Сайт-направленная модификация fviii

Сайт-направленная модификация fviii

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка

Данная заявка имеет преимущество приоритета по заявке №60/627277 на патент США, поданной 12 ноября 2004 г., которая полностью включена здесь посредством ссылки.

Область изобретения

Данное изобретение относится к мутеинам фактора VIII (FVIII), которые обладают возможностью связываться в предварительно заданном сайте с одним или более биосовместимыми полимерами, такими как полиэтиленгликоль. Кроме того, предлагаются основанные на них составы, дозировки и способы их введения в терапевтических целях. Эти модифицированные варианты FVIII и основанные на них композиции и способы пригодны для выбора метода лечения лиц, пораженных гемофилией А, в котором частота введения препарата уменьшена и иммуногенный ответ снижен.

Уровень техники

Гемофилия А является наиболее общим наследственным нарушением свертываемости крови с оценкой встречаемости одно на 5000 мужчин. Она вызывается дефицитом или структурными дефектами FVIII, основном компоненте природного пути свертывания крови. Современное лечение гемофилии А включает внутривенное введение человечьего FVIII. Человечий FVIII производят рекомбинантным методом в виде одноцепочечной молекулы размером приблизительно 300 кДа. Она состоит из структурных доменов А1-А2-В-А3-С1-С2 (Thompson, 2003, Semin. Hematol. 29, pp.11-22). Продукт-предшественник преобразуется в две полипептидные цепочки размерами 200 кДа (тяжелая) и 80 кДа (легкая) в аппарате Гольджи, при этом две цепочки удерживаются вместе посредством ионов металлов (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, p.6352; Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, p.2979).

Домен В мутеина FVIII представляется необязательным, поскольку FVIII с делетированным доменом В (BDD, А1-А2-тяжелая цепь 90 кДа плюс легкая цепь 80 кДа) также проявляет эффективность при заместительной терапии гемофилии А. Последовательность FVIII с делетированным В-доменом содержит делецию всех, кроме 14-ти, аминокислот В-домена.

Пациентов с гемофилией А в настоящее время лечат внутривенным введением FVIII по необходимости или путем профилактической терапии, назначаемой несколько раз в неделю. При профилактическом лечении дается 15-25 ME фактора VIII на 1 кг веса тела три раза в неделю. Это постоянно требуется пациенту. Ввиду короткого времени полувыведения у человека, FVIII должен вводиться часто. Несмотря на крупный размер в более чем 300 кДа протеина полной длины FVIII имеет у людей период полувыведения только около 11 часов (Ewenstein et al., 2004, Semin. Hematol. 41, pp.1-16). Необходимость частого внутривенного введения создает огромные барьеры в соблюдении больными режима и схемы лечения. Для пациентов было бы более удобным, если бы был разработан FVIII-продукт, который имеет более длительный период полувыведения и, следовательно, требует менее частого введения. Кроме того, если бы период полувыведения был увеличен, могла бы быть уменьшена стоимость лечения, поскольку в результате могло бы потребоваться меньшее количество доз.

Дополнительным недостатком существующей терапии является то, что примерно у 25-30% пациентов вырабатываются антитела, которые ингибируют активность FVIII (Saenko et al., 2002, Haemophilia 8, pp.1-11). Главные эпитопы ингибиторных антител локализованы внутри домена А2 на остатках 484-508, домена A3 на остатках 1811-1818 и домена С2. Выработка антител препятствует использованию FVIII при заместительной терапии, вынуждая эту группу пациентов искать еще более дорогое лечение с помощью высокодозировочного рекомбинантного фактора VIII и иммуноустойчивой терапии.

В последующих исследованиях были идентифицированы FVIII-эпитопы ингибиторных антител. При исследовании 25-ти ингибиторных образцов плазмы было обнаружено, что 11 из них связаны с фрагментом А3С1С2, вызванным тромбином и имеющим легкую цепь размером 73 кДа, 4 связаны с доменом А2, а 10 - с обоими фрагментами (Fulcher, С. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 2(22), pp.7728-32). В другом исследовании шесть из восьми ингибиторов домена А2 пациентов были нейтрализованы рекомбинантным А2-полипептидом (Scandella, D. et al., 1993, Blood 82(6), pp.1767-75). Эпитопы для шести из девяти ингибиторов пациентов отмечены на остатках 379-538 домена А2 (Scandella, D. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85(16), pp.6152-6). Эпитоп для 18-ти ингибиторов с тяжелой цепью был определен в той же N-концевой области размером 18,3 кДа домена А2 (Scandella, D. et al., 1989, Blood 74(5), pp.1618-26).

Активная рекомбинантная гибридная молекула человек/свинья мутеина FVIII, полученная замещением остатков 387-604 домена А2 человека гомологичной последовательностью свиньи, проявляла устойчивость к ингибитору А2 пациента (Lubin, I. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(12), pp.8639-41) и устойчивость к мышиному моноклональному антителу mАВ 413 IgG, которое конкурирует с ингибиторами А2 пациента в связывании с А2 (Scandella, D. et al., 1992, Thromb Haemost. 67(6), рр.665-71). В дальнейшем этот эпитоп домена А2 был обнаружен в остатке 484-508 домена А2, когда в результате экспериментов было выявлено, что мАВ 413 IgG и четыре ингибитора пациента не ингибируют гибридный человек/свинья мутеин FVIII, в котором остатки 484-508 домена А2 были замещены соответствующими остатками домена А2 свиньи (Healey, J. et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(24), pp.14505-9). Такой гибридный FVIII также был более устойчивым, по крайней мере, у половины из 23 пациентов, у которых исследовалась плазма (Barrow, R. et al., 2000, Blood 95(2), pp.564-8). При аланин-сканирующем мутагенезе был идентифицирован остаток 487 как основной для связывания со всеми пятью тестированными ингибиторами пациентов, несмотря на то что все остатки 484, 487, 489 и 492 являлись важными для взаимодействия с мАВ 413 IgG (Lubin, I., J. Biol. Chem. 272(48), pp.30191-5). Титры ингибиторных антител у мыши, получавшей мутант R484A/R489A/P492, а не мутант R484A/R489A, были значительно ниже, чем у мыши, получавшей контрольный человеческий BDD FVIII (Parker, E. et al., 2004, Blood 104(3), pp.704-10). Таким образом, область 484-508 домена А2, по-видимому, является сайтом связывания для ингибиторов с активностью FVIII.

Другой проблемой традиционной терапии, помимо иммунного ответа на FVIII, является то, что она требует частого введения дозы из-за короткого периода полувыведения FVIII in vivo. Были исследованы механизмы выведения FVIII из кровотока.

Выведение FVIII из кровотока частично объясняется специфическим связыванием с протеином, родственным рецептору липопротеина низкой плотности (LRP) и печеночному рецептору выведения с широкой лигандной специфичностью (Oldenburg et al., 2004, Haemophilia 10 Suppl 4, pp.133-139). Недавно было также показано, что рецептор липопротеина низкой плотности (LDL) играет некоторую роль в выведении FVIII, например, посредством совместного с LRP действия по регулированию уровней FVIII в плазме (Bovenschen et al., 2005, Blood 106, pp.906-910). Оба взаимодействия облегчаются связыванием с гепарин сульфат протеогликанами (HSPGs) поверхности клеток. Период полувыведения из плазмы у мыши может быть пролонгирован до 3,3 раза, когда блокирован LRP, или в 5,5 раза, когда блокированы как LRP, так и HSPGs поверхности клеток (Sarafanov et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, pp.11970-11979). Предполагается, что HSPGs аккумулируют FVIII на клеточной поверхности и предоставляют его LRP. Сайты связывания LRP на FVIII локализованы на остатках 484-509 А2 (Saenko et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp.37685-37692), остатках 1811-1818 A3 (Bovenschen et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, pp.9370-9377) и эпитопе в домене С2 (Lenting et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp.23734-23739).

Кроме того, FVIII выводится из кровотока под действием протеаз. Чтобы понять этот эффект, нужно понять механизм, посредством которого FVIII вовлечен в свертывание крови. FVIII, связанный с фактором фон Виллебранда (vWF), циркулирует, как гетеродимер, состоящий из тяжелой и легкой цепей. vWF-связывание происходит на остатках 1649-1689 FVIII (Foster et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, pp.5230-5234) и части доменов С1 (Jacquemin et al., 2000, Blood 96, pp.958-965) и С2 (Spiegel, P. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(51), pp.53691-8). FVIII активируется тромбином, который расщепляет пептидные связи после остатков 372, 740 и 1689, производя гетеротример из доменов А1, А2 и А3-С1-С2 (Pittman et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 276, pp.12434-12439). По завершении активации FVIII диссоциирует от vWF и накапливается на поверхности клеток тромбоцитов посредством связывания с фосфолипидом. Фосфолипидное связывание включает остатки 2199, 2200, 2251 и 2252 FVIII (Gilbert et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, pp.6374-6381). Там он связывается с коагуляционным фактором IX (FIX) через взаимодействие с остатками 558-565 (Fay et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, pp.20522-20527) и остатками 1811-1818 FVIII (Lenting et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp.1935-1940) и с коагуляционным фактором Х (FX) через взаимодействие с остатками 349-372 FVIII (Nogami et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, pp.15763-15771) и действует как кофактор для FIX-активации FX, существенного компонента природного пути свертывания крови. Активированный FVIII (F Villa) частично инактивируется протеазой, которая активируется протеином С (АРС) через расщепление FVIII после остатков 336 и 562 (Regan et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp.3982-3987). Однако предполагаемым основным фактором инактивации является диссоциация домена А2 от доменов A1 и А3-С1-С2 (Fay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, pp.8957-8962).

Одним из методов, который, как было продемонстрировано, увеличивает in vivo период полувыведения протеина, является ПЭГ-илирование. ПЭГ-илирование представляет собой ковалентное присоединение длинноцепочечных молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ) к протеину или другой молекуле. ПЭГ может иметь линейную форму или разветвленную форму, чтобы получить различные молекулы с различными свойствами. Помимо увеличения периода полувыведения пептидов или протеинов ПЭГ-илирование используется для уменьшения образования антител, защиты протеина от протеазного расщепления и сохранения материала вне почечного фильтрата (Hams et al., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, pp.539-51). Кроме того, ПЭГ-илирование может также увеличивать общую стабильность и растворимость протеина. Наконец, поддерживаемая концентрация ПЭГ-илированных протеинов в плазме может уменьшать степень побочных эффектов посредством уменьшения провалов в пиковых уровнях лекарственного средства, снимая, таким образом, необходимость введения сверхфизиологических уровней протеина на ранних временных отрезках.

С различной степенью успеха опробовались случайные модификации FVIII, полученные путем направленного воздействия первичных аминов (N-концевой и лизины) крупными полимерами, такими как ПЭГ и декстран (WO 94/15625, патент US 4970300, патент US 6048720). Наиболее яркое улучшение, опубликованное в патентной заявке в 1994 г. (WO 94/15625), показало 4-кратное увеличение периода полувыведения, однако за счет 2-кратной потери активности после реакции FVIII полной длины с 50-кратным избытком ПЭГ. В WO 2004/075923 раскрываются конъюгаты FVIII и полиэтиленгликоля, которые образуются через случайные модификации. В прошлом случайно ПЭГ-илированные протеины, такие как интерферон-альфа (Kozlowski et al., 2001, BioDrugs 15, pp.419-429), одобрялись в качестве терапевтических средств.

Однако этот подход, основанный на случайных модификациях, является более проблематичным относительно гетеродимерного FVIII. FVIII имеет сотни потенциальных сайтов ПЭГ-илирования, включая 158 лизинов, два N-конца и множество гистидинов, серинов, треонинов и тирозинов, каждый из которых потенциально мог бы быть ПЭГ-илированным реагентами, первоначально нацеленными на первичные амины. Например, было показано, что главным позиционным изомером для ПЭГ-илированного интерферона Альфа-2b является гистидин (Wang et al., 2000, Biochemistry 39, pp.10634-10640). Кроме того, результатом гетерогенной обработки полноразмерного FVIII может являться смесь исходного материала, которая в дальнейшем делает ПЭГ-илированные продукты более сложными. Дополнительным недостатком неконтролирования сайта ПЭГ-илирования на FVIII является потенциальное снижение активности, в тех случаях когда ПЭГ должен был присоединиться на или вблизи основных активных сайтов, особенно в тех случаях, когда более чем один ПЭГ или единичный ПЭГ крупного размера конъюгирует с FVIII. Поскольку случайное ПЭГ-илирование постоянно производит большое количество ПЭГ-илированных продуктов, очистка с целью получения именно моноПЭГ-илированных продуктов приведет к коренному снижению выхода этих продуктов. Наконец, огромная гетерогенность профиля продукта будет делать почти невозможным непрерывный синтез и исследование каждой серии. Поскольку товарное производство требует постоянного, хорошо исследованного продукта, гетерогенность продукта является барьером для коммерциализации. Ввиду всех этих причин желателен более определенный метод ПЭГ-илирования FVIII.

В недавнем обзоре (Kochendoerfer, G., Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, доступно он-лайн с 15 окт. 2005, прямой предметный идентификатор doi: 10.1016/j.cbpa.2005.10.007) были обобщенны различные стратегии сайт-направленного ПЭГ-илирования протеинов. Один из подходов включает введение неприродной аминокислоты в протеины посредством химического синтеза или рекомбинантной экспрессии, за которыми следует добавление производного ПЭГ, который будет специфично реагировать с неприродной аминокислотой. Например, неприродная аминокислота может быть такой, которая содержит кетогруппу, которая не встречается в нативных протеинах. Однако химический синтез таких крупных протеинов, как FVIII, невозможен. Современный предел пептидного синтеза составляет около 50 остатков. Для получения больших частей полипептида можно лигировать несколько пептидов, но, чтобы получить хотя бы FVIII с делетированным В-доменом, потребовалось бы более 20 лигирований, в результате чего выход продукта составлял бы менее 1% даже при идеальных условиях реакции. Рекомбинантная экспрессия протеинов с неприродными аминокислотами ограничена, главным образом, экспрессионными системами немлекопитающих. Полагают, что данный подход является проблематичным для крупного и сложного протеина, такого как FVIII, экспрессия которого необходима в системах млекопитающих.

Другой подход к сайт-направленному ПЭГ-илированию протеинов заключается в направленном воздействии амина N-конца основной цепи ПЭГ-альдегидами. При этом процессе требуется низкий рН для достижения специфичности относительно других аминных групп, который, однако, несовместим с узким интервалом почти нейтрального рН, необходимого для стабильности FVIII (Wang et al., 2003, International J. Pharmaceutics 259, pp.1-15). Более того, N-концевое ПЭГ-илирование FVIII может не привести к улучшению периода полувыведения из плазмы, если эта область не участвует в выведении из плазмы. В действительности, N-концевая область легкой цепи FVIII вовлечена в связывание с vWF, протеином-носителем, который является основным для сохранения FVIII при кровообращении. При N-концевой модификации фактора FVIII наиболее важная связь с vWF может быть разрушена или ослаблена. Таким образом, N-концевое ПЭГ-илирование FVIII может оказать противоположный эффект уменьшения периода полувыведения FVIII из плазмы.

WO 90/12874 раскрывает сайт-специфическую модификацию человеческого IL-3, колониестимулирующего фактора гранулоцитов и эритропоэтиновых полипептидов путем введения цистеина или заменой им другой аминокислоты с последующим добавлением лиганда, который содержит сульфгидрильную реактивную группу. Лиганд избирательно присоединяется к цистеиновым остаткам. Модификация FVIII или какого-либо его варианта не раскрывается.

По причинам, сформулированным выше, существует необходимость в улучшенном варианте FVIII, который обладает большей длительностью действия in vivo и пониженной иммуногенностью, сохраняя, в то же время, функциональную активность. Кроме того, желательно, чтобы такой протеин производился как гомогенный продукт надежным способом.

Краткая сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является обеспечение конъюгированного с биосовместимым полимером функционального полипептида FVIII, имеющего улучшенные фармакокинетические и терапевтические свойства.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение конъюгированного с биосовместимым полимером протеина FVIII с делетированным В-доменом, имеющего улучшенные фармакокинетические свойства.

Еще одной целью изобретения является обеспечение конъюгированного с биосовместимым полимером функционального полипептида FVIII, имеющего ослабленное связывание с протеином, родственным рецептору липопротеина низкой плотности (LRP), рецептором липопротеина низкой плотности (LDL), гепарин-сульфат протеогликанами (HSPGs) и/или ингибиторными антителами против FVIII.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенного варианта FVIII, который обладает большей длительностью действия in vivo и уменьшенной иммуногенностью и который возможно производить как гомогенный продукт надежным способом.

В одном аспекте изобретения обеспечивается конъюгат, имеющий прокоагулянтную активность фактора FVIII, включающий функциональный полипептид фактора FVIII, ковалентно соединенный на одном или более своих предварительно заданных сайтах с одним или более биосовместимыми полимерами, где предварительно заданный сайт не является N-концевым амином. Изобретение также включает способ получения этого конъюгата, предусматривающий мутирование нуклеотидной последовательности, которая кодирует функциональный полипептид фактора FVIII, с целью замещения в предварительно заданном сайте последовательностью, кодирующей цистеиновый остаток; экспрессию мутированной нуклеотидной последовательности для получения модифицированного цистеином мутеина; очистку мутеина; реагирование мутеина с биосовместимым полимером, который активирован для реагирования с полипептидами по существу только на введенных цистеиновых остатках таким образом, чтобы образовался конъюгат; и очистку конъюгата. Изобретение также направлено на фармацевтические композиции, включающие конъюгат и фармацевтически приемлемый адъювант, и на способы лечения гемофилии путем введения терапевтически эффективных количеств этих фармацевтических композиций млекопитающему, которое нуждается в них.

Изобретение также относится к способу сайт-направленного ПЭГ-илирования мутеина фактора FVIII, включающему (а) экспрессию сайт-направленного мутеина фактора FVIII, где мутеин имеет цистеиновое замещение в аминокислотном остатке на наружной поверхности мутеина фактора FVIII и этот цистеин кэпирован; (b) контактирование цистеинового мутеина с восстановителем при условиях, в которых цистеиновый мутеин мягко восстанавливается и отделяется кэп; (с) удаление кэпа и восстановителя из цистеинового мутеина; и (d) обработку, по крайней мере, спустя около 5 минут после удаления восстановителя, цистеинового мутеина с помощью ПЭГ, содержащего сульфгидрильный связывающий фрагмент при условиях, в которых образуется ПЭГ-илированный мутеин фактора FVIII.

Краткое описание фигур чертежей

Фиг.1. Карты векторов и стратегия мутагенеза для ПЭГ-мутеинов.

Фиг.2. Профиль поглощения УФ при 280 нм относительно времени для ПЭГ-2-протеина, очищенного через хроматографическую колонку с моноклональными антителами к FVIII. Хроматография выполнялась с использованием хроматографической системы АКТА® Explorer 100 от Amersham Bioscience.

Фиг.3. Трехстадийный способ сайт-направленного ПЭГ-илирования. ПЭГ представляет собой цистеин-реактивный ПЭГ, такой как ПЭГ-малеимид. Замкнутые полоски показывают дисульфидные образования, а незамкнутые - восстановленные цистеины.

Фиг.4. Сайт-направленное ПЭГ-илирование ПЭГ2.

Фиг.5. Сайт-направленное ПЭГ-илирование ПЭГ6.

Фиг.6а. Сайт-направленное ПЭГ-илирование BDD, ПЭГ2, 4, 5 и 6. Верхние панели были окрашены антителом к тяжелой (Н) цепи, а нижние панели - антителом к легкой (L) цепи. «U» - необработанный материал, содержащий как Н, так и L.

Фиг.6b. ПЭГ-илирование ПЭГ15 и ПЭГ7 с ПЭГ2 и ПЭГ6 в качестве контроля. Сначала очищенные ПЭГ-мутеины (S) восстанавливали с помощью трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР) и после удаления восстановителя («R») ПЭГ-илировали с помощью ПЭГ 12 кДа («12») или 22 кДа («22»). Образцы наносили на 6%-ный Трис-глицин SDS PAGE и окрашивали антителом к тяжелой цепи (НС) на левой панели или антителом к легкой цепи (LC) на правой панели. «U» - необработанный материал, содержащий как НС, так и LC. ПЭГ-илированные полоски подцвечены точками.

Фиг.6с. ПЭГ-илирование ПЭГ2+6 с ПЭГ2 и ПЭГ6 в качестве контроля. ПЭГ2, ПЭГ6 или ПЭГ2+6 восстанавливали с помощью ТСЕР и после удаления восстановителя («R») ПЭГ-илировали с помощью ПЭГ 5 кДа («5») или 43 кДа («43»), ПЭГ2+6 также ПЭГ-илировали с использованием ПЭГ 12, 22 и 33 кДа. Образцы наносили на 6%-ный Трис-глицин SDS PAGE и окрашивали кумасси для протеинов слева или антителом к тяжелой цепи (Н) или легкой цепи (L). «U» - необработанный материал, содержащий как Н, так и L. ПЭГ-илированные полоски подцвечены точками.

Фиг.6d. ПЭГ-илирование FVIII дикого типа полной длины (KG-2) с ПЭГ2 в качестве контроля. Левый гель окрашивали кумасси для протеинов, а правый гель - йодом для ПЭГ. «BDD U» - необработанный BDD-материал, содержащий как Н, так и L. ПЭГ-илированные полоски подцвечены точками.

Фиг.7. Расщепление тромбином ПЭГ-илированного ПЭГ2. N-концевая половина домена А2 окрашена в голубой цвет, а С-концевая половина - в зеленый, эпитоп антитела R8B12 подцвечен темно-зеленым (правый образец FVIII). ПЭГ2 (дорожка 1) и 22 кДа-ПЭГ-илированный ПЭГ2 (дорожка 2) обрабатывали тромбином (дорожки 3 и 4 соответственно) и затем наносили на 7%-ный Трис-ацетатный гель (Invitrogen) и окрашивали антителом R8B12. Каждая дорожка содержит 50 нг FVIII.

Фиг.8. Расщепление тромбином ПЭГ-илированного FVIII дикого типа полной длины (KG-2). «S» = исходный материал KG-2. «R» = восстановленный KG-2, восстановитель удален. «Р» = «R», ПЭГ-илированный ПЭГ 43 кДа. «Чистый» = «Р», очищенный от избытка ПЭГ. «L» = легкая цепь. ПЭГ-илированные полоски подцвечены точками.

Фиг.9. Окрашивание йодом ПЭГ-илированного ПЭГ2. 22- или 43 кДа-ПЭГ-илированный ПЭГ2 наносили на 6%-ный Трис-глициновый гель и окрашивали антителом R8B12 к FVIII (дорожки 1 и 2) или йодом (дорожки 3 и 4). Два пятна были выровнены в соответствии с их маркерными дорожками молекулярного веса. Дорожки 1 и 2 содержат около 30 нг FVIII, в то время как дорожки 3 и 4 содержат около 2 мкг.

Фиг.10. MALDI-масс-спектрометрический анализ ПЭГ-илированного и неПЭГ-илированного ПЭГ2. MALDI-масс-спектрометрия выполнялась на ПЭГ2 (Фиг.10а) или на 22 кДа-ПЭГ-илированном ПЭГ2 (Фиг.10b). После ПЭГ-илирования пик тяжелой (Н) цепи ПЭГ2 значительно уменьшается и появляется новый пик (Н+ПЭГ) с центром на 111 кДа (ПЭГ 22 кДа + тяжелая цепь 89 кДа). Ожидавшегося пика ПЭГ-илированной легкой (L) цепи с центром на 100 кДа (ПЭГ 22 кДа + легкая цепь 83 кДа) не обнаруживается.

Фиг.11. MALDI-масс-спектрометрия ПЭГ-илированного и неПЭГ-илированного ПЭГ2 после расщепления тромбином.

Фиг.12. MALDI-масс-спектрометрический анализ ПЭГ-илированного ПЭГ6 до и после расщепления тромбином.

Фиг.13. Профиль поглощения УФ на 280 нм ПЭГ-илированного ПЭГ2, очищенного на колонке, используемой при гель-хроматографии.

Фиг.14. Профиль поглощения УФ на 280 нм ПЭГ-илированного и неПЭГ-илированного ПЭГ6, очищенного на катион-обменной колонке.

Фиг.15. Профиль поглощения УФ на 280 нм ПЭГ-илированного и неПЭГ-илированного ПЭГ6, на колонке, используемой в гель-хроматографии.

Фиг.16. Сравнение активности ПЭГ-илированного протеина с активностью неПЭГ-илированного протеина, измеренной хромогенным анализом и коагуляционным анализом. Очищенный FVIII полной длины представлен как KG-2. Полученный процент активности определялся делением величины образца, обработанного ПЭГ после восстановления и удаления восстановителя, на величину образца, обработанного буферным контролем, принимая во внимание результат ПЭГ-илирования.

Фиг.17. Фармакокинетическое (РК) исследование кролика относительно ПЭГ-илированного ПЭГ2 в сравнении с ПЭГ2.

Фиг.18. РК-исследование кролика относительно ПЭГ-илированного ПЭГ2 в сравнении с BDD и ПЭГ2. Р-значения являются сравнениями между ПЭГ-илированным ПЭГ2 и BDD.

Фиг.19. РК-исследование кролика относительно ПЭГ-илированного ПЭГ6 в сравнении с BDD и ПЭГ6.

Фиг.20. РК-исследование кролика относительно ПЭГ-илированного FVIII дикого типа полной длины («fl») в сравнении с немодифицированнным FVIII fl.

Фиг.21. РК-исследование гемофильной мыши относительно ПЭГ-илированного ПЭГ6 в сравнении с BDD и ПЭГ6.

Фиг.22. РК-исследование нормальной мыши относительно 22- и 43 кДа-ПЭГ-илированного ПЭГ2 в сравнении с BDD.

Фиг.23. РК-исследование 22 нормальной мыши относительно ПЭГ-илированного ПЭГ2 размером 22 кДа в сравнении с BDD в течение всего времени.

Фиг.24. Гистограмма сбора Гемофильного Мышиного (BDD) Фактора VIII, показывающая фармакокинетическую оценку периода полувыведения BDD-Фактора VIII у двух видов в анализе гемофильной мыши.

Фиг.25. Исследование разрыва почки гемофильной мыши относительно ПЭГ-илированного ПЭГ2 размером 22 кДа в сравнении с BDD. В результате обработки носителем мыши имели потерю крови 25 мкл/грамм веса тела.

Фиг.26. Хромогенная активность ПЭГ-илированного ПЭГ2 и BDD в присутствии увеличивающихся количеств антител к FVIII. Эпитоп антитела указан в скобках.

Фиг.27. Хромогенная активность ПЭГ-илированного ПЭГ2 в присутствии увеличивающихся количеств антител mAB 413 к FVIII.

Фиг.28. Хромогенная активность BDD, 43 кДа-ПЭГ-илированного ПЭГ2, 33 кДа-ПЭГ-илированного ПЭГ6 и 33 кДа-диПЭГ-илированного ПЭГ2+6 в присутствии плазмы человека, происходящей от пациентов, у которых выработались ингибиторы к FVIII. Ингибиторный титр и данные о собранной крови отмечены сверху. Две верхние панели включают данные плазмы, собранной у пациентов, разведенной в 5-405 раз. Нижняя левая панель отображает разведение 1:15 для пациентов с плазмой HRF-828. Нижняя правая панель подтверждает, что 0,064 МЕ/мл, использованные для каждого образца FVIII на двух верхних панелях, не являются дозой насыщения.

Фиг.29. Метод скрининга и подтверждение ПЭГ-илирования. Верхняя панель показывает схематический скрининг ПЭГ-илирования транзиентно экспрессируемых ПЭГ-мутеинов. Нижняя панель показывает Вестерн-анализ ПЭГ-илированных продуктов с использованием специфичного антитела к тяжелой («Н») цепи (слева) или специфичного антитела к легкой («L») цепи (справа). ПЭГ-илированные полосы подцвечены точками. «U» - необработанный материал, содержащий как Н, так и L.

Фиг.30. Скрининг ПЭГ-илирования ПЭГ15-17. Вестерн-анализ ПЭГ-илированных продуктов с использованием специфичных антител к тяжелой («Н») цепи (R8B12 и 58.12) или специфичных антител к легкой («L») цепи антител (C7F7 и GM). Все три мутеина отобраны по тяжелой цепи, с относительной эффективностью ПЭГ-илирования ПЭГ15~ПЭП6>ПЭГ17. ПЭГ-илированные полосы подцвечены точками. «U» - необработанный материал, содержащий как Н, так и L.

Фиг.31. Гель, показывающий ПЭГ-илирование ПЭГ2+14 как функцию концентрации восстановителя. ПЭГ2+14 обрабатывали 67-670 мкМ ТСЕР в течение 30 мин при 4°С. Восстановитель удаляли вращающейся колонкой, после чего следовало ПЭГ-илирование с помощью ПЭГ 12 кДа. Тяжелая и легкая цепи FVIII подцвечены «Н» и «L» соответственно. Две точки указывают на тяжелую и легкую ПЭГ-илированные цепи.

Фиг.32. Развернутые масс-спектры ПЭГ2+14, обработанного 67-670 мкМ ТСЕР с удаленным затем восстановителем.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано на открытии, что полипептиды, имеющие активность FVIII, могут быть ковалентно соединены на предварительно заданном сайте, который не является N-концевым амином, с биосовместимым полимером и что такие полипептиды в значительной мере сохраняют свою коагуляционную активность. Кроме того, эти полипептидные конъюгаты имеют улучшенное время циркуляции в крови и пониженную антигенность. Конъюгаты согласно изобретению обладают преимуществом над конъюгатами, известными из уровня техники, которые имеют случайные присоединения полимера к FVIII или имеют присоединения к N-концу. Сайт-направленное присоединение позволяет конструировать модификации, которые не затрагивают области, необходимые для биологической активности и, тем самым, существенно сохраняют активность FVIII. Оно также позволяет осуществить присоединение полимеров к блоку связывания на сайтах, вовлеченных в выведение FVIII. Сайт-направленное присоединение также позволяет получить более однородный продукт, нежели гетерогенные конъюгаты, получаемые в уровне техники путем случайного присоединения полимеров. За счет того что присоединение к N-концевому амину не осуществляется, конъюгаты согласно настоящему изобретению не теряют активности при присоединении лиганда на активном сайте полипептида FVIII. Предполагается, что N-концевая область легкой цепи участвует в связывании фактора vWF с FVIII, которое является стабилизирующим связыванием в кровотоке.

Определения

Биосовместимый полимер. Биосовместимый полимер включает полиалкилен оксиды, в частности, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), декстраны, коломиниковые кислоты или другие полимеры, основанные на углеводородах, полимеры аминокислот, производные биотина, поливиниловый спирт (PVA), поликарбоксилаты, поливинилпирролидон, сополимер этилена с ангидридом малеиновой кислоты, сополимер стирола с ангидридом малеиновой кислоты, полиоксазолин, полиакрилатморфолин, гепарин, альбумин, целлюлозы, гидролизаты хитозана, крахмалы, такие как гидроксиэтил-крахмалы и гидроксипропил-крахмалы, гликоген, агарозы и их производные, гуаровая камедь, пуллулан, инулин, ксантановая камедь, каррагенан, пектин, гидролизаты альгиновой кислоты, другие биополимеры и любые их эквиваленты. Предпочтительным является полиэтиленгликоль, и еще более предпочтительным является метоксиполиэтиленгликоль (mPEG). Другими полезными полиалкиленгликолевыми соединениями являются полипропиленгликоли (PPG), полибутиленгликоли (PBG), ПЭГ-глицидил эфиры (EpoxPEG), ПЭГ-оксикарбонилимидазол (CDI-PEG), разветвленные полиэтиленгликоли, линейные полиэтиленгликоли, вильчатые полиэтиленгликоли и многолучевые или «сверхразветвленные» полиэтиленгликоли (star-PEG).

Полиэтиленгликоль (ПЭГ). «ПЭГ» и «полиэтиленгликоль» используются здесь взаимозаменяемо и включают любой водорастворимый поли(этиленоксид). В типичном случае, ПЭГи для использования в соответствии с изобретением включают следующие структуры: «--(OCH₂CH₂)_n--», где (n) - от 2 до 4000. Используемый здесь ПЭГ также включает «--CH₂CH₂-O(СН₂СН₂О)_n--СН₂СН₂--» и «--(ОСН₂СН₂)_nO--», в зависимости от того, замещены или не замещены терминальные кислороды. По всему описанию и пунктам притязаний следует помнить, что термин «ПЭГ» включает структуры, имеющие различные терминальные и «концевые кэпирующие» группы, такие, без ограничения, как гидроксильная или C_1-20-алкокси группа. Термин «ПЭГ» также означает полимер, который содержит большинство, то есть более 50%, повторяющихся субъединиц --OCH₂CH₂--. Что касается специфических форм, ПЭГ может иметь любое число разновидностей молекулярных весов, а также структур или геометрий, таких как разветвленная, линейная, вильчатая и многофункциональная.

ПЭГ-илирование. ПЭГ-илирование - это процесс, посредством которого полиэтиленгликоль (ПЭГ) ковалентно присоединяется к молекуле, такой как протеин.

Активированная или активная функциональная группа. Когда функциональная группа, такая как биосовместимый полимер, обозначается как активированная, функциональная группа легко реагирует с электрофилом или нуклеофилом на другой молекуле.

FVIII с делетированным В-доменом (BDD). Термин BDD, используемый здесь, характеризуется наличием аминокислотной последовательности, в которой имеется делеция всех, кроме 14-ти, аминокислот В-домена FVIII. Первые 4 аминокислоты В-домена ((SFSQ, SEQ ID NO:1) связаны с 10 последними остатками В-домена (NPPVLKRHQR, SEQ ID NO:2). (Lind, P. et al., 1995, Eur. J. Biochem. 232, pp.19-27). Используемый здесь BDD имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

FVIII. Фактор VIII (FVIII) свертывания крови представляет собой гликопротеин, синтезируемый и выделяемый в кровоток печенью. При циркуляции крови он связывается с фактором фон Виллебранда (vWF, также известным как родственный Фактору VIII антиген) с образованием устойчивого комплекса. После активации тромбином он диссоциирует от комплекса и взаимодействует с другими факторами свертывания крови в коагуляционном каскаде, который в итоге ведет к образованию тромбов. Человечий FVIII полной длины имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, хотя возможны аллельные варианты.

Функциональный полипептид фактора VIII. Термин «функциональный полипептид фактора VIII», используемый здесь, означает функциональный полипептид или комбинацию полипептидов, которая способна, in vivo или in vitro, корректировать недостаточность фактора VIII у человека, характеризующуюся, например, гемофилией А. В натуральном состоянии фактор VIII имеет многочисленные деградационные и процессированные формы. Как показано здесь, они происходят протеолитически из предшественника, одноцепочечного протеина. Такой одноцепочечный протеин и также различные деградационные продукты, которые имеют биологическую активность коррекции недостаточности фактора VIII у человека, будут являться функциональным полипептидом фактора VIII. Вероятно, существуют аллельные варианты. Функциональными полипептидами фактора VIII будут являться все такие аллельные вариации, гликозилированные варианты, модификации и фрагменты, приводящие к производным фактора VIII в той мере, насколько они содержат функциональный сегмент человечьего фактора VIII, и особая, характерная для человечьего фактора VIII функциональная активность остается по существу не затронутой. Эти производные фактора VIII, обладающие требуемой функциональной активностью, могут быть легко идентифицированы описанными здесь простыми in vitro-тестами. Кроме того, функциональный полипептид фактора VIII способен катализировать конверсию фактора Х в Ха в присутствии фактора IXa, кальция и фосфолипида, а также корректировать коагуляционный дефект в плазме, происходящей от пораженных гемофилией А индивидуумов. Раскрытая здесь последовательность человечьего фактора VIII, аминокислотные последовательности и их функциональные области делают очевидными для специалистов в данной области техники фрагменты, которые могут быть выделены посредством разрезания рестрикционными ферментами ДНК или протеолитической или иной деградации протеина человечьего фактора VIII.

Термин «FIX», используемый здесь, означает Коагуляционный Фактор IX, который также известен как Человечий Фактор ГХ Свертывания Крови или Тромбопластиновый Компонент Плазмы.

Теримн «FX», используемый здесь, означает Коагуляционный Фактор X, который также известен под названием Человечий Фактор Х Свертывания Крови и под эпонимом фактор Стюарта-Прауера.

Фармакокинетика. «Фармакокинетика» («РК») - это термин используется для описания свойств поглощения, распределения, метаболизма и элиминирования лекарственного средства в теле. Улучшение фармакокинетики лекарственного средства означает улучшение тех его характеристик, которые делают лекарственное средство более эффективным in vivo в качестве терапевтического агента, особенно продолжительности его полезного действия в теле.

Мутеин. Мутеин представляет собой полученный посредством генетической инженерии протеин, возникающий как результат мутации протеина или полипептида, индуцируемой в лаборатории.

Термины «протеин» и «полипептид», используемые здесь, являются синонимами.

Термин «рецептор выведения FVIII», используемый здесь, означает рецепторную область на функциональном полипептиде FVIII, которая связывается или соединяется с одной или более другими молекулами, что приводит к выведению FVIII из кровотока. Рецепторы выведения фактора VIII включают, в частности, области молекулы FVIII, которые связываются с LRP, LDL-рецептором и/или HSPG.

Обсуждение

Представляется, что любой функциональный полипептид фактора FVIII может быть мутирован в предварительно заданном сайте и затем ковалентно соединен в этом сайте с биосовместимым полимером в соответствии со способами согласно изобретению. Пригодные полипептиды являются, в частности, полноразмерным фактором FVIII с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:4, и BDD FVIII, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:3. BDD FVIII является предпочтительным.

Биосовместимый полимер, используемый в конъюгатах согласно изобретению, может представлять собой любой из полимеров, упомянутых выше. Биосовместимый полимер выбирается для того, чтобы достичь желаемого улучшения в фармакокинетике. Например, идентичность, размер и структура полимера выбирается такой, чтобы увеличить период полувыведения полипептида, имеющего активность FVIII, из кровотока или чтобы уменьшить антигенность полипептида без нежелательного снижения его активности. Предпочтительно, полимер включает ПЭГ и еще более предпочтительно имеет, по крайней мере, 50% молекулярного веса ПЭГ. В одном варианте выполнении полимер представляет собой полиэтиленгликоль, терминально кэпированный концевым кэпирующим фрагментом, таким как