTIGEGQQHHLGG (SEQ ID NO. 9) или NQEQVSPL (SEQ ID NO. 2).

Наиболее предпочтительный домен субстрата фактора XIIIa имеет аминокислотную последовательность NQEQVSPL (SEQ ID NO. 2). Ниже он будет обозначаться "ТГ" или "ТГ-ПТГ".

Пептид слияния ПТГ может быть получен путем рекомбинации или химического синтеза. Пептид слияния ПТГ_1-34 предпочтительно получают с помощью химического синтеза.

Домены субстратов трансглутаминаз, удовлетворяющие целям настоящего изобретения, включая их аминокислотные последовательности, подробно описаны в международной заявке WO 03/052091, содержание которой включено в настоящее описание в виде ссылки.

Как здесь отмечалось, в предпочтительном варианте осуществления домен субстрата фактора XIIIa либо непосредственно химически связан с ПТГ_1-34, либо может содержать сайт деградации между ПТГ (первый домен) и последовательностью NQEQVSP (SEQ ID NO. 2) (второй домен). В такой форме пептид слияния ПТГ_1-34 может быть встроен внутрь фибринового матрикса, соединяясь с фибрином через субстрат фактора XIIIa, в процессе коагуляции и высвобождаться в виде ПТГ_1-34.

Сайты деградации позволяют высвобождать ПТГ, почти или совсем не меняя его первичную аминокислотную последовательность, что может повысить активность этого факт