Способ получения эритроцитарного антигенного гистоплазмозного и кокцидиоидомикозного диагностикума

Способ получения эритроцитарного антигенного гистоплазмозного и кокцидиоидомикозного диагностикума

Реферат

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к производству диагностикумов, используемых для выявления антител к возбудителям гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза в реакции непрямой гемагглютинации.

Для определения антител к возбудителям особо опасных микозов известны диагностикумы, приготовленные с применением бараньих эритроцитов, обработанных танином [1, 4], с последующей конъюгацией их с полисахаридным антигенным комплексом, выделенным из клеток микромицетов бета-нафтольным методом [2].

1. Наиболее близким аналогом является препарат, описанный в статье Липницкого А.В. с соавт. [1] (прототип).

Однако известные препараты отличает относительно низкая стабильность, недостаточная воспроизводимость способа приготовления диагностикума, а также трудоемкость и длительность процесса выделения антигенов из клеточной массы грибов - возбудителей особо опасных микозов [2].

На сегодняшний день остается актуальным создание высокочувствительных эритроцитарных диагностикумов, пригодных для применения в условиях чрезвычайных ситуаций.

Цель изобретения - выделение антигенного комплекса, не требующего дополнительных этапов очистки, общего для возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, и создание на его основе антигенного эритроцитарного диагностикума, характеризующегося стабильностью и воспроизводимостью получаемых результатов.

Поставленная цель достигается за счет использования в качестве сенситина не полисахаридных антигенов, экстрагированных из клеточной массы грибов (см. прототип), а экстрацеллюлярного комплекса, общего для возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, способ выделения которого и сенсибилизация им эритроцитов характеризуются тем, что для оптимального образования и выделения экстрацеллюлярных антигенов культуру H.capsulatum G185 Р в мицелиальной фазе роста культивируют на синтетической безбелковой солевой среде Смита при температуре 28°С в течение 3 месяцев, после чего биомассу отделяют фильтрованием через ватно-марлевые фильтры и стерилизуют через мембранные фильтры, осуществляют контроль стерильности, а затем осаждают находящиеся в среде культивирования антигены охлажденным до -20°С двух-трехкратным объемом ацетона; полученный осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают при тех же соотношениях новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают при 37°С, определяют оптимальную сенсибилизирующую дозу выделенного антигена и используют последний при получении эритроцитарного диагностикума.

Полученный антиген не требует лиофилизации, относительно легко поддается точному дозированию, не содержит остатков дезинфицирующих средств, длительно хранится без потери серологической активности и обеспечивает высокую воспроизводимость метода. Таким образом, единовременно приготовленный в достаточном количестве экстрацеллюлярный антигенный комплекс может обеспечить получение стандартного диагностикума со стабильными свойствами в течение ряда лет.

В качестве жидкой питательной среды культивирования используют синтетическую солевую среду Смита [3]. Такой бульон не содержит в своем составе белково-пептонных компонентов питательной среды, что позволяет получить экстрацеллюлярный антиген для его дальнейшего использования без дополнительных этапов очистки. Сухой антиген для сенсибилизации растворяют в 0,01 М фосфатно-буферном растворе, рН 5,9. Коньюгацию проводят на водяной бане при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч при постоянном перемешивании. Фиксацию осуществляют добавлением 1 об.% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин. Данные параметры оптимизируют сенсибилизацию эритроцитов, улучшают качество препарата и, в конечном итоге, повышают чувствительность РИГА.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение антигенного комплекса из культурального фильтрата H.capsulatum G185P. Культивирование штамма проводят в синтетической солевой среде Смита, приготовленной по следующей прописи:

1. L-аспаргин	7,0 г
2. Хлористый аммоний	7,0 г
3. Калий фосфорнокислый однозамещенный	1,31 г
4. Цитрат натрия	0,9 г
5. Магний сернокислый	1,5 г
6. Железо лимоннокислое	0,3 г
7. Глюкоза	10 г
8. Глицерин	25 г
9. Вода	до 1 л

Среду стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15 минут.

Приготовленную среду разливают по 600-800 мл в бактериологические матрацы, куда вносят культуру H.capsulatum G185P в мицелиальной фазе роста 5 мл в концентрации 5-10×10⁶ м.т./мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им Л.А.Тарасевича. Матрацы в горизонтальном положении инкубируют в термостате при 26-28°С в течение 3 месяцев. Биомассу отделяют от среды методом фильтрования через ватно-марлевый и мембранный стерилизующий фильтры. После проведения контроля стерильности комплекс антигенов осаждают из фильтрата путем добавления к последнему 2-3 объемов охлажденного до -20°С ацетона. Осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают в термостате при 37°С.

Полученный сухой антигенный комплекс используют при определении оптимальной сенсибилизирующей дозы антигена и получения диагностикума.

Пример 2. Приготовление диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного. Определение оптимальной сенсибилизирующей дозы антигенного комплекса.

Определение оптимальной сенсибилизирующей дозы антигенного комплекса проводят с использованием формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Осадок, полученный из 5 мл 2,5% взвеси эритроцитов, суспендируют в таком же объеме 0,01 М фосфатно-буферного раствора, рН 5,9, в который добавлены навески 50, 100, 200, 400 мкг/мл сухого антигенного комплекса соответственно. Коньюгацию проводят на водяной бане при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч при постоянном перемешивании. Фиксацию осуществляют добавлением 1 об.% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин. После трехкратного отмывания эритроциты доводят до концентрации 2,5 об.% в 0,15 М растворе хлористого натрия, рН 7,2, и используют в реакции непрямой гемагглютинации. Оптимальная сенсибилизирующая доза составила 100 мкг/мл, которая обусловливала чувствительность РИГА с контрольной гистоплазмозной сывороткой серии 2-1 в титрах 1:20480 с четкими отрицательными контролями.

Приготовление рабочих серий диагностикума проводят по вышеописанной методике при больших объемах реагентов. При этом оптимальную сенсибилизирующую дозу увеличивают в 2 раза (до 200 мкг/мл). Полученный диагностикум расфасовывают в ампулы в виде суспензии 10 об.% в протективной среде высушивания и подвергают лиофилизации.

Пример 3. Определение специфической активности диагностикума

Гистоплазмозные и кокцидиоидомикозные козьи иммунные сыворотки получали путем многоцикловой иммунизации продуцентов. Антигенами для иммунизации служили обеззараженные клетки мицелиальной фазы возбудителей H.capsulatum и C.immitis. При постановке РИГА сыворотки разводили 1:10 0,15 М раствором натрия хлорида, титровали двукратным шагом в объеме 0,4 мл в 1 об.% НКС и вносили одну каплю 2,5 об.% взвеси диагностикума. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Данные таблицы свидетельствуют о возможности применения диагностикума для определения уровня антител в иммунных сыворотках как к возбудителю гистоплазмоза (в титре до 1:40960), так и к возбудителю кокцидиоидомикоза (при некотором снижении титра).

Пример 4. Определение специфичности диагностикума

Для оценки специфичности были использованы иммунные сыворотки лабораторных животных (баранов, козлов, лошади), содержащие антитела к возбудителям сапа, мелиоидоза, чумы, а также сыворотки людей, больных микотическими инфекциями (кандидозом или инвазивным аспергиллезом), и нормальная сыворотка человека.

Гетерологичные сыворотки разводили 1:10 с помощью 0,15 М раствора натрия хлорида, титровали двукратным шагом в объеме 0,4 мл и использовали для постановки РИГА в макроварианте. Полученные результаты представлены в таблице 2 и свидетельствуют о том, что диагностикум, изготовленный по предложенному способу, способен выявлять группоспецифические антитела к возбудителям гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза в титре от 1:160 и выше. Титры с более высокой концентрацией до 1:80 обусловлены перекрестно реагирующими антителами к гетерологичным антигенам, не имеющим диагностического значения.

Источники информации

1. Липницкий А.В., Валькова Е.Р., Вальков Б.Г. Разработка и применение реакции пассивной гемагглютинации и реакции нейтрализации антител при глубоких микозах. / Диагностика особо опасных инфекций. - Ростов на Дону. - 1968. - С.54-57 (прототип).

2. Дроздов А.И. Методы выделения антигенов из патогенных грибов (Методическое пособие). - Ленинград, 1971, 33 с.

3. Smith CD. Nutritional factors that are requaired for the grows and sporulation of Histoplasma capsulatum. / In ′Histoplasmosis′. Proceeding of the Suond national conference / Ed. By A. Balows. - Springfild. - 1971. - P.64-70.

4. Валькова E.P., Липницкий A.B. Серологические показатели при экспериментальных глубоких микозах. // Ж. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 1970. - №12. - С.55-59.

Таблица 1
Результаты определения специфической активности диагностикума
№ п/п	№ продуцента	Серия (цикл иммунизации)	Вид сыворотки	Серия диагностикума	Титр в РИГА	Контроль
1	2	1	Гистоплазмозная	2	1:40960	-
			3	1:20480	-
			4	1:20480	-
2	2	3	Гистоплазмозная	2	1:5120	-
			3	1:1280	-
			4	1:5120	-
3	2	4	Гистоплазмозная	2	1:10240	-
			3	1:5120	-
			4	1:10240	-
4	16	1	Гистоплазмозная	2	1:2560	-
			3	1:2560	-
			4	1:2560	-
5	16	2	Гистоплазмозная	2	1:10240	-
			3	1:2560	-
			4	1:10240	-
6	16	3	Гистоплазмозная	2	1:10240	-
			3	1:5120	-
			4	1:10240	-
7	18	1	Гистоплазмозная	2	1:5120	-
			3	1:2560	-
			4	1:2560	-
8	18	3	Гистоплазмозная	2	1:40960	-
			3	1:5120	-
			4	1:10240	-
9	18	5	Гистоплазмозная	2	1:40960	-
			3	1:20480	-
			4	1:20480	-
10	20	1	Гистоплазмозная	2	1:1280	-
			3	1:1280	-
			4	1:1280	-
	20	2	Гистоплазмозная	2	1:5120	-
11			3	1:1280	-
			4	1:2560	-
12	20	3	Гистоплазмозная	2	1:1280	-
			3	1:320	-
			4	1:2560	-
13	1	1	Кокцидиоидомикозная	2	1:1280	-
			3	1:320	-
			4	1:1280	-
14	1	3	Кокцидиоидомикозная	2	1:640	-
3	1:320	-
4	1:640	-

Продолжение таблицы 1
№ п/п	№ продуцента	Серия(цикл иммунизации)	Вид сыворотки	Серия диагностикума	Титр в РНГА	Контроль
			Кокцидиоидомикозная	2	1:320	-
15	1	4	3	1:160	-
			4	1:320	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:10240	-
16	9	1	3	1:5120	-
			4	1:5120	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:5120	-
17	9	5	3	1:2560	-
			4	1:5120	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
18	9	10	3	1:640	-
			4	1:1280	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:640
19	9	15	3	1:320	-
			4	1:2560	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
20	9	20	3	1:640	-
			4	1:1280	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
21	17	1	3	1:640	-
			4	1:1280	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
22	17	3	3	1:1280	-
			4	1:2560	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
23	17	6	3	1:640	-
			4	1:1280	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
24	19	1	3	1:640	-
			4	1:1280	-
Условные обозначения: - отрицательный результат РИГА.
Примечание. Данные взяты из таблиц «Акта комиссионных испытаний диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного сухого», ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора от 05 июня 2009 г.

Таблица 2
Результаты определения специфичности диагностикума
№ п/п	№ продуцента	Серия (цикл иммунизации)	Вид сыворотки	Серия диагностикума	Титр в РНГА	Контроль
	5574 (козел)		Мелиоидозная	2	1:80	-
1	2	3	1:40	-
		4	1:80	-
	5 (козел)		Мелиоидозная	2	1:40	-
2		14	3	1:20	-
			4	1:40	-
	7 (козел)		Мелиоидозная	2	1:20	-
3		21	3	-	-
			4	1:20	-
	6518 (баран)		Сапная	2	-	-
4	4	3	-	-
		4	-	-
	6518 (баран)		Сапная	2	-	-
5	12	3	-	-
		4	-	-
	2801 (козел)		Сапная	2	-	-
6	9	3	-	-
		4	-	-
	10 (баран)		Чумная	2	1:40	-
7		4	3	1:20	-
			4	1:40	-
	10 (баран)		Чумная	2	-	-
8		9	3	-	-
			4	-	-
	Кокетка (лошадь)	коммерческая	Чумная	2	1:20	-
9	3	-	-
	4	-	-
	Сыворотка больного	Клинич. диагноз: кандидоз	2	40	-
10	3	20	-
	4	40	-
	Сыворотка больного	Клинич. диагноз: кандидоз	2	40	-
11	3	1:20	-
	4	1:40	-
	Сыворотка больного	Клинич. диагноз: кандидоз	2	1:20	-
12	3	1:20	-
	4	1:20	-
	Сыворотка больного	Клинич. диагноз: аспергиллез	2	1:20	-
13	3	1:20	-
	4	1:20	-
	Нормальная сыворотка человека	-	2	1:20	-
14	3	-	-
	4	1:20	-
Условные обозначения: - отрицательный результат РНГА.
Примечание. Данные взяты из таблиц «Акта комиссионных испытаний диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного сухого» ФГЗУ Волгоград НИПЧИ Роспотребнадзора от 05 июня 2009 г.

1. Способ получения эритроцитарного антигенного гистоплазмозного и кокцидиоидомикозного диагностикума, включающий выделение антигенного комплекса и сенсибилизацию им эритроцитов, отличающийся тем, что для оптимального образования и выделения экстрацеллюлярных антигенов культуру H.capsulatum G185 Р в мицелиальной фазе роста культивируют на синтетической безбелковой солевой среде Смита при температуре 28°С в течение 3 мес., после чего биомассу отделяют фильтрованием через ватно-марлевые фильтры, стерилизуют через мембранные фильтры, после чего осуществляют контроль стерильности и затем осаждают находящиеся в среде культивирования экстрацеллюлярные антигены охлажденным до -20°С двух-трехкратным объемом ацетона, полученный осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают при тех же соотношениях новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают при 37°С, определяют оптимальную сенсибилизирующую дозу выделенного антигена и используют его для получения эритроцитарного диагностикума.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сенсибилизацию эритроцитов проводят в 0,01 М фосфатно-буферном растворе рН 5,9 при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч с последующей фиксацией путем добавления в реакционную смесь 1 об.% формалина с инкубацией в течение 30 мин.