Выделенный пептид, обладающий специфической связывающей анти-gdf-8 антитело активностью, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор экспрессии, клетка-хозяин, способ получения пептида, вакцинная композиция и способ вызывания иммунного ответа анти-gdf-8, способ скрининга для отбора анти-gdf-8 антитела и способ понижающего регулирования активности gdf-8 у животного

Выделенный пептид, обладающий специфической связывающей анти-gdf-8 антитело активностью, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор экспрессии, клетка-хозяин, способ получения пептида, вакцинная композиция и способ вызывания иммунного ответа анти-gdf-8, способ скрининга для отбора анти-gdf-8 антитела и способ понижающего регулирования активности gdf-8 у животного

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка не является предварительной и заявляет приоритет согласно 35 U.S.С. §119(e) на основании предварительной заявки США 60/533719, поданной 31 декабря 2003 г., содержание которой включено в настоящую в своей полноте посредством ссылки.

Изобретение относится к области белкового фактора роста и дифференцировки 8 (далее обозначаемый GDF8), а именно к выделенному пептиду, обладающему связывающей анти-GDF8 антитело активностью, выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, вектору экспрессии, клетке-хозяину, а также к способу получения пептида, вакцинной композиции и способу вызывания иммунного ответа анти-GDF8, способу скрининга для отбора анти-GDF-S антитела и способу понижающего регулирования активности анти-GDF-8 у животного. Таким образом, изобретение рассматривает методы лечения животных с целью модулирования активности фактора роста и дифференцировки 8.

Фактор роста и дифференцировки 8 представляет собой белок, относящийся к суперсемейству трансформирующих факторов роста β (TGF-β). В общем белки суперсемейства TGF-β сначала экспрессируются в виде предшественника (иначе назваемого прогормоном), который подвергается протеолитическому расщеплению по кластерам или основным остаткам приблизительно на расстоянии 110-140 аминокислот от С-конца предшественника. В каждом случае считается, что активные, или зрелые, факторы TGF-β представляют собой дисульфидно-связанный димер отщепленных от предшественника C-концевых областей.

Фактор роста и дифференцировки 8, далее обозначаемый GDF8, также известен в данной области как GDF-8 или миостатин. Гены, кодирующие предшественник GDF8 (далее обозначаемый «предшественник GDF8»), клонированы из широкого ряда организмов. К ним относятся предшественники GDF8 человека и крысы [Nestor et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95:14938-43; Патент США №5827733, содержания которых включены в своей полноте в настоящее описание посредством ссылки]. Также сообщалось, что иммунореактивность GDF8 определяется в скелетных мышцах человека в волокнах типа 1 и типа 2. Антитела и исследования для определения GDF8 описаны, например, в патенте США №6096506.

Также сообщалось, что GDF8 играет роль в понижающем регулировании или ингибировании роста и развития скелетной мышцы, что подтверждено на мышах, нокаутных по GDF8 (McPherron et al., 1997, Nature 387:83-90). По этой причине предпринимались попытки, особенно в области животноводства, различными способами модулировать активность GDF8 в животных с целью понижающего регулирования активности GDF8 для усиления роста и/или относительной мышечной массы различных сельскохозяйственных животных.

Например, в патенте США №6399312 описывается промотор гена предшественника GDF8 и исследование, которое предлагается использовать для идентификации теоретического ингибитора этого промотора. В патенте США №6656475 описан метод ингибирования эффекта GDF8 на клетку путем взаимодействия клетки с продоменом GDF8, который конкурирует за рецептор GDF8, в этой работе сообщается, что С-конец зрелого GDF8 может варьировать. В патенте США №6004937 описано применение фоллистатина как возможного антагониста GDF8. Ни один из этих методов не нашел практического применения в области животноводства или в клинической практике (человека или ветеринарной).

Также предпринимались попытки применения технологии антител и вакцин для понижающего регулирования функции GDF8. Например, в патенте США №6369201 (содержание которого включено в настоящее описание в своей полноте посредством ссылки) описаны пептиды, т.е. фрагменты белка GDF8, и вакцина, вызывающая образование антител анти-GDF8. Также в этом патенте сообщается о неуточненной степени прибавки в росте и весе по сравнению с контролем у грызунов, иммунизированных несколькими из описанных фрагментов пептида GDF8.

Также описаны другие физиологические функции GDF8. Например, в патенте США 6368597 (содержание которого включено в настоящее описание в своей полноте посредством ссылки) предполагается, что ингибирование функции GDF8 применимо в лечении диабета типа II, например, путем введения антител к GDF8 или вакцины против GDF8 пациенту, имеющему данное заболевание.

Задача данного изобретения заключается в предоставлении улучшенных антигенов и иммуногенов, вызывающих ответ анти-GDF-8, а также улучшенных антител к GDF-8, способных высокоспецифично связываться с GDF-8.

Цитирование любых ссылок не должно истолковываться как допущение, что такая ссылка доступна в качестве “Предшествующего уровня техники” для настоящей заявки.

Задача изобретения решается через выделенный пептид, обладающий специфической связывающей анти-GDF8 антитело активностью, состоящий из

(a) аминокислотных остатков с 327 по 346 последовательности SEQ ID NO:1, или

(b) аминокислотных остатков с 327 по 346 последовательности SEQ ID NO:1, содержащие консервативную аминокислотную замену, или

(c) аминокислотных остатков с 327 по 346 последовательности SEQ ID NO:1, содержащие аминокислотную замену в положении, выбираемом из группы, состоящей из остатков 328, 329, 331, 333 и 335, и их комбинаций, причем

(i) аминокислотный остаток 328 представляет собой His, Leu или Asn;

(ii) аминокислотный остаток 329 представляет собой Gln или Lys;

(iii) аминокислотный остаток 331 представляет собой Asn или Ser;

(iv) аминокислотный остаток 333 представляет собой Arg или Lys; и/или

(v) аминокислотный остаток 335 представляет собой Ser, Pro или Thr,

причем в случаях (b) и (c) между аминокислотными остатками с 327 по 346 имеется не более пяти аминокислотных замен, и пептид специфически связывается с моноклональным антителом крысы 788.

Настоящее изобретение восполняет эти и другие недостатки в области техники, обеспечивая пептиды GDF8 (т.е. пептидные фрагменты GDF8, включающие 50 остатков и менее), содержащие специфический нейтрализующий эпитоп для GDF8.

В одном из вариантов осуществления изобретения обеспечены пептиды GDF8, включающие, например, выделенный пептид, содержащий остатки приблизительно с 312 до 361 из природного предшественника GDF8 человека (SEQ ID NO:1). Предпочтительно пептид GDF8 по изобретению содержит остатки приблизительно с 320 по 350, более предпочтительно - остатки приблизительно с 321 по 346 и наиболее предпочтительно - приблизительно с 327 по 346 из природного предшественника GDF8 человека. Пример пептида GDF8, далее обозначаемый DJ5, приведен ниже как в однобуквенной, так и в трехбуквенной кодировке, для удобства нумерация остатков основана на нумерации предшественника GDF8 с последовательностью SEQ ID NO: 1.

DJ5 (SEQ ID NO:8)

327

328

329

330

331

332

333

334

335

336

337

338

339

340

341

342

343

344

345

346

V

H

Q

A

N

P

R

G

S

A

G

P

C

C

T

P

T

K

M

S

Val

His

Gln

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

В следующем варианте осуществления изобретения пептид GDF8 необязательно содержит консервативные единичные аминокислотные замены. В качестве примера, могут быть заменены от одной до, по меньшей мере, пяти аминокислот в пептиде. В конкретном варианте осуществления есть, по меньшей мере, одна консервативная аминокислотная замена, например, между остатками 327 и 346 последовательности GDF8. В другом варианте осуществления пептид GDF8 содержит консервативные аминокислотные замены не более чем в пяти положениях по длине пептида. В еще одном варианте осуществления между остатками 327 и 346 последовательности GDF8 находятся две консервативные аминокислотные замены. В еще одном варианте осуществления между остатками 327 и 346 последовательности GDF8 находятся три консервативные аминокислотные замены. В еще одном варианте осуществления между остатками 327 и 346 последовательности GDF8 находятся четыре консервативные аминокислотные замены.

Предпочтительно замены аминокислотных остатков осуществлены в одном или более положениях по отношению к последовательности природного предшественника GDF8 человека (SEQ ID NO:1), которые отмечены в выравнивании аминокислотных последовательностей разных видов на фиг.2. Это остатки 328, 329, 331, 333 и 335, и их комбинации, причем:

(a) аминокислотный остаток 328 представляет собой His, Leu или Asn;

(b) аминокислотный остаток 329 представляет собой Gln или Lys;

(c) аминокислотный остаток 331 представляет собой Asn или Ser;

(d) аминокислотный остаток 333 представляет собой Arg или Lys и/или

(e) аминокислотный остаток 335 представляет собой Ser, Pro или Thr.

Предпочтительно такие модифицированные пептиды GDF8 содержат специфический нейтрализующий эпитоп для анти-GDF8 антитела и, таким образом, сохраняют свойство специфически связываться с антителом анти-GDF8, причем антитело представляет собой моноклональное антитело mAb 788 и/или фракцию IgG поликлональной сыворотки козы анти-GDF8, как указано в примере ниже.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения описаны молекулы нуклеиновой кислоты, т.е. полинуклеотиды, кодирующие указанные выше пептиды GDF8.

Предпочтительно молекулы нуклеиновой кислоты содержат часть встречающегося в природе гена предшественника GDF8 человека приблизительно от нуклеотида 112 до 1171 (номер в Генбанке Genebank accession NM_005259, ген GDF8 человека; SEQ ID NO:2). Эта часть кодирует пептид DJ5, описанный выше. Следует отметить, что последовательность NM_005259 включает большую последовательность, фланкирующую собственно кодирующую область. Специалисту в данной области техники будет понятно, что DJ5 соответствует нуклеотидам 979-1038 кодирующей области прогормона GDF8.

Также описаны векторы для клонирования и репликации и прокариотические и эукариотические клетки-хозяева, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, а также способы получения пептида GDF8, которые включают следующие этапы: культивирование клеток-хозяев, экспрессирование кодированного пептида и выделение пептида. Специалисту в данной области техники будет понятно, что пептид GDF8 по изобретению также можно получать любым стандартным, известным в данной области химическим методом синтеза.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения описана композиция вакцины, содержащая пептид GDF8 по изобретению (или его слитый белок), например, композиция, предпочтительно содержащая один или более адъювантов и других стандартных в данной области техники элементов вакцинной композиции, основанной на пептиде или белке. Также описаны методы вызывания иммунного ответа анти-GDF8 у животного, включающие введение животному эффективного количества вакцинной композиции.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения описан метод скрининга для селекции антитела анти-GDF8 или фрагмента антитела из множества антител и фрагментов, метод включает контакт пептида с одним или множеством антител или фрагментов антител и детекцию антитела или фрагмента антитела, селективно связывающегося с пептидом.

В еще одном аспекте настоящее изобретение описывает способ понижающей регуляции активности GDF8 у животных. В одном из таких вариантов осуществления способ включает введение животному антитела или фрагмента антитела, причем количество и продолжительность введения эффективны для понижающей регуляции активности GDF8 у животного, при этом антитело специфично связывается с пептидом, или метод включает иммунизацию животного описанной здесь вакцинной композицией. Животное предпочтительно представляет собой позвоночное, более предпочтительно - млекопитающее, птицу или рыбу. Предпочтительно млекопитающее представляет собой домашнее животное (например, используемое в животноводстве, или, как вариант, животное-спутник), но может представлять собой и человека, нуждающегося в таком понижающем регулировании GDF8.

Изобретение также охватывает слитые белки, содержащие пептиды GDF8 по изобретению. Слитые белки могут содержать домены, являющиеся сигнальными пептидами для усиления секреции или экспрессии на клеточной поверхности слитого белка GDF8 и/или для возможности выделения с селективной системой связывания. Также предполагается, что слитые белки связывают один или более пептидов GDF8 в одном белке-носителе для усиления иммуногенности пептидного домена GDF8. В конкретном варианте осуществления слитый белок по настоящему изобретению содержит пептид GDF8, состоящий из 50 или менее аминокислотных остатков, которые включают аминокислотные остатки с 327 по 346 из последовательности SEQ ID NO:1. В связанном варианте осуществления такого типа слитый белок содержит антигенный подфрагмент пептида GDF8, т.е. пептид GDF8, включающий около 10 последовательных аминокислотных остатков из последовательности DJ5 (SEQ ID NO:8).

Краткое описание чертежей

На фиг.1 приведены перекрывающиеся пептиды с DJ1 по DJ7 в активной области GDF8 (т.е. зрелого GDF8), в районе остатков 266-375 последовательности предшественника GDF8.

На фиг.2 приведено выравнивание последовательности пептида DJ5 человека (SEQ ID NO:8) по сравнению с аналогичными пептидами из 20 остатков, находящимися в белках предшественника GDF8 указанных дополнительных видов животных. Положения аминокислотных остатков с 321 по 347 основаны на последовательности предшественника GDF8 человека. Номера в Генбанке (Genebank accession numbers) (включенные в настоящее описание посредством ссылки) идентифицируют полные опубликованные последовательности белков для этих видов.

Пептиды, приведенные в выравнивании, имеют следующие номера последовательностей (SEQ ID NO).

Anas platyrhynchos (утка) AAL35275	(SEQ ID NO: 11)
Anser anser (гусь) AAL35276	(SEQ ID NO: 12)
Anser anser (гусь) AAR 18246	(SEQ ID NO: 13)
Bos taurus (корова) ААВ86687	(SEQ ID NO: 14)
Canis familiaris (собака) AAR 14343	(SEQ ID NO: 15)
Capra hircus (коза) AAR 12161	(SEQ ID NO: 16)
Columba livia (голубь) AAL3 5277	(SEQ ID NO: 17)
Cotumix chinensis (перепел 1) AAL35278	(SEQ ID NO: 18)
Danio rerio (данио рерио) ААВ86693	(SEQ ID NO: 19)
Equus caballus (лошадь) BAB 16046	(SEQ ID NO: 20)
Gallus gallus (цыпленок) ААК18000	(SEQ ID NO: 21)
Gallus gallus (цыпленок) AAR18244	(SEQ ID NO: 22)
Homo sapiens (человек) NP-005250	(SEQ ID NO: 8)
I. punctatus (сом) ААК84666	(SEQ ID NO: 23)
Lepus capensis (заяц) ААК87890	(SEQ ID NO: 24)
Macaca fascicularis (обезьяна) AAL 17640	(SEQ ID NO: 25)
Meleagris gallopavo (индейка) ААВ 86692	(SEQ ID NO: 26)
Morone chrysops (белый окунь) ААК 28707	(SEQ ID NO: 27)
Mus musculus (домовая мышь) ААС 53167	(SEQ ID NO: 28)
O. mykiss (форель) ААК 71707	(SEQ ID NO: 29)
Ovis aries (овца)ААВ86689	(SEQ ID NO: 30)
Papio hamadryas (бабуин)ААВ86686	(SEQ ID NO: 31)
Rattus norvegicus (крыса)ААВ86691	(SEQ ID NO: 32)
Salrno salar (лосось) САС1 9541	(SEQ ID NO: 33)
Sparus aurata (лещ)AAL05943	(SEQ ID NO: 34)
Sus scrofa (свинья)ААС08035	(SEQ ID NO: 35)
Sus scrofa (свинья) AAR18245	(SEQ ID NO: 36)

Настоящее изобретение идентифицирует домены GDF8, служащие специфическим нейтрализующим эпитопом для поликлональной сыворотки козы анти-GDF8 и для других конкретных специфических антител анти-GDFS. Эти эпитопы также служат для получения фрагментов белка GDF8, применимых для вызывания активного и специфического иммунного ответа против белков GDF8, как in vitro, например, для детекции белка GDF8, так и in vivo, для понижающего регулирования активности GDF8. Эти фрагменты в общем обозначают как пептиды или пептидные фрагменты GDF8. Применение этих пептидов GDF8 включает использование их в качестве иммуногенов для вызывания анти-GDFS иммунного ответа у животных и использование в качестве высокоспецифичных мишеней, связывающихся с антителом, в исследованиях, включающих GDF8.

Специфически связывающиеся эпитопы GDF8 идентифицировали при взаимодействии антисыворотки к GDF8 с набором перекрывающихся пептидов GDF8 и определении степени связывания между пептидами и антителами IgG антисыворотки. Антисыворотку к GDF8 получали от козы, иммунизированной белком предшественника GDF8 со структурой, оптимизированной для экспрессии и антигенности.

Для более полного понимания настоящего изобретения приведены следующие определения. Единственное число при описании терминов используется для удобства и не должно рассматриваться как ограничение. Так, например, ссылка на композицию, содержащую «полипептид», означает ссылку на один или более таких полипептидов.

В настоящем описании термин «приблизительно» используется взаимозаменяемо с термином «около» и означает, что величина находится в 20%-ном интервале от указанной, т.е. пептид, содержащий «приблизительно» 50 аминокислотных остатков, может содержать от 40 до 60 остатков.

Также следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными конфигурациями, этапами процесса и материалами, описанными здесь, так как конфигурации, этапы процесса и материалы могут варьировать. Также следует понимать, что используемая терминология применяется только с целью описания конкретных вариантов осуществления и не должна рассматриваться как ограничивающая, так как объем настоящего изобретения ограничивается только прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

В настоящем описании термин «полипептид» используется взаимозаменяемо с термином «белок» и означает полимер, содержащий две или более аминокислоты, связанные пептидными связями. В настоящем описании предпочтительно, если не указано иначе, термин «полипептид» отличается от термина «пептид» по размеру или длине цепи, причем термин «пептид» относится к цепи полимера из приблизительно 50 или менее аминокислот, а термин «полипептид» или «белок» относится к цепи полимера, содержащей приблизительно более 50 аминокислот. При необходимости, в пептиде или полипептиде могут отсутствовать определенные аминокислотные остатки, кодируемые геном или мРНК. Например, ген или молекула мРНК могут кодировать последовательность аминокислотных остатков на N-конце полипептида (т.е. сигнальную последовательность), которая отщепляется и, таким образом, не может быть частью конечного белка.

Согласно настоящему изобретению «пептид GDF8» является относительно коротким фрагментом, полученным из белка GDF8. Даже субфрагменты таких пептидов могут называться пептидами GDF8. Без ограничения максимального размера пептида GDF8 по изобретению предпочтительно, чтобы максимальный размер пептида составлял около 50 остатков, более предпочтительно - максимально около 40 остатков, еще более предпочтительно - максимально около 30 остатков и наиболее предпочтительный максимальный размер - около 25 остатков. В общем, предпочтительный размер пептида GDF8 составляет приблизительно от 10 до 50 аминокислотных остатков, более предпочтительно - приблизительно от 15 до 30 остатков и, в частности, около 20 аминокислотных остатков. Пептиды GDF8, являющиеся меньшими субфрагментами других пептидов GDF8 по настоящему изобретению, например, пептид GDF8, содержащий около 10 последовательных аминокислотных остатков из последовательности DJ5 (SEQ ID NO:8), предпочтительно содержат антигенную часть (например, эпитоп) большего пептида GDF8.

В конкретном варианте осуществления пептид GDF8 содержит пептидный домен, приблизительно на 50-100% гомологичный пептиду, определяемому остатками 327-346 (SEQ ID NO:8) из последовательности природного предшественника GDF8 человека (SEQ ID NO:1). Указанные вариации в гомологии предпочтительно представляют собой консервативные замены и/или вариации, сохраняющие антигенную структуру по изобретению, специфически распознаваемую определенными специфическими антителами к GDF8. Эти консервативные замены представляют собой замены, приведенные в сравнении межвидовой гомологии (например, на фиг.2), сохраняющие функцию GDF8 и/или представляют собой замены между аминокислотами аналогичной химической (например, физической) и электронной структуры, сохраняющие и/или оптимизирующие специфичность связывания пептидов GDF8 по изобретению с антителом. Примерами таких консервативных аминокислотных замен являются: замена одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой или замена одного полярного остатка эквивалентного заряда на другой, например замена аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин.

В частности, пептид GDF8 по изобретению также включает специфический нейтрализующий эпитоп для антитела к GDF8, т.е. эпитоп или антигенный домен, который специфически связывается с поликлональным антителом IgG анти-GDF8 сыворотки козы (PGA), описанном в примерах ниже, и/или специфически связывается с коммерчески доступным моноклональным крысиным антителом («mAb») Cat. No. MAB788 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN).

В настоящем описании термины "очищенный" или "выделенный" относятся к материалам, выделенным в условиях, которые снижают или исключают присутствие нежелательных материалов, т.е. примесей, включая природные материалы, из которых требуемый материал получают. Например, очищенный или выделенный белок предпочтительно свободен от других белков или нуклеиновых кислот, с которыми он находится в клетке. Очищенный материал может содержать менее около 50%, предпочтительно менее около 75% и наиболее предпочтительно менее около 90% клеточных компонентов, с которыми он исходно связан. Чистоту можно оценить методами хроматографии, гель-электрофореза, иммунологического анализа, структурного анализа, биологического анализа и другими методами, известными в данной области техники. С точки зрения функциональности выделенный пептид GDF8 по настоящему изобретению - это пептид, достаточно отделенный от других материалов, включая предшественник белка GDF8 и/или зрелый белок GDF8, так, что он способен вызывать иммунный ответ, специфичный для пептида GDF8.

Методы очистки хорошо известны в данной области техники. Например, нуклеиновые кислоты можно очищать преципитацией, хроматографией, ультрацентрифугированием и другими методами. Белки и полипептиды, а также пептиды, можно очищать различными методами, включая, без ограничения, препаративный диск-гель электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, ВЭЖХ (высокоэффективную жидкостную хроматографию), обращено-фазовую ВЭЖХ, гель-фильтрацию, ионообменную и распределительную хроматографию, преципитационную и высаливающую хроматографию, экстракцию и противоточное распределение. Для некоторых целей предпочтительно получать полипептид в рекомбинантной системе, в которой белок содержит дополнительную последовательность tag, облегчающую выделение, такую как, без ограничения, последовательность полигистидина или последовательность, специфически связывающуюся с антителом, такую как FLAG® или GST (глутатион-S-трансфераза). Полипептид можно выделить из неочищенного лизата клетки-хозяина методом хроматографии или на соответствующей твердофазной матрице. Иначе, в качестве агентов для выделения можно использовать полученные к полипептиду антитела или их связывающиеся фрагменты.

Термин "по существу чистый" означает высшую степень чистоты, которая может быть достигнута при использовании традиционных методов очистки, известных в данной области техники, и означает нуклеиновую кислоту, полипептид, пептид или другой материал, свободный от других примесных белков, нуклеиновых кислот и других биологических материалов, полученных из организма-источника или системы экспрессии рекомбинантной ДНК. Практическую чистоту можно оценить стандартными методами, обычно эта величина превышает, по меньшей мере, 75%, предпочтительно превышает, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно превышает, по меньшей мере, 95% и наиболее предпочтительно превышает, по меньшей мере, 99%. Оценку чистоты можно проводить на массовой или молярной основе.

Термин "полинуклеотид" или "молекула нуклеиновой кислоты" означает молекулу, содержащую нуклеотиды, включая, без ограничения, последовательности РНК, кДНК, геномной ДНК и даже синтетической ДНК. Термины также охватывают молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие любые известные в данной области аналоги оснований ДНК и РНК.

Термин "вектор" или "вектор репликации" означает репликон, такой как плазмида, фаг или космида, к которому можно присоединить или встроить сегмент другой ДНК так, чтобы обеспечить репликацию присоединенного сегмента. Термин подразумевает также репликон, содержащий встроенный или присоединенный требуемый сегмент ДНК.

Векторы, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают микробные плазмиды, вирусы, бактериофаги, интегрируемые фрагменты ДНК и другие носители, которые могут способствовать интеграции нуклеиновых кислот в геном хозяина. Наиболее широко применяемой формой вектора являются плазмиды, но подходят для использования также все другие формы векторов, имеющие эквивалентную функцию и известные в данной области техники. См., например, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, и Supplements, Elsevier, N.Y., и Rodriguez et al. (eds.), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, MA.

Встройку ДНК, кодирующей пептид(ы) GDF8 по изобретению, в вектор легко осуществить, если концы ДНК и вектора содержат совместимые сайты рестриктаз. Если это невозможно осуществить, то может понадобиться модифицировать концы ДНК и/или вектора путем отщепления одноцепочечных концов ДНК, образованных эндонуклеазой рестрикции, для получения "тупых" концов; или того же результата можно достичь достраиванием одноцепочечных концов при помощи соответствующей ДНК-полимеразы. Иначе, требуемые сайты можно получить, например, лигированием нуклеотидных последовательностей (линкеров) с концами. Такие линкеры могут содержать специфические олигонуклеотидные последовательности, определяющие сайты требуемых рестриктаз. Сайты рестрикции можно также получить при использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР), см., например, Saild et al., Science 239:487 (1988). Расщепленный вектор и фрагменты ДНК можно также модифицировать, при необходимости, методом гомополимерного наращивания.

Векторы для рекомбинантной экспрессии, используемые в настоящем изобретении, обычно являются самореплицирующимися конструкциями ДНК или РНК, содержащими нуклеиновые кислоты, кодирующие один из пептидов GDF8 по изобретению, обычно оперативно связанные с элементами для соответствующего генетического контроля, способными регулировать экспрессию нуклеиновых кислот в совместимых клетках-хозяевах. Элементы генетического контроля могут включать прокариотическую промоторную систему или эукариотическую промоторную систему контроля экспрессии и обычно содержат промотор транскрипции, необязательно - оператор для контроля начала транскрипции, энхансеры транскрипции для повышения уровня экспрессии мРНК, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания с рибосомой, и последовательности, терминирующие транскрипцию и трансляцию. Векторы экспрессии также могут содержать сайт начала репликации, позволяющий вектору реплицироваться независимо от клетки хозяина.

Экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих пептид(ы) GDF8 по изобретению, можно осуществлять традиционными методами либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках.

Термин "кодирующая последовательность" ДНК или "последовательность ДНК, кодирующая" определенный белок или пептид, означает последовательность ДНК, которая транскрибируется и транслируется в полипептид in vitro или in vivo, будучи помещенной под контроль соответствующих регуляторных элементов. Границы кодирующей последовательности определяются старт-кодоном на 5'-конце и кодоном окончания трансляции на 3'-конце. Кодирующая последовательность может содержать, без ограничения, прокариотические последовательности, кДНК из эукариотических мРНК, геномные последовательности из ДНК эукариот (например, млекопитающих) и даже синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции обычно расположены на 3'-конце кодирующей последовательности.

В настоящем описании термины "слитый белок" и "слитый пептид" используются взаимозаменяемо для обозначения "химерных белков и/или химерных пептидов" и слитых "интеиновых белков/пептидов". Слитый белок содержит, по меньшей мере, часть пептида GDF8 по настоящему изобретению, связанную пептидной связью с, по меньшей мере, частью другого белка. Например, слитые белки могут содержать маркерный белок или пептид, или белок или пептид, способствующий выделению и/или очистке и/или антигенности пептида GDF8 по настоящему изобретению. Слитый белок GDF8 может содержать, по меньшей мере, часть белка, не являющегося GDF8, соединенную пептидной связью с, по меньшей мере, частью полипептида GDF8. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения часть GDF8 является функциональной, т.е. сохраняет антигенность. Последовательности, отличные от GDF8, могут находиться с амино- или карбоксиконца последовательностей GDF8.

Рекомбинантная молекула ДНК, кодирующая такой слитый белок, содержит последовательность, кодирующую, по меньшей мере, часть белка, не являющегося GDF8, соединенную в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей GDF8, такая молекула может кодировать сайт для расщепления определенной протеазой, например тромбин или Фактор Ха, предпочтительно непосредственно в сайге соединения последовательностей GDF8 и не-GDFS или около него. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок экспрессируется в клетках СНО. Такой слитый белок можно использовать для выделения пептидов GDF8 по настоящему изобретению путем использования аффинных колонок, специфических к белку и/или метке (tag), слитой с пептидом GDF8. Очищенный пептид GDF8 затем, например, можно выделить из слитого белка при использовании протеолитического фермента и сайта расщепления, таких как упомянуты выше.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения можно получить химерный пептид GDF8, например белок, слитый с глутатион-S-трансферазой (GST), слитый с белком, связывающимся с мальтозой (МВР), или слитый с полигистидиновой меткой, для экспрессии в любой клетке или, как вариант, в бесклеточной системе. Например, GST связывается с глутатионом, связанным с матриксом твердой подложки, МВР связывается с мальтозным матриксом, а полигистидин хелатируется с матриксом N-хелатной подложки. Слитый белок можно элюировать со специфического матрикса при использовании соответствующих буферов или обработкой протеазой, специфической к сайту расщепления, обычно конструируемому между пептидом GDF8 и гибридным партнером (например, GST, МВР, FLAG®), как указано в примерах ниже, или поли-His, как описано выше.

Термин "гетерологичная нуклеотидная последовательность" в настоящем описании обозначает нуклеотидную последовательность, присоединяемую к нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению методами рекомбинации для получения нуклеиновой кислоты, которая не образуется в природе. Такие нуклеиновые кислоты могут кодировать слитые (например, химерные) белки. Таким образом, гетерологичная нуклеотидная последовательность может кодировать пептиды и/или белки, имеющие регуляторные и/или структурные свойства. В другом варианте осуществления настоящего изобретения гетерологичная нуклеотидная последовательность может кодировать белок или пептид, служащий для детекции белка или пептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению после экспрессии нуклеиновой кислоты. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения гетерологичная нуклеотидная последовательность может функционировать как средство детекции нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению. Гетерологичная нуклеотидная последовательность может содержать некодирующие последовательности, включая сайты рестрикции, регуляторные сайты, промоторы и подобные элементы.

"Клетка-хозяин" - это клетка, которая содержит или способна содержать и экспрессировать, временно или постоянно, молекулу экзогенной нуклеиновой кислоты. Клетка называется "трансформированной" экзогенной ДНК, если такая ДНК была введена внутрь клетки, ограниченной мембраной. Экзогенная ДНК может быть или не быть интегрирована (ковалентно связана) в хромосомную ДНК, составляющую геном клетки хозяина. Например, в прокариотах и дрожжах экзогенная ДНК может содержаться в виде эписомного элемента, такого как плазмида. По отношению к эукариотическим клеткам стабильно трансформированная клетка - это клетка, в которой экзогенная ДНК интегрирована в хромосому таким образом, что она наследуется дочерними клетками через репликацию хромосомы. Такая стабильность демонстрируется способностью эукариотической клетки установить клеточные линии или клоны, содержащие популяцию дочерних клеток, содержащих экзогенную ДНК.

К прокариотам относятся как грамположительные, так и грамотрицательные организмы, например Е.coli and В.subtilis. К высшим эукариотам относятся устойчивые культуры клеточных линий из клеток животных, как не млекопитающих, т.е. клетки насекомых и птиц, так и млекопитающих, т.е. человека, приматов и грызунов.

К системам "прокариотический хозяин - вектор" относится широкий спектр векторов для многих различных видов. В настоящем описании Е.coli и ее векторы используются для общего обозначения эквивалентных векторов, используемых в других прокариотах. Типичным вектором для амплификации ДНК является pBR322 или многие ее производные. К векторам, которые можно использовать для экспрессии GDF8 и/или пептидов GDF8, относятся, без ограничения, векторы, содержащие lac промотор (серия pUC); trp промотор (pBR-trp); Ipp промотор (серия pIN); lambda-pP или pR промоторы (pOTS); или гибридные промоторы, такие как ptac (pDR540). См. Brosius et al., "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", in Rodriguez and Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, pp.205-236.

Дрожжи, а также клеточные культуры клеток высших эукариот, являются предпочтительными хозяевами для рекомбинантного получения пептидов GDF8 по изобретению и/или антител к GDF8 и/или фрагментов этих антител. Хотя можно использовать любую линию культуры клеток высших эукариот, включая системы экспрессии бакуловируса насекомых, предпочтительными являются клетки млекопитающих. Трансформация или трансфекция и размножение таких клеток стали рутинной процедурой. Примерами применимых клеточных линий являются клетки HeLa, линии клеток яичника китайских хомячков (СНО), линии клеток почки молодых крыс (BRK), линии клеток насекомых, линии клеток птиц и линии клеток обезьян (COS).

Векторы для экспрессии в таких линиях обычно содержат, например, сайт начала репликации, промотор, сайт инициации трансляции, сайты сплайсинга РНК (если используется геномная ДНК), сайт полиаденилирования и сайт терминации транскрипции. Эти векторы также обычно содержат ген для селекции или ген для амплификации. Подходящими для экспрессии векторами могут быть плазмиды, вирусы или ретровирусы, несущие промоторы, происходящие, например, из таких источников, как аденовирусы, SV40, парвовирусы, вирус осповакцины или цитомегаловирус. Типичными примерами подходящих векторов для экспрессии являются pCR®3.1, pCDNA1, pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol. 5:1136 (1985)], pMC1neo Poly-A [Thomas et al., Cell 57:503 (1987)], pUC19, pREP8, pSVSPORT и их производные, и векторы на основе бакуловируса, такие как рАС 373 или рАС 610.

Обычно используемые прокариотические последовательности для контроля экспрессии включают промоторы, включая промоторы, полученные из промоторных систем β-лактамазы и лактозы [Chang et al., Nature, 795:1056 (1977)], триптофановой (trp) промоторной системы [Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 5:4057 (1980)], промоторной системы lambda PL [Shimatake et al., Nature, 292:128 (1981)], и tac промотор [De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292:128 (1983)]. В данной области техники известно и коммерчески доступно множество таких векторов для экспрессии.

Термин "оперативно связанный" относится к организации элементов, при которой описываемые компоненты сконфигурированы таким образом, чтобы выполнять их обычные функции. Так, контролирующие элементы, оперативно связанные с кодирующей последовательностью, способны влиять на экспрессию кодирующей последовательности. Контролирующие элементы не должны быть обязательно непосредственно соединенными с кодирующей последовательностью, до тех пор, пока они функционируют для направления экспрессии. Так, например, между промотором и кодирующей последовательностью могут находиться нетранслируемые, но транскрибируемые последовательности, и промотор все равно считается "оперативно связанным" с кодирующей последовательностью.

Изобретение включает также поликлональные и моноклональные