Композиции и способы, связанные с растворимыми сопряженными с g-белком рецепторами (sgpcr)

Композиции и способы, связанные с растворимыми сопряженными с g-белком рецепторами (sgpcr)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США номер 60/650866, поданной 8 февраля 2005 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Правительство США обладает правами на настоящее изобретения в соответствии с грантом номер DK 26741 от NIDDK.

I. ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится, главным образом, к способу и композициям, связанным с молекулярной биологией, неврологией и эндокринологией. в определенных аспектах оно относится к композициям, содержащим растворимые сопряженные с G-белком рецепторы (sGPCR) и к способам их применения в качестве модуляторов активности GPCR и/или модуляторов фармакологических эффектов лигандов, которые связывают такие растворимые GPCR.

II. ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Рецепторы, как правило, представляют собой молекулярные структуры, расположенные в клеточной мембране или внутри клетки, которые образуют слабую обратимую связь с веществом, таким как антиген, гормон или нейротрансмиттер. Каждый рецептор предназначен для связывания с конкретным веществом(ами). Конкретное семейство рецепторов представляет собой рецептор с семью трансмембранными участками ("7TM") или сопряженный с G-белком рецептор ("GPCR"). Эти рецепторы связаны со связывающим гуаниновые нуклеотиды G-белком ("G-белок") для передачи сигнала при связывании соответствующего вещества с рецептором. Когда G-белок связан гуаниндифосфатом ("GDP"), то G-белок является неактивным, или "выключенным". Аналогично, если G-белок связан с гуанинтрифосфатом ("GTP"), то G-белок является активным, или "включенным", опосредуя тем самым активацию биологического ответа в клетке.

GPCR обладают общим структурным мотивом. Все эти рецепторы имеют семь последовательностей из от 22 до 24 гидрофобных аминокислот, которые формируют семь альфа-спиралей, каждая из которых пронизывает мембрану (т.е. трансмембранный участок-1 (TM-1), трансмембранный участок-2 (TM-2), и т.д.). Трансмембранные спирали соединены аминокислотными цепями между трансмембранным участком-2 и трансмембранным участком-3, трансмембранным участком-4 и трансмембранным участком-5, и трансмембранным участком-6 и трансмембранным участком-7 на наружной, или на "внеклеточной", стороне клеточной мембраны (их называют "внеклеточными петлями" или "внеклеточными" участками). Трансмембранные спирали также соединены аминокислотными цепями между трансмембранным участком-1 и трансмембранным участком-2, трансмембранным участком-3 и трансмембранным участком-4, и трансмембранным участком-5 и трансмембранным участком-6 на внутренней, или "внутриклеточной", стороне клеточной мембраны (их называют "внутриклеточными петлями" или "внутриклеточными" участками). "Карбокси" ("C") конец рецептора расположен во внутриклеточном пространстве в клетке, и "амино" ("N") конец рецептора расположен во внеклеточном пространстве снаружи клетки.

Как правило, когда лиганд связывается с рецептором и "активирует" рецептор, происходит изменение конформации внутриклеточного участка, которое делает возможным связывание между внутриклеточным участком и внутриклеточным "G-белком". Было описано, что GPCR являются "неразборчивыми" в отношении G-белов, т.е., что GPCR может взаимодействовать более чем с одним G-белком (Kenakin, 1988). Несмотря на то, что существуют другие G-белки, к настоящему времени выявлены G-белки Gq, Gs, Gi и Go. Активированные лигандом GPCR, связанные с G-белком, начинают каскадный процесс передачи сигнала или трансдукцию сигнала. При нормальных условиях трансдукция сигнала в конечном итоге приводит к активации клетки или к ингибированию клетки. Полагают, что с G-белком взаимодействует третья внутриклеточная петля (IC-3), а также C-конец рецептора.

Как правило, активность практически каждой клетки в организме регулируется посредством внеклеточных сигналов. В ряде физиологических процессов у человека, а также в широким диапазоне организмов, используется опосредуемая белком трансмембранная передача сигналов через GPCR. Сигналы от конкретного GPCR приводят к активации G-белка в клетке. Большинство сигналов посредством GPCR передается внутрь клетки. Существует множество различных аспектов процесса передачи сигнала, в который вовлечены разнообразные подтипы рецепторов GPCR и связанные с ними соответствующие G-белки, а также множество связанных с ними внутриклеточных вторичных посредников. Трансдукция сигнала может приводить к общей или частичной активации или инактивации внутриклеточного процесса или процессов, в зависимости от вовлеченных в нее белков. Существенные молекулы для передачи сигнала или нейтротрансмиттеры, которые связываются с GPCR, включают в себя, но не ограничиваются ими кортикотропин-рилизинг фактор, паратиреоидный гормон, морфин, допамин, гистамин, 5-гидрокситриптамин, аденозин, кальцитонин, гастроингибиторный пептид (GIP), глюкагон, рилизинг-фактор гормона роста (GHRH),

паратиреоидный гормон (PTH), PACAP, секретин, вазоактивный интестинальный полипептид (VIP), диуретический гормон, EMR1, латрофилин, специфичный для головного мозга ингибитор ангиогенеза (BAI), кадгерин, EGF, LAG, (CELSR) и другие подобные белки или молекулы.

GPCR формируют суперсемейство белков. В настоящее время существует свыше 2000 описанных в литературе GPCR, которые подразделяются по меньшей мере на три семейства: подобное родопсину семейство (семейство A), рецепторы для кальцитонина (семейство B) и метаботропное семейство для глутамата (семейство C) (Ji et al, 1998). Описанные GPCR включают в себя как охарактеризованные рецепторы, так и одиночные рецепторы, для которых лиганды еще не выявлены. (Wilson et al, 1999; Wilson et al, 1998; Marchese et al, 1999). Несмотря на большое количество GPCR, все GPCR, как правило, обладают сходной молекулярной структурой. Каждый GPCR содержит цепь из аминокислотных остатков различной длины. GPCR расположены в клеточной мембране в виде семи отдельных спиралей, называемых трансмембранными участками. N-конец GPCR расположен снаружи клетки с внеклеточными петлями, в то время как C-конец расположен внутри клетки с внутриклеточными петлями.

Лиганды для GPCR включают в себя низкомолекулярные молекулы, а также пептиды и небольшие белки. Взаимодействие между этими лигандами и их рецепторами варьирует от системы к системе, однако для него может быть необходимым взаимодействие с остатками в нескольких из четырех внеклеточных доменов и на N-конце. В некоторых случаях N-конец один может сохранять способность к взаимодействию и связыванию с лигандами. GPCR и известные лиганды ассоциированы со множеством заболеваний, в том числе с рассеянным склерозом, диабетом, ревматоидным артритом, астмой, аллергией, воспалительным заболеванием кишечника, некоторыми злокачественными опухолями, нарушениями щитовидной железы, заболеванием сердца, пигментным ретинитом, ожирением, неврологическими нарушениями, остеопорозом, инфекцией вирусом иммунодефицита человека ("HIV") и синдромом приобретенного иммунодефицита ("СПИД") (Murphy et al, 2000; Mannstadt et al, 1999; Berger et al, 1999; Jacobson et al, 1997; Meij, 1996).

Таким образом, в данной области существует необходимость в способах продукции модуляторов GPCR и лигандов, которые связывают GPCR для применения в качестве лекарственных средств. Эти лекарственные средства можно использовать для профилактики или лечения ассоциированных с GPCR заболеваний и/или нарушений.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам, связанным со связывающими лиганд доменами sGPCR, а также с эффектами sGPCR на передачу сигнала GPCR и на взаимодействие между лигандами GPCR и их GPCR.

Вариант осуществления этого изобретения включает в себя выделенный связывающий лиганд домен растворимого сопряженного с G-белком рецептора (sGPCR). sGPCR содержит весь внеклеточный домен GPCR или его часть. В одном аспекте этого изобретения sGPCR представляет собой растворимую форму члена семейства B GPCR. В следующем аспекте sGPCR представляет собой член подсемейства B1 GPCR. В следующих аспектах sGPCR представляет собой растворимый рецептор для секретина, рецептор для VPAC1, рецептор для VPAC2, рецептор для PAC1, рецептор для глюкагона, рецептор для рилизинг-фактора гормона роста (GHRH), рецептор для глюкагон-подобного пептида 1 (GLP-1), рецептор для глюкагон-подобного пептида 2 (GLP-2), рецептор для гастроингибиторного пептида (GIP), рецептор для кортикотропин-рилизинг фактора 1 (CRF1), рецептор для кортикотропин-рилизинг фактора 2 (CRF2), рецептор для паратиреоидного гормона 1 (PTH1), рецептор для паратиреоидного гормона 2 (PTH2), подобный рецептору для кальцитонина рецептор или рецептор для кальцитонина. sGPCR может представлять собой растворимый рецептор для PTH1 или рецептор для PTH2. Вариант осуществления этого изобретения также включает в себя sGPCR, который представляет собой растворимую форму рецептора для кортикотропин-рилизинг фактора типа 2α (sCRFR2α). Аминокислотная последовательность sCRFR2α может содержать аминокислотную последовательность, кодируемую экзонами 3, 4 и 5 гена CRFR2α или она не содержит экзон 6 или выше. Рекомбинантный sGPCR по этому изобретению может включать в себя 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 135, 140, 150, 155, 160, 180, 200 или более аминокислот, включая все диапазоны среди этих значений, внеклеточного домена(ов) GPCR, включая весь N-концевой внеклеточный домен или его часть. В определенных аспектах связывающий лиганд домен sGPCR может содержать аминокислотную последовательность по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, или 98% сходную с 50, 75, 100, 125, 150 или более аминокислотами SEQ ID NO:4 (sCRFR2α), SEQ ID NO:8 (sCRFR2β), SEQ ID NO:12 (sCRFR2γ) или SEQ ID NO:15 (mCRFR2α). В следующем аспекте sCRFR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, 8, 12, 15 или их сочетание. В следующем аспекте изобретение относится к выделенному sGPCR, детектируемую аффинный маркер, метку, поддающуюся определению или терапевтическую химическую группу, метку биотин/авидин, радионуклид, детектируемый или терапевтический фермент, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, домен иммуноглобулина или любое их сочетание. В одном аспекте GPCR содержит домен иммуноглобулина, в частности Fc-домен. sGPCR может быть конъюгирован с полимером, который включает в себя, но не ограничивается этим, полиэтиленгликоль (PEG).

Варианты осуществления этого изобретения включают в себя полинуклеотиды, кодирующие sGPCR по этому изобретению. Полинуклеотид может дополнительно содержать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим sGPCR. Кодирующая sGPCR последовательность может быть встроена в экспрессирующую кассету. Экспрессирующая кассета может находится в экспрессирующем векторе. Экспрессирующий вектор может включать в себя, но не ограничивается ими, линейную нуклеиновую кислоту, плазмидный экспрессирующий вектор или вирусный экспрессирующий вектор. В определенных аспектах экспрессирующий вектор находится в векторе для доставки, который может включать в себя, но не ограничиваться ими, липосому, полипептид, поликатион, липид, бактерию или вирус.

Следующие варианты осуществления этого изобретения включают в себя способы модулирования активности сопряженного с G-белком рецептора (GPCR), включающие в себя: a) контактирование ткани-мишени с sGPCR; и b) связывание лиганда GPCR вблизи ткани-мишени, где в ткани модулируется активность GPCR. Лиганд может представлять собой лиганд семейства B GPCR, лиганд подсемейства B1 GPCR. В определенных аспектах лиганд представляет собой кортикотропин-рилизинг фактор (CRF), урокортин 1, урокортин 2, урокортин 3, стресскопин, паратиреоидный гормон, PTH-подобный гормон, TIP39, кальцитонин, амилин, CGRP (CALCA и CALCB),

адреномедуллин, секретин, VIP, PACAP, глюкагон, GHRH, GLP-1, GLP-2, GIP или любое их сочетание.

Способы также могут включать в себя контактирование с тканью-мишенью, включающее в себя стадии: a) получения связывающего лиганд домена sGPCR в виде соответствующего фармацевтического раствора; и b) введения фармацевтического раствора животному, человеку, субъекту и/или пациенту в количестве, необходимом для влияния на связывание лиганда-мишени в ткани-мишени животного. Введение может представлять собой, но не ограничиваться этим, пероральное введение, инъекцию, эндоскопическое введение или перфузию. Инъекция включает в себя, но не ограничивается этим, внутривенную, внутримышечную, подкожную, внутрикожную, внутричерепную или внутрибрюшинную инъекцию. Нарушения, которые можно лечить, ослаблять, модулировать, тяжесть которых можно снижать, включают в себя нарушения, возникающие вследствие гиперактивации GPCR или гиперсекреции лиганда GPCR. В определенных аспектах нарушение представляет собой чувствительность к инсулину или диабет II типа. Нарушение также может включать в себя связанное с тревогой нарушение; нарушение настроения; нарушение, связанное с посттравматическим стрессом; надъядерный паралич; подавление иммунной системы; симптомы отмены лекарственного средства или алкоголя; воспалительные нарушения; боль; астму; псориаз и аллергию; фобии; нарушения сна, вызванные стрессом; фибромиалгию; дистемию; биполярные нарушения; циклотимию; синдром усталости; индуцированную стрессом головную боль; злокачественную опухоль; инфекции вирусом иммунодефицита человека; нейродегенеративные заболевания; желудочно-кишечные заболевания; нарушения питания; геморрагический стресс; индуцированные стрессом психотические эпизоды; эутиреоидный синдром тошноты; синдром неадекватной продукции антидиарейного гормона; ожирение; бесплодие; травмы головы; травму спинного мозга; ишемическое нейрональное повреждение; эксайтоксическое нейрональное повреждение; эпилепсию; сердечно-сосудистые и связанные с сердцем нарушения; дисфункции иммунной системы; мышечные спазмы; недержание мочи; сенильную деменцию по типу болезни Альцгеймера; мультиинфарктную деменцию; боковой амиотрофический склероз; зависимость и привыкание к химическим веществам; психосоциальную карликовость, гиперчувствительность или гипочувствительность к инсулину, гипогликемию, нарушения кожи; или потерю волос. В определенных аспектах нарушение представляет собой связанное с тревогой нарушение; нарушение настроения; биполярное нарушение; нарушение, связанное с посттравматическим стрессом; воспалительное нарушение; зависимость и привыкание к химическим веществам; желудочно-кишечное нарушение; или нарушение кожи. В следующем аспекте связанное с тревогой нарушение представляет собой генерализованную тревогу, или нарушение настроения представляет собой депрессию. В следующем аспекте желудочно-кишечное нарушение представляет собой синдром раздраженного кишечника.

Другие варианты осуществления этого изобретения включают в себя способы выявления лиганда GPCR, включающие в себя: a) контактирование образца, предположительно содержащего лиганд GPCR, с полипептидом sGPCR; и b) оценку наличия или отсутствия связанного с полипептидом sGPCR лиганда. Способы могут дополнительно включать в себя охарактеризовывание связанного лиганда. Охарактеризовывание связанного лиганда включает в себя, но не ограничивается этим, различные способы хроматографии, масс-спектрометрию, секвенирование пептидов и т.п. Полипептид sGPCR может быть функционально связанным с субстратом или поверхностью или может быть не связанным с ними. Способ может дополнительно включать в себя: c) введение радиоактивномеченного лиганда GPCR; и d) оценку связывания или конкуренции за связывание радиоактивномеченного лиганда GPCR с GPCR. Лиганд GPCR может включать в себя, но не ограничиваться ими, кортикотропин-рилизинг фактор (CRF), урокортин 1, урокортин 2, урокортин 3, паратиреоидный гормон, PTH-подобный гормон, TIP39, кальцитонин, амилин, CGRP (CALCA и CALCB), адреномедуллин, секретин, VIP, PACAP, глюкагон, GHRH, GLP-1, GLP-2 или GIP.

Другие варианты осуществления включают в себя способы выявления sGPCR, включающие в себя: a) контактирование образца, предположительно содержащего sGPCR с лигандом, который связывает sGPCR или относящийся к нему связанный с поверхностью GPCR; и b) оценку связывания лиганда GPCR с компонентами образца. Кроме того, способ может включать в себя охарактеризовывание связанного sGPCR, которое может включать в себя хроматографию, масс-спектрометрию, фрагментацию и секвенирование белка и т.п. Лиганд GPCR может быть функционально связан с субстратом или с поверхностью. Кроме того, способы могут включать в себя: c) введение радиоактивномеченного sGPCR; и d) оценку связывания или конкуренции за связывание радиоактивномеченного sGPCR с лигандом GPCR в присутствии или в отсутствии подвергаемого тестированию образца. Иллюстративные лиганды включают в себя кортикотропин-рилизинг фактор (CRF), урокортин 1, урокортин 2, урокортин 3, паратиреоидный гормон, PTH-подобный гормон, TIP39, кальцитонин, амилин, CGRP (CALCA и CALCB), адреномедуллин, секретин, VIP, PACAP, глюкагон, GHRH, GLP-1, GLP-2, GIP или другие известные лиганды GPCR.

Другой вариант осуществления этого изобретения включает в себя антитела, которые специфично связывают sGPCR. В определенных аспектах антитело может связывать N-конец или С-конец sGPCR. Аспекты этого изобретения включают в себя антитело, которое связывает C-концевую последовательность из 5, 10, 15, 20 или более аминокислот, которая может происходить из альтернативной рамки считывания нуклеотидной последовательности, которая кодирует трансмембранный участок GPCR (как правило, она представляет собой результат альтернативного сплайсинга, и ее можно конструировать с получением рекомбинантного полинуклеотида по этому изобретению).

Варианты осуществления этого изобретения включают в себя способы выявления экспрессии sGPCR с использованием анализа или оценки либо белка, либо нуклеиновой кислоты, либо и белка, и нуклеиновой кислоты. Аспекты этого изобретения включают в себя способы выявления мРНК sGPCR, включающие в себя: a) получение образца нуклеиновой кислоты для анализа; и b) оценку наличия нуклеиновой кислоты sGPCR, включающей в себя точки сплайсинга, приводящие к sGPCR. Способ может включат в себя оценку наличия конкретных видов мРНК посредством гибридизации нуклеиновых кислот, амплификации нуклеиновых кислот или других способов анализа нуклеиновых кислот. В конкретном аспекте sGPCR представляет собой растворимый GPCR типа B, растворимый GPCR типа B1, растворимый CRFR, sCRFR1, sCRFR2 или sCRFR2α. Полинуклеотид может включать в себя область соединения экзон/экзон, которая включает в себя N-концевые аминокислоты GPCR и не включает в себя экзон, кодирующий участок трансмембранного домена или включает в себя его часть. В конкретном аспекте точка сплайсинга sCRFR2α представляет собой область соединения экзон 5/экзон 7, где в основе обозначения экзона лежит геномное обозначение экзонов CRFR2. Исходя из транскрипта CRFR2a, экзоны были бы обозначены 3 и 5 соответственно (например, см. фиг.1).

"Растворимый" GPCR (sGPCR) означает GPCR, который содержит весь внеклеточный домен рецептора или его часть, но лишен всех или части из одного или нескольких трансмембранных доменов, которые в норме удерживают полноразмерный рецептор в клеточной мембране, и растворимая форма не интегрирована в клеточную мембрану. Таким образом, например, когда такой растворимый рецептор продуцируют рекомбинантным способом в клетке млекопитающего, он может секретироваться из рекомбинантной клетки-хозяина через плазматическую мембрану, а не оставаться на поверхности клетки. Как правило, растворимый рецептор по этому изобретению является растворимым в водном растворе. Однако в определенных условиях рецептор может находиться в форме внутриклеточного тельца, которое является легко растворимым стандартными способами. Такой sGPCR можно получать из сконструированной нуклеиновой кислоты, процессированного белка (например, подвергнутого протеолизу белка), синтезированного белка, или выделенного варианта по сплайсингу. Полинуклеотид, кодирующий такой sGPCR, можно выделять или получать способами инженерии.

Как используют в настоящем описании, термины "выделенный" и "очищенный" используют взаимозаменяемо и они относятся к нуклеиновым кислотам или полипептидам или их биологически активным участкам, в которых по существу или практически отсутствуют компоненты, которые в норме находятся вместе с нуклеиновой кислотой или полипептидом, или взаимодействуют с ними, в их природных окружающих условиях. Таким образом, выделенная или очищенная нуклеиновая кислота или полипептид по существу не содержит других клеточных компонентов или культуральной среды при продукции рекомбинантными способами, или по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ в случае химического синтеза.

"Выделенная" нуклеиновая кислота не содержит последовательностей (предпочтительно кодирующих белок последовательностей), которые в природе фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е., последовательностей, расположенных на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, являющегося источником нуклеиновой кислоты. Например, в различных вариантах осуществления, выделенные нуклеиновые кислоты могут содержать менее чем приблизительно 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0,5 т.п.н. или 0,1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые в природе фланкируют нуклеиновые кислоты в геномной ДНК клетки, являющейся источником нуклеиновой кислоты.

Как используют в настоящем описании, термин "выделенный" или "очищенный", когда его применяют в отношении полипептида по этому изобретению, означает, что выделенный белок по существу не содержит клеточных компонентов, и включает в себя препараты белка, обладающие менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% или менее (от сухой массы) белковых примесей. В случае, когда белок по этому изобретению или его биологически активный участок продуцируют рекомбинантными способами, в культуральной среде предпочтительно представлено менее чем приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (от сухой массы) химических предшественников или химических веществ, не являющихся представляющим интерес белком.

Применение формы единственного числа, при использовании совместно с термином "содержащий" в формуле изобретения и/или описании, может означать "один", но также оно соответствует значению "один или несколько", "по меньшей мере один" и "один или более одного".

Применение термина "или" в формуле изобретения используют для обозначения "и/или", если явным образом не указано, что он относится только к альтернативам, или что альтернативы являются взаимоисключающими, хотя описание предполагает определение, которое относится только к альтернативам и "и/или".

Другие цели, свойства и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего ниже подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и демонстрируют конкретные варианты осуществления этого изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации сущности и объема этого изобретения будут очевидными специалистам в данной области из этого подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Для того чтобы сущность приведенных выше свойств, преимуществ и целей этого изобретения, а также прочее, которые будут понятны, достигались и были понятны в деталях, более конкретные описания и определенные варианты осуществления этого изобретения, кратко обобщенные выше, проиллюстрированы на прилагаемых чертежах. Эти чертежи являются частью описания. Однако следует отметить, что прилагаемые чертежи иллюстрируют определенные варианты осуществления этого изобретения и таким образом их не следует рассматривать как ограничивающие его объем.

Фиг.1A-1B. Представлена иллюстративная последовательность нуклеотидов и транслируемых аминокислот растворимого GPCR, рецептора для CRF типа 2α (sCRFR2α) (фиг.1A). Подчеркнутыми аминокислотами указан уникальный C-конец. Заключенными в прямоугольники остатками указаны предполагаемые участки для N-гликозилирования. Представлено схематическое изображение структуры гена CRFR2 мыши (верхние панели), два известных функциональных транскрипта у мыши, α и β (средние панели) и новый вариант сплайсинга sCRFR2α (нижняя панель) (фиг.1B). Указаны расположения участков начала трансляции (ATG). Указаны экзоны, кодирующие N-концевой внеклеточный домен (ECD), семь трансмембранных доменов (7TM) и C-концевой цитоплазматический домен (CD). 5'- и 3'-UTR указаны посредством заштрихованных прямоугольников. Черными прямоугольниками показаны кодирующие участки, и пустыми прямоугольниками показаны экзоны, расположенные ниже стоп-кодона.

Фиг.2A-2C. Представлена экспрессия мРНК CRFR2α и sCRFR2α в головном мозге и гипофизе мыши. На фиг.2A представлено схематическое изображение и расположение олигонуклеотидных праймеров для амплифицированного фрагмента транскриптов CRFR2α мыши (верхняя панель) и sCRFR2α (нижняя панель). Указано расположение олигонуклеотидных праймеров в третьем и седьмом экзонах, которое приводит к амплификации продуктов из 418 и 309, соответствующих CRFR2α и sCRFR2α, соответственно. Фиг.2B представляет собой иллюстративное изображение электрофоретического анализа полуколичественной RT-PCR для мРНК mCRFR2α и sCRFR2α и мРНК рибосомального белка S16 (верхние панели). Также проводили саузерн-блот гибридизацию амплифицированной кДНК mCRFR2α и sCRFR2α и фрагментов кДНК рибосомального белка S16 (нижние панели). Количественное определение для радиоактивных полос проводили посредством PhosphorImager, и нормализованные значения (относительно экспрессии S16) представлены в качестве относительных единиц денситометрии (фиг.2C).

Фиг.3A-3C. Высокоспецифичную антисыворотку, индуцированную у кроликов с использованием синтетического пептидного фрагмента, кодирующего уникальный C-конец белка sCRFR2α (aa 113-143), использовали для проведения радиоиммунного анализа sCRFR2α, использовали для иммуноблоттинга и для иммуноцитохимии. Фиг.3A представляет собой вестерн-иммуноблот sCRFR2α мыши, выделенного из среды клеток COS-M6, временно трансфицированных конструкцией sCRFR2αFLAG, прореагировавшей с сывороткой против sCRFR2α (113-143) (левая панель) или моноклональными M2 против FLAG (правая панель). Дорожки 1, 2 и 3 соответствуют 0,1, 1,0 и 10 мкл экстракта sCRFR2α-FLAG соответственно.

На фиг.3B проиллюстрировано вытеснение [¹²⁵I]Tyr¹¹³ sCRFR2α (а.к. 113-143) из связывания с антителами против sCRFR2α кролика (а.к. 113-143) посредством синтетического sCRFR2α (а.к. 113-143) и посредством очищенного sCRFR2α (а.к. 113-143)-FLAG, экспрессированного COS-M6. На фиг.3C - иммунофлуоресцентное окрашивание клеток COS-M6, временно трансфицированных конструкцией sCRFR2α мыши, визуализированное посредством сыворотки против sCRFR2α (а.к. 113-143), а затем посредством конъюгированного с Cy3 вторичного антитела (фиг.3C(b)). Препараты контрастно окрашивали DAPI для визуализации как трансфицированных, так и нетрансфицированных клеток (фиг.3C(a)). Для клеток, инкубированных с нормальной сывороткой кролика (NRS) в качестве отрицательного контроля, а затем с конъюгированным с Cy3 вторичным антителом, не было показано какого-либо окрашивания (фиг.3C(c)).

Фиг.4A-4G. Представлено наличие подобной sCRFR2α иммунореактивности (ir) в головном мозге мыши с использованием иммуногистохимии и радиоиммунного анализа (RIA). На фиг.4A-4F представлено окрашивание иммунопероксидазой на sCRFR2α в отдельных участках головного мозга мыши. Основные участки клеточной экспрессии включали в себя основные выходные нейроны обонятельной луковицы (фиг.4A); медиальное ядро септума (фиг.4B); и базолатеральное (BLA), но не центральное (CeA) ядро миндалевидного тела (фиг.4C); кору головного мозга, где окрашенные клетки были расположены, главным образом, в слоях 5 и 2/3 (фиг.4D); и красное ядро (фиг.4E). В каждом из этих участков характер мечения клеток был сходным, хотя не обязательно идентичным, с характером мечения для экспрессии мРНК CRFR1. Иммуномеченые волокна и утолщения были ограничены рядом групп клеток, включая паравентрикулярное ядро гипоталамуса (PVH; фиг.4F). На фиг.4G подобную sCRFR2α иммунореактивность экстрагированной кислотой и частично очищенной ткани, выделенной из головного мозга мыши, измеряли посредством радиоиммунного анализа. Экстракты ткани тестировали при 5-7 уровнях дозы и проводили вытеснение связывания sCRFR2α (а.к. 113-143), меченого [¹²⁵I] Tyr¹¹³, с антителом против sCRFR2α кролика (а.к. 113-143) зависимым от дозы образом.

Фиг.5A-5B. Белок sCRFR2α препятствует индукции передачи сигнала cAMP и MAPK, опосредуемой Ucn 1 или CRF. На фиг.5A представлена активация репортера CRE-люциферазы посредством Ucn 1 или CRF, с предварительной инкубацией с sCRFR2α или без нее, в клетках 293T, временно трансфицированных CRFR2α мыши. Люциферазный репортер, содержащий фрагмент промотора CRE гена EVX1, совместно трансфицировали в клетки 293T посредством экспрессирующих CRFR2α векторов. Активность люциферазы измеряли после обработки (4 ч) 0,0001-100 нМ Ucn 1 или CRF в присутствии 0,1 нМ sCRFR2α или в его отсутствии. Данные нормализовали относительно активности котрансфицированной β-галактозидазы. Иллюстрированный способ для шести повторений одного эксперимента представлен на графике. Фиг.5B. Уравновешенные клетки CATHa обрабатывали Ucn 1 (10 нМ) с sCRFR2α (0,4 или 4 нМ) или без него. Через 5 мин после стимуляции рецепторов лизаты клеток собирали и подвергали иммуноблот-анализу SDS-PAGE с использованием антитела фосфо-ERK1/2-p42,44 и антитела ERK2-p44. Активацию ERK вычисляли посредством нормализации уровней фосфорилированной ERK1/2-p42,44 относительно общего уровня ERK2-p44. Репрезентативный способ для трех повторений одного эксперимента представлен на графике. *, P<0,05 для обработки^.#, P<0,05 Ucn 1, UD = не определено.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пригодные терапевтические подходы для лечения заболеваний, связанных с GPCR, и связанными с ними каскадами передачи сигнала, включают в себя ингибирование или модулирование активации или ингибирования GPCR. Одним подходом является получение низкомолекулярных ингибиторов, разработка и внедрение на рынок которых являются дорогостоящими. Недостатком лечения низкомолекулярными ингибиторами или антагонистами GPCR является риск токсичности, особенно при повторном применении. К тому же, многие GPCR не имеют низкомолекулярных антагонистов рецептора. Является целесообразным получение антагониста GPCR, который является менее дорогостоящим и/или менее токсичным, чем низкомолекулярные ингибиторы. Варианты осуществления этого изобретения относятся к композициям и способам, связанным со связывающими лиганд доменами растворимого GPCR (sGPCR), а также с их эффектами на передачу сигнала GPCR и взаимодействие между лигандами GPCR и их GPCR. sGPCR можно использовать для того, чтобы вызывать антагонизм активации или ингибирования GPCR in vitro и/или in vivo.

I. СОПРЯЖЕННЫЕ С G-БЕЛКОМ РЕЦЕПТОРЫ (GPCR)

GPCR составляют суперсемейство белков, которое разделяется на три семейства: подобное родопсину семейство (семейство A), рецепторы для кальцитонина (семейство B) и метаботропное семейство для глутамата (семейство C) (Ji et al, 1998), каждое из которых можно далее разделить на подсемейства. Описанные GPCR включают в себя как охарактеризованные рецепторы, так и одиночные рецепторы, для которых лиганды еще не выявлены (Wilson et al, 1999; Wilson et al, 1998; Marchese et al, 1999). Несмотря на большое количество GPCR, как правило, все GPCR обладают сходной молекулярной структурой. Все GPCR содержат цепь из аминокислотных остатков различной длины. GPCR расположены в клеточной мембране в виде семи отдельных спиралей, называемых трансмембранными участками. N-конец GPCR расположен снаружи клетки, так же как внеклеточные петли, а C-конец расположен внутри клетки совместно с внутриклеточными петлями.

Семейство A GPCR (подобное родопсину) включает в себя, но не ограничивается ими, рецепторные белки для аминов, пептидов, гормональных белков, родопсина, обонятельные рецепторные белки, рецепторы для простаноидов, нуклеотид-подобные рецепторные белки, каннабиноидные рецепторы, рецепторные белки для активирующего тромбоциты фактора, для гонадотропин-рилизинг гормона, для тиротропин-рилизинг гормона и для стимуляторов секреции, для мелатонина, вирусные, лизосфинголипидные и LPA (EDG) рецепторые белки, рецептор для лейкотриена B4 и другие сходные рецепторные белки.

Семейство B GPCR (подобное секретину) включает в себя, но не ограничивается ими, рецепторы для кальцитонина, кортикотропин-рилизинг фактора (CRF), гастроингибиторного пептида (GIP), глюкагона, рилизинг-фактора гормона роста (GHRH), паратиреоидного гормона (PTH), активирующего аденилатциклазу гипофиза полипептида (PACAP), секретина, вазоактивного интестинального полипептида (VIP), диуретического гормона, EMR1, латрофилина, специфичного для головного мозга ингибитора ангиогенеза (BAI), подобные мафусаиловым белки (MTH), кадгерин/EGF/LAG (CELSR) и другие сходные лиганды. Harmar (2001) описывает три подсемейства в семействе B GPCR, подсемейство B1, B2 и B3.

Подсемейство B1 - Подсемейство B1 включает в себя, но не ограничивается ими, классические рецепторы для гормонов, которые у человека кодируются по меньшей мере 15 генами, по меньшей мере с пятью предполагаемыми членами у Drosophila и тремя у C. elegans. Лиганды для рецепторов в этом семействе представляют собой полипептидные гормоны приблизительно из 27-141 аминокислотных остатков; по меньшей мере девять рецепторов млекопитающих отвечают на лиганды, которые являются структурно сходными друг с другом (глюкагон, глюкагон-подобные пептиды (GLP-1, GLP-2), зависимый от глюкозы инсулинотропный полипептид, секретин, вазоактивный интестинальный пептид (VIP), PACAP и рилизинг-фактор гормона роста (GHRH)). Было показано, что члены этого подсемейства способны регулировать внутриклеточные концентрации cAMP посредством присоединения аденилатциклазы через стимуляторный G-белок (Gs). Некоторые члены подсемейства способны передавать сигнал через дополнительные сопряженные с G-белком каскады передачи сигнала, например посредством активации фосфолипазы C.

Подсемейство B2 - Подсемейство B2 состоит из большого количества GPCR семейства B с длинными внеклеточными N-концами, содержащими различные структурные элементы, связанные с основным мотивом 7TM. Прототипными членами для этого подсемейства были содержащий EGF-элемент подобный муцину рецептор для гормонов (EMR1), выделенный из нейроэктодермальной библиотеки кДНК человека (Baud et al., 1995), и лейкоцитарный антиген клеточной поверхности CD97 (Hamann et al, 1995). Подсемейство B2 также включает в себя независимые от кальция рецепторы для α-латротоксина. Выявлено три гена, кодирующих независимые от кальция рецепторы для латротоксина (CL-1, CL-2 и CL-3). Во-вторых, также в это семейство входят специфичные для головного мозга ингибиторы ангиогенеза 1, 2 и 3 (BAI1, BAI2, BAI3), группа белков, которые вовлечены в васкуляризацию глиобластом. В-третьих, также в подсемейство B2 включены белок, кодируемый геном flamingo у Drosophila и его ортологами у людей (кадгерин EGF LAG семичленные рецепторы G-типа Celsr1, Celsr2 и Celsr3) и у C. elegans (F15B9.7). В заключение, подсемейство включает в себя четвертую, отдельную группу рецепторов, которые содержат некоторые мотивы, являющиеся общими для рецепторов подсемейства B2 однако в остальном структурно не сходны с ними (белок эпидидимиса человека 6 (HE6), связанный с EGF-TM7-латрофилином белок (ETL), содержащий повтор рецептор для иммуноглобулина Ig-hepta, сопряженный с G-белком рецептор 56 (GPR56)

и очень крупный сопряженный с G-белком рецептор 1 (VLGR1)). Анализ секвенирования генома человека (1 апреля 2001 года, UCSC Human Genome Project Working Draft (genome.ucsc.edu)) указывает на то, что существует по меньшей мере 18 генов человека, кодирующих члены подсемейства B2, и по меньшей мере четыре существует у Drosophila и три у C. elegans. Недавно была описана структура и функции членов подсемейства B2, Stacey et al. (2000).

Подсемейство B3 - Прототипом третьей группы (подсемейство B3) GPCR семейства B является "methuselah" (mth), ген, выделенный при скрининге единичных мутаций генов, которые увеличивают среднюю длительность жизни D. melanogaster (Lin et al, 1998). Ген кодирует полипептид, который обладает сходством последовательности с другими GPCR семейства B только в участке TM7. В последовательности генома Drosophila закодировано по меньшей мере восемь паралогов "methuselah".

Характерным признаком всех GPCR семейства B является мотив 7TM, отдаленно сходный с аналогичными участками некоторых других семейств GPCR, однако является значительно более консервативным в семействе B. Консервативные остатки цистеина во внеклеточных петлях EC1 и EC2, вероятно, формируют дисульфидные мостики по аналогии с GPCR семейства A, в которых этот признак также является консервативным (Palczewski et al, 2000). Однако в противоположность GPCR семейства A, в основе многих из которых, по-видимому, лежат внутренние гидрофобные п